全 文 ： 论著
光叶番荔枝中二萜类化合物对人肝癌细胞株
SMMC-7721生长的抑制
夏国豪　章永红　潘良熹
【摘要】　目的　研究光叶番荔枝中二萜类化合物对人肝癌细胞株 SMMC-7721 生长的抑制作
用。方法　以四唑盐比色试验(M TT)法检测二萜类化合物对 SMMC-7721 细胞生长的抑制率 , 用相
差倒置显微镜观察细胞形态变化 ,用流式细胞术检测细胞周期 、凋亡率及多药耐药基因 1(M DR1)的
表达水平。结果　5～ 25μM 的二萜类化合物对 SMMC-7721 细胞有较强的抑制作用 , 与浓度呈线性
相关 ,并呈时间依赖性 , 72 h 半数抑制浓度(IC50)为 19. 41μM , 20μM 的药物作用于 SMMC-7721 细
胞 48 h ,流式细胞术检测细胞周期阻滞于 G 0 ～ G 1 期 , 细胞凋亡率为 24. 95%;在相差倒置显微镜下
观察到细胞凋亡的特征形态改变 ,M DR1 表达明显下调 , 且随药物浓度的增加 MDR1 表达水平逐渐
下降。结论　光叶番荔枝中二萜类化合物对人肝癌细胞株 SM MC-7721 有显著的抑制作用 , 可诱导
癌细胞凋亡 ,明显下调 MDR1 的表达 ,具有逆转多药耐药性的作用 。
【关键词】　　光叶番荔枝;二萜类化合物;肝癌细胞株;细胞凋亡;多药耐药基因
The inhibitory effect of diterpenoid compound isolated from annona glabra linn on the growth of human
hepatocellular cancer SMMC-7721 cells lines. 　 XIA Guohao , ZANG Yonghong , PAN L iangx i .
Depart ment of Medicine , Cancer Hospital of Jiangsu Prov ince , Nanjing 210009 , CHINA
【Abstract】　Objective　To study the inhibito ry effects o f dite rpenoid compound isola ted from an-
nona g labra linn on the g row th o f SMMC-7721 cells lines and its mechanism. Methods　SM MC-7721
cells w ere t reated with 5μM ～ 25μM of diterpenoid compound. M TT assay w as used to determine the
cell gr ow th r ate. Flow cy tometry(FCM) was used to examine cell cy cle , cell apoptosis rate and M DR1
gene expression. Results　In v itr o studies , the diterpenoid compound could significantly inhibit the
gr ow th o f SMMC-7721. A fter 48 hour s of treatment w ith 20μM diterpenoid compound , “ Sub-G 1”
peaks were recorded by FCM , and the ce ll cycle wa s arre sted in G 0 /G1 pha se and the apopto tic ra te
was 24. 95%. The expression lev el of MDR1 gene decreased after treateted w ith 5μM ～ 25μM of the
dite rpenoid com pound fo r 24 hour s. Conclusion　The dite rpenoid compound isolated fr om annona gla-
bra linn could inhibit the prolifera tion , induce apoptosis and downregulate MDR1 gene expression of
human hepatocellula r cancer SMMC-7721 cells lines.
【Key words】　　Annona glabra linn;Diterpenoid compound;Hepatocellula r cance r;Cell
apopto sis;MDR1 gene
[ Jiangsu Med J , April 2005 , 31(4):263-264. ]
　　基金项目:江苏省自然科学基金(BK2002-201)
作者单位:210009　江苏省肿瘤医院内科(夏国豪 、潘良熹) ;南
京中医药大学(章永红)
　　我们发现光叶番荔枝的提取物有较强的抗肿瘤
活性[ 1] ,并从中分离到多个化合物 ,其中一种二萜类
化合物分子式为 C20H30O 3[ 2] ,我们用该化合物对人
肝癌细胞株 SMMC-7721的生长抑制作用及其机制
作了初步研究 ,兹报道如下。
资料与方法
一 、药物和细胞株
光叶番荔枝中二萜类化合物以少许无水乙醇溶
解 ,加培养液配成所需浓度 , 乙醇终浓度不超过
1%;SMMC-772l肝癌细胞株引自南京中医药大学
生化教研室 。
二 、设备及试剂
日本 Olympus 公司的 IX-50型相差倒置显微
镜;美国 Becton Dickinson 公司的 FACSCalibur 型
流式细胞仪;华东电子管厂的 DJ3200 型酶联免疫
检测仪;日本 Hirasaw a 公司的WJ-12C型二氧化碳
