全 文 ：≈w 张慧桢 o廖矛川 o郭济贤 q中药紫草的化学成分和药理学研
究进展 ≈ q天然产物研究与开发 oussuotwktl}zwq
≈x 葛 锋 o王晓东 o王玉春 q药用紫草的研究进展 ≈ q中草药 o
ussvovwk|l}附 yq
≈y 张玉萌 q紫草多糖的研究概况 ≈ q中国新药杂志 ousswov
kwl}xwq
≈z 徐叔云 o卞如濂 o陈 修 q药理实验方法学 ≈ 1v版 q北京 }
人民卫生出版社 oussu}tvwyq
≈责任编辑 刘
≈收稿日期 ussx2ts2ts
≈基金项目 国家自然科学基金资助项目 kvsvztz|sl~广东省
自然科学基金资助项目 kvtuvul
≈通讯作者 3 周大桥 oר¯} kszxxl{vz|zzu|o∞2°¤¬¯} ½§´ §²¦2
·²µ ¶¬±¤q¦²°
复方叶下珠对人 ³¨ u1u1tx细胞移植裸鼠
¬ª表达的影响
周大桥 t3 o童光东 t o贺劲松 t o魏春山 u o ƒ ¬¨·¨¯¶²± ¤µ®v o吕 屏 v
kt1广州中医药大学 深圳附属医院 肝病科 o广东 深圳 xt{svv~
u1广东增城市人民医院 感染科 o广东 增城 xttvss~
v1׫²°¤¶¨©©¨µ¶²± ±¬√ µ¨¶¬·¼o ≥l
中药复方叶下珠是深圳市中医院肝病中心结合
乙型肝炎所致肝癌和癌前病变患者临床特点 o通过
辨证论治 !精心设计并显示有较好临床疗效的经验
方 ∀本研究选择
¤¯¥r¦2±∏小鼠人肝癌细胞 k ³¨
u1u1txl移植瘤模型 o以复方叶下珠进行处理 o研究
造模前后裸鼠的形态学 !
¬ª表达等相关指标 o
试图从在体动物角度 o为复方叶下珠的肝癌防治作
用提供试验依据 ∀
1 材料
111 接种细胞
液氮冻存人肝癌 ³¨ u1u1tx细胞株 o购自解
放军 wx{医院全军传染病中心肝病研究所 ∀
112 器材
低速离心机 k北京医用离心机厂 l!梅特勒电子
天平 tvxk梅特勒 2托利多仪器上海有限公司 l!
透射电子显微镜 k日本日立 yssoײ®¼²l!± • ¬±显微
图像分析软件 k德国 ¨¬¦¤公司 l等 ∀
113 试剂
⁄ ∞ owt{等 k广州英韦创津生物科技有限
公司 l∀胎牛血清 k杭州四季青生物工程材料有限
公司 l∀谷氨酰胺 kuss °°²¯ # pt l!胰蛋白酶 !⁄2
¤±®χ¶液 !s1t °°²¯ # pt磷酸 °
≥缓冲液 k°
≥l
k³ z1u ∗ z1wl等 k武汉博士德生物工程有限公
司 l∀兔抗人
¬ª多克隆抗体血清由 ƒ ¬¨·¨¯¶²±
¤µ®教授赠送 ∀
≤ 2®¬·来自 ∂ ¦¨·²µ公司的试剂
盒 o正常山羊血清 o生物素标记的羊抗兔抗体 k¥¬²·¬2
±¼¯ ¤·¨§ª²¤·¤±·¬2µ¤¥¥¬·l!过氧化物酶标记的链霉卵
白素 k¶·µ¨³·¤√¬§¬± ³¨ µ²¬¬§¤¶¨l!多聚赖氨酸 k³²¯¼2Λ2
¼¶¬± l¨和二氨基联苯胺 k⁄
l显色试剂盒 k黄 lo购
自北京中杉金桥生物技术有限公司 ∀
114 药物
复方叶下珠颗粒剂 k≤°l是本院肝癌防治临床
观察的基础方 o由叶下珠 !山慈菇 !莪术 !半枝莲 !黄
芪 x种单药颗粒 k广东一方制药有限公司提供 l组
成 o具有健脾护肝 !解毒消瘀 !平衡阴阳的功效 o临床
