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≈责任编辑 古云侠 
蒺藜皂苷对人肝癌细胞 …∞2zwsu
生长抑制和诱导凋亡作用的研究
孙 斌 o瞿伟菁 3 o张晓玲 o杨煌建 o庄秀园 o章 平
k华东师范大学 生命科学学院 o上海 usssyul
≈摘要  目的 }探讨蒺藜皂苷k≥××l对体外培养的人肝癌细胞 …∞2zwsu的增殖抑制作用及诱导凋亡作用 ∀方法 }
应用 ××与 ≥• …法检测蒺藜皂苷对人肝癌细胞 …∞2zwsu的抑制作用 o采用形态学观察以及流式细胞术kƒ≤ l检测了
≥××诱导人肝癌细胞 …∞2zwsu凋亡的效应 o采用流式细胞术检测 …∞2zwsu细胞 …¦¯2u蛋白表达 ∀结果 }≠ ≥××能够剂
量依赖地抑制人肝癌细胞 …∞2zwsu的增殖 ~ 细胞显现典型的凋亡形态学改变 oƒ≤  出现凋亡峰 ~≈ ≥××能降低 …∞2
zwsu细胞的 …¦¯2u蛋白表达 ∀结论 }≥××在体外能抑制 …∞2zwsu细胞的增殖并能诱导细胞凋亡 o其诱导凋亡作用的途
径之一是下调 …¦¯2u蛋白表达 ∀
≈关键词  蒺藜皂苷 ~肝癌细胞株 ~生长抑制 ~细胞凋亡
≈中图分类号  • u{x qx ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukusswlsz2sy{t2sw
蒺藜为蒺藜科蒺藜属植物 Τριβυλυσ τερρεστρισ qo
在我国民间有着悠久的药用历史 o蒺藜全草中含有
的甾体皂苷是其主要有效成分 ∀蒺藜皂苷k≥××l具
有抗衰老作用 o并能促进免疫器官的增长≈t  o其单体
可以抑制肿瘤细胞生长≈u  ∀本实验室以往的工作也
证明 ≥×× 对人乳腺癌细胞具有一定的体外抑制效
应≈v  o但关于 ≥×× 对肝癌细胞的生长抑制以及诱导
凋亡方面的研究未见相关报道 ∀本试验以人肝癌细
胞株 …∞2zwsu为对象 o观察了 ≥××对于 …∞2zwsu细
≈收稿日期  ussv2sz2ty
≈通讯作者  3 瞿伟菁 oר¯ }ksutlyuuvust|
胞的抑制及诱导其凋亡的作用 o并初步探讨了 ≥××
促细胞凋亡作用的可能机理 ∀
1 材料与方法
1 q1 材料
1 q1 q1 细胞株及培养 人肝癌细胞株 …∞2zwsu o购
自中科院上海细胞生物研究所细胞库 o培养于含
ts h灭活小牛血清 ot ≅ tsx ˜#pt青霉素 otss °ª#
pt链霉素的 • °ŒtywskŠŒ…≤’l培养基中 ovz ε ox h
≤’u培养箱中培养 ∀
1 q1 q2 试剂与仪器 噻唑蓝k××l购自 ∞• Ž公
司 ~丫啶橙购自 „°µ¨¶¦²公司 ~磺基罗丹明 …k≥• …l !