培养箱;四唑盐比色试验(MT T)、碘化丙啶(PI)、
Triton-X 100 1. 0%为美国 Sigma公司产品;RNase
A 为德国宝灵曼公司产品;多药耐药基因 1
(MDR1)单克隆抗体为美国 BD公司产品 。
三 、实验方法
263 江苏医药 2005年 4月第 31卷第 4期　Jiang su Med J , April 2005 , Vol 31 , No. 4
1. 细胞培养　SMMC-772l肝癌细胞株常规培养
于含 10%小牛血清 、100 U /ml青霉素及100 U /ml链
霉素的 RPMI-1640完全培养液中 , 37℃, 5%CO2 培
养箱内培养 ,0.02%EDTA 消化 、传代 。
2.MTT 法　取对数生长期 、浓度为 5×104 /ml
的细胞接种于96孔板 ,每孔 90μl ,设 4个复孔 ,细胞
贴壁后加入不同浓度的二萜类化合物 10μ1 ,对照孔
加入 10μl PBS ,培养至预定时间 ,用倒置相差显微镜
观察各孔内细胞形态并摄像 ,后加 1 mg /ml的 MTT
50μl /孔 ,再培养 4 h ,去上清 ,加 DMSO100μl /孔 ,振
荡5 min ,用酶联仪于 570 nm波长处测各孔吸光度值
(OD),以对照组细胞存活率为 100%,实验组细胞抑
制率(%)=(1 - 实验组 OD 值 /对照组 OD 值)×
100%,Bliss法求得半数抑制浓度(IC50)。
3. 流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡情况
细胞贴壁后在培养瓶中加药 ,并使药物终浓度为 20
μM ,对照组加相同体积的 PBS ,都再培养 48h ,收集
单细胞悬液(约 1×106),离心 ,PBS 洗涤后 ,PI 避光
染色 15 min ,上流式细胞仪测试 ,进行 DNA含量分
析 、细胞周期分析和计算凋亡率 ,所用软件分别为
CELLQU ES T 和 ModiFit lT V 2. 0A 。
4. 流式细胞仪检测细胞 MDR1表达情况　取
不同浓度二萜类化合物处理 24 h 后的实验组和对
照组 SMMZ-7721细胞 , PBS 洗涤 、离心后 ,加入荧
光素标记的 MDR1 单克隆抗体 , 4℃避光反应
30 min后 ,在流式细胞仪上分析结果。
四 、统计学处理
计数资料用 χ2 检验 , P<0. 05表示差异有显著
意义 。
结 果
各种浓度二萜类化合物作用于 SMMC-7721细
胞不同时间的抑制率见图 1。抑制率与浓度呈正相
关 ,并有时间依赖性。经计算 72 h IC50为 19. 45μM ,
即 5. 87μg /ml。
实验组细胞变圆 ,胞浆中颗粒增多 ,脱壁 ,细胞
间接触变松 ,细胞周围碎片增多;而对照组细胞呈上
皮型贴壁生长 ,轮廓清楚 ,细胞间接触紧密 ,生长旺
盛(插页 2图 2 ,3)。通过流式细胞术观察到用药组
在G 0 /G 1 峰前出现一个 DNA 含量减少的亚二倍体
峰 ,即典型的凋亡细胞峰(插页 2图 4)。
20μM 二萜类合化物作用于 SMMC-7721细胞
株 72 h ,使 S 期细胞显著减少 , G 0 ～ G1 期细胞明显
增多 ,细胞周期阻滞于G 0 ～ G 1 期 ,细胞凋亡率显著
图 1　不同浓度 、不同时间二萜类化合物对 SMMC-7721
细胞的抑制率(%)
增加高达 24. 95%。(表 1)
表 1　SMMC-7721 细胞株经 20μM 二萜类化合物处理
48 h 的细胞周期分析及凋亡率(%)
组别 G 0 ～ G 1 G 2 ～ M S 凋亡率
实验组 80. 88** 6. 47 12. 65** 24. 95**
对照组 68. 47 3. 53 28. 00　 0. 05
　　与对照组比较 , **P<0. 01
SMMC-7721 细胞经 0 μM 、5 μM 、 10 μM 、
15μM 、20μM 、25 μM 的药物作用 24 h 后 ,流式细
胞术测定 MDR1 表达分别为 7. 95%、1. 03%、
0. 07%、0. 03%、0. 02%。MDR1 随药物浓度的增
加表达水平逐渐下降。
讨 论
从番荔枝科植物中提取的抗肿瘤成分-番荔枝
内酯化合物 , 被认为是继紫杉醇后的又一个有前
途的 、天然来源的抗肿瘤化合物[ 3] 。章永红等[ 1]
用光叶番荔枝提取物进行动物实验 ,结果表明其
对小鼠肝癌 H 22和小鼠移植肉瘤 S1 80的抑瘤率分别
为 63%和 51%。我们的实验研究表明 ,光叶番荔
枝中二萜类化合物抑制 SMMC-7721增殖的作用
显著 ,且呈浓度及时间依赖性 ,其机制是多方面
的 ,该化合物能诱导细胞凋亡 、阻滞细胞周期和下
调 MDR1的表达 ,逆转多药耐药性 ,因而该化合物
值得进一步研究 。
参 考 文 献
1　章永红 ,韩英 ,夏东 ,等. 光叶番荔枝提取物抗肿瘤作用研究. 南
京中医药大学学报 , 2001, 17:291-293.
2　田丽娟 ,韩英 ,孟正木 ,等. 圆滑番荔枝的化学成分研究. 中国药
科大学学报 , 2001 , 32:10-12.
3　Queiroz EF , Roblot F , Duret P , et al. Synthesis , spectroscopy ,and cy-
totoxicity of glycosylated acetogenin derivatives as promising mole-
cules for cancer therapy. J Med Chem , 2000, 43:1604-1610.
(收稿日期:2004-06-11)
264 江苏医药 2005年 4月第 31卷第 4期　Jian gsu Med J , April 2005 , Vol 31 , No. 4