全 文 ：免疫亲合柱净化 ‹°≤柱后溴衍生化方法检测
中药中黄曲霉毒素
张雪辉 o陈建民 3
k中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所 o北京 tsss|wl
≈摘要  目的 }采用免疫亲合柱净化 o结合柱后衍生化的高效液相色谱2荧光检测器检测常用中药材中的黄曲
霉毒素 …t o…u oŠt oŠu ∀方法 }样品经甲醇2水kzΒvl溶液超声提取后 o通过免疫亲合柱净化洗脱 o再经过溴化溴化吡啶
柱后衍生 o高效液相色谱分离定量 ∀结果 }…u和 Šu的最低检出限为 s1sy Λª#®ªp t o…t和 Št的最低检出限为 s1us Λª#
®ªp t ∀回收率实验添加两个水平的标样 o回收率 |s1w h ∗ ||1z h o• ≥⁄v h ∗ tu h ∀结论 }采用此方法检测常用中药
材中的黄曲霉毒素无干扰性杂峰 o结果准确可靠 ∀
≈关键词  黄曲霉毒素 ~‹°≤ 检测 ~免疫亲合柱 ~柱后溴衍生化
≈中图分类号  • u{w1t ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussxlsv2st{u2sv
≈收稿日期  ussw2sx2uy
≈基金项目  国家/十#五0重大科技专项kusst…„zst„xzl ~外经
贸技三函kusst2t{l
≈通讯作者  3陈建民 oר¯ }kstslyu{||zvs oƒ¤¬}kstslyu{||zvs o
∞2°¤¬¯}¦«¨ ±­¬¤±°¬±ƒ «²·°¤¬¯q¦²°
黄曲霉毒素 …t o…u oŠt oŠu是黄曲霉 Ασπεργιλλυσ
φλαϖυσ和寄生曲霉 Ασπεργιλλυσ παρασιτιχυσ的二次代谢产
物 o也是其主要有毒物质 o其中黄曲霉毒素 …t含量
多且毒性最大 o这些毒素具有高毒性和高致癌性 ∀
世界上越来越多的立法机构对食物和饲料中的黄曲
霉毒素的限量作了相关规定 o欧盟在 t|||年 t月 t
日对花生 !干果 !坚果以及谷类k包括荞麦l规定黄曲
霉毒素总量k…t n …u n Št n Šul不超过 w Λª#®ªpt o其
中黄曲霉毒素 …t的含量不超过 u Λª#®ªpt≈t  ∀德国
也制定了相同的限量 o其中对婴儿食品制定了更为
严格的限量要求 o黄曲霉毒素 …t和 w种化合物的总
量不得超过 s1sx Λª#®ªpt ≈u  ∀
随着黄曲霉毒素限量的日益严格 o对检测方法
在灵敏度 !定量准确度和自动化方面提出了新的要
求 ∀以前大多采用硅胶柱 !≤t{柱或液2液分配技术
净化样品 o随着生物化学技术的发展 o越来越多地采
用黄曲霉毒素免疫亲合柱净化样品 o中华人民共和
国国家标准 Š…r× t{|z|2ussv中样品前处理采用的
就是免疫亲合柱≈v  ∀免疫亲合柱kŒ°°∏±²¤©©¬±¬·¼ ≤²¯2
∏°±oŒ„≤l操作简便 !溶剂消耗少 !特异性高 !净化效
果好 o在国内外得到了广泛应用 ∀
中药中黄曲霉毒素的检测报道较少 o应用方法
单一 o主要为薄层色谱法和酶联免疫吸附法
k∞Œ≥„l ∀ussv年 • ‹’关于5草药中污染物和残留
安全和质量评价指南6草案中明确指定应进行黄曲
霉毒素的检测 o其附录 w中仍推荐 ׏≤测定方法 o但
国内外尚未制定出中药中的限量 ∀应用高效液相色
谱2荧光检测器检测食品 !中药中的黄曲霉毒素 o具
有分离度好 !灵敏度高 !快速准确等优点 ∀
本实验采用 Œ„≤ 净化 !过溴化溴化吡啶k°…°…l
柱后衍生 o研究建立用高效液相色谱分离测定中药
中黄曲霉毒素的新方法 ∀w种毒素的检出限达到
s1us Λª#®ªpt o为建立快速准确检测中药中黄曲霉毒
素的方法打下基础 ∀
1 材料与方法
111 试剂和仪器
水为重蒸水 ~甲醇 !乙腈为色谱纯 ~过溴化溴化
吡啶为分析纯kƒ¬¶«¨µ公司l ~黄曲霉毒素混合对照
品购自 ≥˜°∞≤’ 公司 o纯度 ∴|| h o其中黄曲霉素
…t含量的为 s1|ys ±ª#°pt o…u的含量为 s1u{{ ±ª#
°pt oŠt的含量为 t1sss ±ª# °pt oŠu的含量为
s1vsv ±ª#°pt ∀免疫亲合柱 }„©¯¤× ¶¨·ο• °柱k∂¬¦¤°
公司l ~液相色谱系统 }• ¤·¨µ¶||y泵 o • ¤·¨µ¶uwzx多
波长荧光检测器 ∀柱后衍生系统 }• ¤·¨µ¶xst 泵 o