#t{y#
第 u|卷第 z期
ussw年 z月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯ qu| oŒ¶¶∏¨ z
∏¯¼ oussw
碘化丙啶k°Œl !• ±¤¶¨„ 均购自 ≥¬ª°¤公司 ~鼠抗人
…¦¯2u单抗k s{{zl购自 ⁄„Ž’公司 ~ƒŒ×≤ 标记的羊
抗鼠 ŒªŠ购自鼎国生物公司 ~…¬²p·¨® ¬¨¯ {ss酶联免
疫测定仪 oƒ„≤≥¦¤±流式细胞仪k…q⁄公司l ∀
1 q2 方法
1 q2 q1 ≥××的制备 蒺藜全草采自山东省滕州市 o
由本院植物分类学教研室李宏庆副教授鉴定 o粉碎
后经 v倍体积的石油醚脱脂 u ∗ v次 o再用 x倍体积
的 zs h乙醇提取 v次 o合并 v次的提取液 o浓缩至浓
水液 o以水饱和的正丁醇萃取 w ∗ x次 o旋转蒸发回
收正丁醇 o浓缩液真空干燥后再溶于水配成水液 o过
大孔树脂柱 o先用水洗除去糖类等杂质 o再以 {s h的
乙醇洗脱 o收集乙醇洗脱液 o减压回收乙醇 o真空干
燥后得到皂苷粉末备用≈w  ∀
1 q2 q2 药物处理 将蒺藜皂苷用 tyws培养液配制
成浓度为 tss °ª#pt的母液 os quu Λ°过滤除菌后作
为储备液 o使用前再用培养液稀释到所需浓度 ∀
1 q2 q3 ××试验测定 ≥××对 …∞2zwsu的细胞毒作
用 取处于对数生长期的细胞 o消化后稀释细胞悬
液至 t ≅ tsx 个r°o加入到 |y孔细胞培养板中 o每
孔 tss ˏow孔复孔 o培养 uw «后弃培养液 o加入药
液 uss ˏo浓度分别为 us ows oys o{s otss °ª#pt o对
照组加入等体积的 tyws培养液 o培养 w{ «后 o小心
吸去上清液 o每孔加入以无血清培养液新鲜配制的
x ª#pt ×× ovz ε 温育 w « o弃 ×× o每孔加入 txs
ˏ⁄≥’ o室温下振荡 tx °¬±后 o于酶标仪上 w|s ±°
处测定 Α值 o并计算抑制率 ∀
抑制率k h l € k Α对照 p Α试验lr Α对照 ≅ tss h
1 q2 q4 ≥• …比色法测定 …∞2zwsu细胞的蛋白含量
变化 将细胞接种到 |y孔培养板中 o培养 uw «o分
别以 s oux oxs otss °ª#pt ≥××作用 w{ «后按照文献
≈x 方法进行比色测定并计算抑制率 ∀
1 q2 q5 • µ¬ª«·染色法观察 将处于对数生长期的
细胞以 s qux h 胰蛋白酶消化 o制成浓度为 t ≅ tsx个
r°的细胞悬液 o加入事先放置有无菌圆盖片的 tu
孔培养板中 ouw «后加入 xs °ª#pt ≥×× 处理 o作用
w{ «后取出圆盖片 o自然晾干 o滴加 t °•µ¬ª«·染液
作用 u °¬±o再滴加等量缓冲液 ow °¬±后用水冲洗 o
待自然晾干后镜检并拍照 ∀
1 q2 q6 荧光显微镜观察 将 tsy个经 ≥××处理后的
细胞以 °…≥洗 u次 o再重悬于 xss ˏ°…≥中 o取出 |x
ˏ细胞悬液与 x ˏ丫啶橙ktss °ª#ptl混匀后 o于
荧光显微镜下观察 ∀
1 q2 q7 流式细胞术检测 ⁄‘„含量 流式细胞术检
测采用 ‘¬¦²¯ ·¨¬法≈y  o略加改进 otsy个细胞经不同浓
度 ≥××作用 w{ «后 o用 °…≥洗 u次 ou °预冷 zs h
乙醇 w ε 固定 w{ «后 o离心后以 °…≥洗 t次 o重悬于
°…≥中 o加 • ‘¤¶¨„k无 ⁄‘„酶活性l o使终浓度为 xss
°ª#pt o再加入 t °°Œktss °ª#pt °…≥l o轻轻混
匀 o室温暗处作用 vs °¬±后 o保存于 w ε 暗处 oƒ„≤2
≥¦¤±流式细胞仪检测 o激发光波长为 w{{ ±°∀
1 q2 q8 流式细胞术检测 …¦¯2u蛋白表达≈z  收集药
物处理后的细胞 o°…≥洗 u次 ozx h乙醇固定过夜 o