观察有较好的防治肝癌作用 ≈t ∀用药前以双蒸水
溶解 !配制成含生药 t1s ª# °pt的复方叶下珠药
液 ∀药液当天配制 !灌胃后 o余液 w ε 冰箱保存 o约
w ∗ z §配液 t次 ∀环磷酰胺 k≤×÷ l针剂 k江苏恒瑞
医药股份有限公司提供 o批号 svtut|utlo以双蒸水
定容至 t1s °ª# °pt的稀释液 o用后置 w ε 冰箱保
存 ot周配液 t次 ∀
115 动物
裸鼠 k
¤¯¥r¦2±∏小鼠 lws只 ow周龄 o雄性 o体
重 t| ∗ uu ªo由中山大学肿瘤防治中心提供 o动物合
格证号 ussvsv{∀单只单笼分装 !编号 o裸鼠专用
#|wyt#
第 vt卷第 t|期
ussy年 ts月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯1vto¶¶∏¨ t|
¦·²¥¨ µoussy
饲料常规饲养于广州中医药大学实验动物中心 ≥°ƒ
实验室 o室内 ux ε 恒温 ∀每周称体重 t次 o入笼后
先常规饲养 t周以适应环境 ∀
2 方法
211 瘤液制备
常规细胞复苏 !传代 o选择细胞生长良好的 ts
个 zx ¦°u培养瓶 o常规消化 o°
≥清洗 u次 o集中 o
u sss µ# °¬±pt离心 v °¬±o收集细胞 ∀用 s1|h生
理盐水悬浮细胞 !定容 o调整细胞含量为 t ≅ tsz个 r
°o以 s1xh台盼蓝染液测定培养细胞活力 ∀
212 动物分组与造模
ws只裸鼠随机分为 x组 }≤°预防组 o≤°治疗
组 o≤×÷治疗组 o模型对照组 o空白对照组 o每组 {
只 ∀ t ≅ tsz个 r°的 ³¨ u1u1tx细胞悬液约 z
°经外包装灭菌后传进隔离室 o轻轻摇匀 ∀参照文
献 ≈u o裸鼠颈背部常规消毒 o除空白对照组外 o每
只裸鼠颈背部皮下注射瘤液约 s1u °k约 u ≅ tsy细
胞数 lo空白对照组以 s1u °生理盐水代替 ∀记录
瘤体近似体积 kς αβu ruoα为长径 oβ为短径 l∀以
瘤体直径达 s1x ¦°以上时为造模成功 ∀
造模开始 t ∗ u §后 o各组动物注射部位皮丘状
突起全部消失 ~v ∗ ts §时 o部分裸鼠背部皮下出现
新的皮丘状物 o初时触感细碎 !在皮下有游移滑动
感 o逐渐增大 o肉眼可明显观察到 o至第 u周 o ≤°治
疗组 !≤×÷治疗组 !模型对照组瘤体直径已达 s1x ∗
s1{ ¦°o质感坚韧 o可在皮下移动 o默认造模成功 ∀
213 用药
≤°预防组于造模前 t周开始以 ≤°药液灌胃 o
给药剂量为生药量 u{1zx ª# ®ªpt o其中 t只裸鼠于
第 v天因灌胃不当死亡 ∀造模成功后 o≤°治疗组开
始以 ≤°药液灌胃 o用量同 ≤°预防组 ~≤×÷治疗组
以腹腔注射 ≤×÷ o剂量为 wy1xz °ª# ®ªpt ~模型对
照组和空白对照组均以生理盐水灌胃 o用量同 ≤°
治疗组 ~除 ≤×÷每周连续用药 x次 o其余各组用药
均为每日 t次 ∀每周称重 t次 o及时调整用药量 o各
组均用药至造模成功后第 xw天同时结束 ∀
214 指标检测
每周记录 t次裸鼠体重 !瘤体近似体积 o至实验
结束 ∀于第 xy天取材 }称量体重 o观察瘤体大小 !形