除去乙醇后 o加入 s qux h ×µ¬·²±÷2tss于冰上处理 x
°¬±o以 °…≥洗 t次 o加入鼠抗人 …¦¯2uktΒtssl ovz ε
孵育 vs °¬±o再加入 ƒŒ×≤标记的羊抗鼠 ŒªŠktΒtsl o
vz ε 孵育 vs °¬±后 o以 °…≥洗 u次后上机检测 ∀
1 q3 统计方法 采用 τ检验 ∀
2 结果与分析
2 q1 ××法实验结果k见表 tl
表 t ≥××对 …∞2zwsu 细胞的细胞毒作用k ξ ? σ, ν € wl
药物浓度
r°ª#pt
Α 抑制率r h
对照组 s qtyv ? s qsut p
tss s qsws ? s qss|ul zx qv
{s s qsxt ? s qsttul zs qy
ys s qsz| ? s qstxul xt qu
ws s qs|t ? s qsvztl wv q{
us s qtws ? s qsu{ tv q{
注 }与对照组相比 otl Π s qsx oul Π s qstk表 u同l
如表 t所示 }≥××对 …∞2zwsu细胞有一定的细
胞毒作用 o除最低浓度组外 o其他各组与对照组比较
都有显著性差异 o且抑制率随着药物浓度的上升而
表现出显著的剂量2效应关系 ∀
2 q2 ≥• …实验结果k见表 ul
表 u ≥×× 对 …∞2zwsu 细胞蛋白含量的影响k ξ ? σ, ν € wl
药物浓度
r°ª#pt
Α 抑制率r h
对照组 s quz| ? s qss| p
tss s qsxv ? s qstyul {t qs
xs s qtyx ? s qsutul ws qz
ux s quwz ? s qstuul tt qw
经各浓度 ≥×× 作用后 o…∞2zwsu细胞的蛋白含
量均显著降低且随剂量增加 o抑制作用增强 o各剂量
组与对照组比较都有显著性差异k Π s qstl o进一步
证明了 ≥××对 …∞2zwsu细胞具有生长抑制作用 ∀
#u{y#
第 u|卷第 z期
ussw年 z月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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∏¯¼ oussw
2 q3 • µ¬ª«·染色法实验结果k见图 tl
图 t • µ¬ª«·染色观察 ≥××对 …∞2zwsu细胞的形态学影响
¤q对照细胞 ~¥q经过 xs °ª#pt≥××作用 w{ «后的细胞
图 t显示 o细胞经 ≥××处理 w{ «后 o显现出典型
的凋亡特征 }细胞缩小 !变圆 o染色质高度浓缩 !细胞
核碎裂 o细胞有/出芽k¥¯ ¥¨¥¬±ªl现象0 o并伴随有凋
亡小体的形成 ∀
2 q4 荧光显微镜观察结果k见图 ul
如图 u所示 o对照组细胞核呈黄绿色均匀荧光 o
而给药组细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色
荧光 o并可见黄绿色碎片 o呈现典型的凋亡形态学改
变 ∀
图 u 丫啶橙染色观察 …∞2zwsu细胞细胞核的变化
¤q对照组细胞 ~¥和 ¦分别为经过 xs和 tss °ª#pt≥××作用 w{ «后的细胞
2 q5 流式细胞术检测 „³k¤³²³·²¶¬¶l峰k见图 vl
由图 v可见 oux oxs otss °ª# pt≥×× 作用 …∞2
zwsu细胞w{«后凋亡细胞分别占细胞总数的
x qz{ h oty qtx h和 w{ qxw h o而对照组细胞凋亡率为
v qty h o结果提示 }≥××诱导 …∞2zwsu细胞凋亡率随
着其浓度的增加而升高 o表现出一定的剂量依赖关
系k Π s qsxl ∀
2 q6 ≥××对 …¦¯2u蛋白表达的影响
经 tss °ª# pt≥××作用 w{ «后 o与对照组相比 o
阳性细胞率从 uz qsy h下降到 w q{u h o这表明 ≥××处
理后 …∞2zwsu细胞的 …¦¯2u蛋白表达明显下降 o提