态 !质感 ∀颈椎脱臼法处死 o剥离肿瘤 o清除粘连组
织 o称量实体瘤重 o取完整肝组织 o均用生理盐水清
洗后 o以 tsh福尔马林固定 uw ∗ w{ «ow ε 冰箱保
存 o石蜡切片 ∀肿瘤组织和肝组织常规切片 o部分行
∞染色 o光镜下观察病理组织学变化 ~部分行 ≤
方法以
¬多克隆抗体经 ⁄
显色检测
¬ª表
达 o在光学显微镜下进行读片 o采用显微图像分析软
件进行图象分析 ∀
215 统计方法
采用统计学软件 ≥°≥≥ tv1so计量资料采用 τ检
验或单因素方差分析 o计数资料采用 ςu检验或秩和
检验 o交互分析采用重复测量设计的方差分析 ∀
3 结果
311 裸鼠生长状况
各组造模前后均未见烦燥 !腹泻或嗜睡等现象 o
反应灵敏 o生长正常 o一般情况良好 ∀在造模完成开
始用药时 o以 ≥°≥≥ tv1s统计学软件自动生成的各
组生长曲线 k体重均数 lo发现 ≤°预防组增长最快 o
模型对照组生长快 o≤×÷治疗组增长最慢 o用药后
期 o各组体重增长有减缓趋势 ∀
312 实体瘤重
实验结束时 o各组实体瘤重比较见表 t∀结果
显示 o ≤°预防及治疗均可抑制肿瘤生长 o尤其预防
效果最好 o提示 ≤°预防有一定的临床参考价值 ∀
表 t 各组裸鼠实体瘤重比较 kcξ ? σl
组别 ν 剂量 rª# ®ªpt 瘤重 r°ª
≤°预防 z u{qzx xtvqts ? yztq|sul
≤°治疗 { u{qzx t vuyqxy ? x|xquytl
≤×÷治疗 { s1swy xz zvvqxs ? zuxq{uul
模型对照 { p u vsxqzw ? xv{q|w
注 }与模型对照组比较 tl Π sqsxoul Π sqst
313 肝组织及瘤体病理检测
31311 肝组织 ∞染色切片观察 ≤°预防组 }部
分肝细胞呈嗜酸性坏死 o核变浅 !消失 o其旁见肝细
胞不典型增生 o肝组织轻度脂肪变性 ~≤°治疗组 }肝
细胞不典型增生明显 o肝小叶周边轻度脂肪变性 ~
≤×÷治疗组 }个别肝细胞呈不典型增生 o疑为肝癌
发生的基础 ~模型对照组 }肝细胞不典型增生明显 o
可见显著嗜酸性坏死 o细胞核呈小碎片状 ~空白对照
组 }正常肝组织 ∀
31312 瘤体组织学观察 ≤°预防组 }癌细胞排列
成巢状 !癌巢中央发生坏死 o其外周为脂肪组织 ~≤°
治疗组 }癌巢明显 o可见纤维间隙和坏死组织 ~≤×÷
治疗组 }癌巢中央坏死表现 o细胞融合 !散见核碎片 ~
模型对照组 }癌巢明显 o癌细胞异形性明显 ∀
314 肝组织及瘤体
¬ª表达结果
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第 vt卷第 t|期
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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31411 结果判断及评分标准 光学显微镜下观察组
织切片的显色反应 }酶作用底物使阳性
¬ª表现
为棕黄色或棕褐色的细致颗粒 o免疫组化染色程度被
判为 p o n o6 o分别代表阴性 ksh l!阳性 k tsh l!