示 }≥××诱导 …∞2zwsu细胞凋亡与抗凋亡蛋白 …¦¯2u
表达下降相关 ∀
图 v ≥××对 …∞2zwsu细胞凋亡率的影响
3 讨论
肝癌是一种在我国发病率较高的恶性肿瘤 o寻
找针对肝癌化疗药物及辅助化疗药物已成为开发抗
肿瘤药物的热点之一 o而蒺藜皂苷作为传统中药蒺
藜的主要有效成分 o已被证明具有体外抑制多种肿
瘤细胞k黑色素瘤 ≥Ž2∞o口腔上皮癌 Ž…o乳腺癌
…×2xw| o卵巢癌 ≥Ž2’∂2vl生长的作用 ∀而本实验采
用 ≥• …法和 ×× 法观察了 ≥×× 对人肝癌细胞 …∞2
zwsu增殖作用的影响 o结果表明蒺藜皂苷对于体外
培养的人肝癌细胞 …∞2zwsu具有一定的抑制作用 o
且有显著的剂量效应关系 ∀
细胞凋亡与肿瘤的发生 !发展 !恶性转移等密切
相关≈{  o而许多化疗药物可以诱导肿瘤细胞的凋
亡≈|  o同时肿瘤细胞对化疗药物的敏感性和耐药性
亦受细胞凋亡机制的制约≈ts  o诱导凋亡可能是不同
作用机理的化疗药物发挥抗肿瘤作用的共同通路 o
因此药物诱导肿瘤细胞凋亡在肿瘤治疗中日益受到
重视 ∀形态学观察是判断细胞凋亡的基本方法 o核
碎裂 !凋亡小体出现为主要指标 o流式细胞术确定细
胞内总 ⁄‘„ 量变化也是目前被广泛采用的方法 ∀
笔者采用 • µ¬ª«·染色法和丫啶橙染色法研究显示 o
≥××作用 …∞2zwsu细胞 w{ «可见染色质浓缩 !核碎
裂 !凋亡小体等典型的凋亡形态学变化 o进一步采用
#v{y#
第 u|卷第 z期
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯ qu| oŒ¶¶∏¨ z
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流式细胞术进行定量检测发现以 ux oxs otss °ª#pt
≥××作用 …∞2zwsu细胞 o随着浓度的增加 o细胞凋亡
率也随之升高 ∀
…¦¯2u是一种癌基因 o它的高表达可引发肿瘤并
能明显延长细胞生存期 o其表达产物 …¦¯2u蛋白可抑
制多种细胞的凋亡 o笔者的研究发现经 ≥××作用后 o
…∞2zwsu肝癌细胞的 …¦¯2u蛋白表达水平明显下降 o
提示 }≥×× 诱导 …∞2zwsu细胞凋亡的作用与抗凋亡
蛋白 …¦¯2u表达的降低有关 o但这种作用是否与其他
的癌基因和抑癌基因有关 o还须进一步研究探讨 ∀
≈参考文献 
≈t  吴恩融 o马 建 o李长龄 o等 q蒺藜皂苷抗衰老作用的实验研
究 q中国药学杂志 ousss ovxk增刊l }w| q
≈u  …¨ §¬µ∞oŽ«¤± Œ „ o • ¤¯®¨ µ„ q …¬²¯²ª¬¦¤¯ ¼¯ ¤¦·¬√¨¶·¨µ²¬§¤¯ ª¯¼¦²2
¶¬§¨¶©µ²° Τριβυλυστερρεστρισ . Πηαρµαζιε oussu oxzkzl }w|t q
≈v  孙 斌 o瞿伟菁 o柏忠江 q蒺藜皂苷对乳腺癌细胞 …¦¤³2vz的体
外抑制作用 q中药材 oussv ouxkul }tsx q
≈w  金京玲 o任东鲜 o金哲洙 o等 q大孔吸附树脂法提取蒺藜皂甙 q
延边大学医学学报 ot||| ouuktl }u| q
≈x  张均田 q现代药理学实验方法 q北京 }北京医科大学和中国协
和医科大学联合出版社 ot||| q{uu q
≈y  ‘¬¦²¯ ·¨¬Œo ¬ª¯¬²µ¤·¬Šo°¤ª¯¬¤¦¦¬ ≤ o ετ αλq „ µ¤³¬§¤±§¶¬°³¯¨
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≈{  欧阳高亮 o李祺福 o洪水根 q细胞凋亡与肿瘤的发生发展和治
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οφ σαπονινσφροµ Τριβυλυστερρεστρισ ον ηεπατοµα χελλλινε ΒΕΛ2zwsu