强阳性 k∴tsh lo统计时 o分别记为 touov分 ∀
31412 肝组织及瘤体
¬ª表达结果 光学显微
镜下观察组织切片的显色反应 }在瘤组织切片中 o阳
性反应主要集中于肿瘤细胞浆内 o也有一部分位于
细胞核内 o阳性反应多呈淡黄色 o呈巢状分布 ∀在肝
组织切片中 o阳性反应主要集中在中央静脉区 !肝小
叶周边 o汇管区也可有轻度表达 o在 w组造模动物肝
组织中 o均有阳性表达产物 ∀
运用多个独立样本秩和检验 o
¬ª在移植瘤
中的表达各组秩和 k ¤±®¶l比较 o模型对照组 ≤°
治疗组 ≤°预防组 ≤×÷ 治疗组 k秩和均数 }
ut1zx t{1tv tt1ss ts1ss lo各组组间两两比
较结果 o≤°预防组 !≤×÷治疗组与模型对照组之间
有统计学意义 o余各组之间均无统计学意义 ∀
¬2
ª在肝组织中的表达 o模型对照组 ≤°治疗组
≤°预防组 ≤×÷治疗组 空白对照组 kvs1ux
uz1xs ut1xz ty1v{ w1xlo≤°预防组 !≤×÷治疗
组与模型对照组 o≤°治疗组与 ≤×÷治疗组之间有
统计学意义 kΠ s1sxlo≤°预防组 o≤°治疗组 o≤×÷
治疗组 o模型对照组与空白对照组之间有统计学意
义 kΠ s1sxlo余各组之间均无统计学意义 ∀
结果提示 }≤°不能完全阻断移植瘤的发生 o但
能减缓移植瘤形成 o缩小瘤体 o抑制肿瘤的生长和
¬ª的表达 o后者可能是 ≤°防治原发性肝癌
k≤≤l的主要机制之一 ∀
4 讨论
乙型肝炎病毒 k
∂ l是引起肝硬化 !≤≤发生
的重要相关因素 ≈v ∀在对乙肝病毒与 ≤≤的相关
性研究中 o已注意到乙型肝炎病毒 ÷基因 k
¬l及
其编码产物
¬ª在 ≤≤发生和发展中的重要作
用 ≈w ∀近年来发现
¬ª的功能越来越复杂 o认为
不仅能反式激活各种细胞及病毒的启动子及增强
子 o抑制 ⁄的修复 o干扰 ƒ¤¶r≤⁄|x系统和抑制
¦¤¶³¤¶¨2v活性而诱发肝癌形成和促进肝癌发展 ≈x o
还能改变信号通路 o包括细胞生长及分化 !凋亡 ∀持
续低水平的
¬ª表达可导致 ≤≤的发生 ≈y ∀
祖国医学对肝细胞癌有 / 瘕 0 ! /臌胀 0 ! /肝
壅 0等多种称谓 ≈z o认为其病机总属正气亏虚 o气 !
血 !痰 !湿 !热 !瘀 !毒互结 o多为本虚标实之证 ∀作者
以扶正祛邪为总纲 o拟定复方叶下珠以扶脾护肝 !解
毒消瘀 !平衡阴阳 o作为防治 ≤≤的基础方 ∀裸鼠
和实体瘤生长状况分析表明 o≤°能加速裸鼠生长而
抑制瘤体生长 o提示 ≤°可能对移植瘤具有良性防
治作用 ∀通过对瘤组织及肝组织中
¬ª表达分
析 o≤°预防组 !≤°治疗组 !≤×÷治疗组均能不同程
度的抑制
¬ª的表达 o并抑制肿瘤的发展 ∀因
此 o作者认为 ≤°能减缓移植瘤形成 o缩小瘤体 o抑
制肿瘤的生长和
¬ª的表达 o后者可能是 ≤°防
治 ≤≤的主要机制之一 ∀
≈参考文献
≈t 魏青山 o贺劲松 o贺 宪 o等 1中药复方叶下珠防治原发性肝
癌探析 ≈ 1辽宁中医杂志 oussxovukvl}t||1
≈u 李 军 o李福涛 o开 丽 o等 q采用 ³¨u细胞株建立裸鼠肝
癌模型的方法 ≈ q四川生理科学杂志 o ussuo uwkul}z|q
≈v µ¥∏·«±²·°o ¨ º q ³¨¤·¬·¬¶
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±²°¤≈ q ±·∞¬³°¤·«²¯o ussto k{ul} zzq
≈w 慈莉娅 o马 斌 q乙型肝炎病毒的分子生物学及肝功能实验
≈ q首都医药 o ussxo kwl}u|q
≈x ≥∏ ƒo ׫¨ ²§²¶¬¶≤ o ≥¦«± ¬¨§¨ µ q ²¯¨ ²©2®¤³³¤
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≈z 厘正全 o庞佑清 q中医肝胆病证学 ≈ q北京 }人民卫生出版
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≈责任编辑 古云侠
欢 迎 投 稿 欢 迎 刊 登 广 告
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第 vt卷第 t|期
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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