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(Λιφε Σχιενχε Σχηοολ, Εαστ Χηινα Νορµαλ Υνιϖερσιτψ, Σηανγηαι usssyu , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ¬±√ ¶¨·¬ª¤·¨·«¨ ¬±«¬¥¬·²µ¼ ¤±§¤³²³·²¶¬¶2¬±§∏¦¬±ª ©¨©¨¦·¶²©¶¤³²±¬±¶©µ²° Τριβυλυστερρεστρισ k≥××l ²± ¬¯√ µ¨
¦¤±¦¨µ¦¨¯¯ ¬¯±¨ …∞2zwsu q Μετηοδ : ×× o≥• …o • µ¬ª«·¶·¤¬±¬±ªo¤¦µ¬§¬±¨ ²µ¤±ª¨ ¶·¤¬±¬±ªo©¯²º ¦¼·²° ·¨µ¼o¤±§Œ°°∏±²©¯∏²µ¨¶¦¨±¦¨ °¬2
¦µ²¶¦²³¼ º µ¨¨ ∏¶¨§·² √¨¤¯∏¤·¨·«¨ ©¨©¨¦·¶²©≥×× ²± …∞2zwsu ¦¨¯¯ ¬¯±¨ q Ρεσυλτ : ≥×× «¤§³²·¨±·¬±«¬¥¬·²µ¼ ©¨©¨¦·²± …∞2zwsu ¦¨¯¯ ¬¯±¨ ¬± ¤
¦²±¦¨±·µ¤·¬²±2§¨ ³¨ ±§¨ ±·°¤±±¨ µq…∞2zwsu ¦¨¯¯¶ ¬¨¬¥¬·¨§·¼³¬¦¤¯ °²µ³«²¯²ª¬¦¤¯ ¤¯·¨µ¤·¬²± ²©¤³²³·²¶¬¶º«¨ ± ¶∏¥2Št ³¨ ¤®¦²∏¯§¥¨ ¶¨ ±¨ q׫¨
¬¨³µ¨¶¶¬²± ²© …¦¯2u º¤¶§¨¦µ¨¤¶¨§¬± ≥×× ·µ¨¤·¨§¦¨¯¯¶¤¶¦²°³¤µ¨§º¬·«∏±·µ¨¤·¨§¦²±·µ²¯ ¦¨¯¯¶qΧονχλυσιον : ≥×× ¬¨¨µ·¶¬·¶¦¼·²·²¬¬¦ ©¨©¨¦·²±
…∞2zwsu ¦¨¯¯¶¥¼¬±§∏¦¬±ª¤³²³·²¶¬¶q
[ Κεψ ωορδσ] ¶¤³²±¬±¶©µ²° Τριβυλυστερρεστρισ k≥××l ~…∞2zwsu ¦¨¯¯ ¬¯±¨ ~¤³²³·²¶¬¶~
≈责任编辑 古云侠 
全国中医药与亚健康学术会征文通知
由5中国中药杂志6 !5中国医药学报6 !哈尔滨商业大学药物研究所联合主办 o解放军总医院生化科 !陕西亚健康诊治中心
协办 o将于 ussw年第四季度k哈尔滨l召开本次会议 ∀会议将进行大会学术报告及学术交流 o并同时进行亚健康学会筹备会的
协商预备工作会 ∀
征文内容 }t q亚健康理论研究及中医药对亚健康防治的理论研究 ~u q亚健康的临床检测与诊疗标准研究 ~v q中医药防治亚健
康的临床研究 ~w q中医药防治亚健康的经验k包括防治疲劳综合征 o不定陈述综合征 o失眠 o抑郁症 o高血脂症 o高黏滞血症 o空
调病 o网络或电脑综合征等等以及心 !脑 !血管疾病恢复期 o肿瘤手术 !放 !化疗后康复期 o糖尿病和其他病症的恢复时期康复
治疗的临床研究和经验等l ~x q中药成药 !保健药物 !保健食品对亚健康的防治 !辅助治疗与营养作用的研究与应用 ∀
稿件要求 }稿件要求科学 !真实 !实事求是 o杜绝虚假 !夸张溢美和不实之词 ∀并请单位出具相关审查与证明 ∀字数 vsss字以
内 o摘要 vss字以内 o并附软盘kº²µ§文档l ∀
诚邀相关医疗 !科研单位和相关产品企业协办 !参会与举办相关卫星学术活动 ∀联系地址 }k邮编 }tsszssl北京 东直门内
南小街 ty号 中国中药杂志 方文贤 收 ∀电话 }kstslywswx{vs ~kstslywstwwtt p u|yy
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第 u|卷第 z期
ussw年 z月
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