• ¤·¨µ¶柱后反应器 ∀
112 色谱条件
#u{t#
第 vs卷第 v期
ussx年 u月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vs oŒ¶¶∏¨ v
ƒ ¥¨µ∏¤µ¼oussx
色谱柱 ≥¼°°¨ ·µ¼ ≤t{kv1| °° ≅ txs °° ox Λ°l ~
流动相乙腈2甲醇2水ktΒtΒwl ~流速 t1s °#°¬±pt ~
柱温 us ε ~衍生柱温 ws ε ~衍生剂流速 s1v °#
°¬±pt ~荧光检测器激发波长 Κ¨¬vyx ±° o发射波长
Κ¨°wxs ±° ~进样量 us ˏ∀
113 溶液的配制
黄曲霉毒素混标品的配制 }吸取 s1x °黄曲霉
毒素混和对照品 o定容于 ts °量瓶中 o作为储备
液 ∀吸取储备液 t °定容于 ux °量瓶中 o即得 ∀
衍生剂的配制 }称取 xs °ª过溴化溴化吡啶于
小烧杯中 o用 t °甲醇溶解 o量取 t sss °水 o用少
量水将甲醇溶解的过溴化溴化吡啶溶液转移至试剂
瓶中 o少量多次洗涤 o全部转移后获得浓度为 s1sx
°ª#°pt的过溴化溴化吡啶水溶液 ∀将此水溶液超
声后过滤 ∀衍生剂需每日新鲜配制 ∀
114 样品溶液的制备
精密称取药材粉末 ts ªo置于 uxs °具塞锥形
瓶中 o精密加入 tss °甲醇2水kzΒvl溶液 o超声提
取 v次 o每次 ts °¬±o用 • «¤·°¤±玻璃微纤维过滤纸
过滤 o弃初滤液 o收集滤液于锥形瓶中 o备用 ∀
115 免疫亲合柱净化
精密吸取 ts °样品溶液于蒸发皿中 o置于 vx
ε 水浴锅上 o氮气吹 o使溶液浓缩至 u ∗ v °∀在此
浓缩液中添加 x °tx h聚山梨酯2us水溶液 o混合
均匀 o用 ts °注射器吸取上述溶液以 t滴r¶的速
度通过免疫亲合柱 o再用 ts ∗ tx °水以 t ∗ u滴r¶
的速度洗涤亲合柱 o洗涤完后 o让空气进入柱中 o将
水挤出柱子 o最后添加甲醇洗脱黄曲霉毒素 o收集于
t °量瓶中 o即得 ∀
116 衍生化方法的选择
高效液相色谱法结合荧光检测器检测黄曲霉毒
素是国际上流行的方法 o但黄曲霉毒素 …t和 Št在含
水溶液中容易发生荧光淬灭 o为解决黄曲霉毒素 …t
和 Št在含水流动相中荧光太弱的问题 o一般采用柱
前衍生k加三氟醋酸≈w l或柱后衍生k碘溶液≈v 或溴
溶液≈x l ∀柱前衍生操作烦琐 o费时费力 o且人工操
作对最后检测结果的影响较大 ∀在柱后衍生方法
中 o溴溶液衍生化条件要比碘衍生化条件宽松 o灵敏
度高 o衍生化结果稳定 ∀实验证明 o该方法的衍生化
效果十分理想 o见图 tk其中 …tt1|u ±ª# °pt o Št
u1ss ±ª#°pt o…u s1x{ ±ª#°pt oŠu s1ys ±ª#°ptl ∀
2 结果
图 t 黄曲霉毒素混标品 ‹°≤ 色谱图
„1 未经柱后衍生化 ~…1 柱后衍生化 ~t1 黄曲霉毒素 Šu ~
u1 黄曲霉毒素 Št ~v1黄曲霉毒素 …u ~w1黄曲霉毒素 …t
211 方法学考察
21111 最低检出限 根据信噪比 ≥r‘∴v确定被测
物质的最低检出限 o…u和 Šu的最低检出限为 s1sy Λª
#®ªpt o…t和 Št的最低检出限为 s1us Λª#®ªpt ∀
21112 标准曲线 将黄曲霉毒素混标品分别进样
x ots otx ous oux ˏo获得的色谱峰峰面积k Ψ)对黄曲
霉毒素的绝对量( Ξ)作回归 o得到标准曲线 ∀见表
t ∀
表 t 过溴化溴化吡啶柱后衍生化
检测黄曲霉毒素标准曲线
化合物 回归方程 ρ 线性范围r±ª
Šu Ψ€ v1|t ≅ tsx Ξ n t1tu ≅ tsu s1||| { s1ssv ∗ s1stx
Št Ψ€ u1xs ≅ tsx Ξ n w1ux ≅ tsu s1||| z s1st ∗ s1sx
…u Ψ€ z1vw ≅ tsx Ξ p yt1z s1||| y s1ssu {{ ∗ s1stw w
…t Ψ€ v1sx ≅ tsx Ξ n t1vx ≅ tsv s1||| { s1ss| y ∗ s1sw{
21113 日内精密度实验 将黄曲霉毒素混标品连
续进样 x次 o每次 us ˏo以各化合物的峰面积进行
计算 o结果黄曲霉毒素 Šu oŠt o…u o…t的 • ≥⁄分别为
s1{ h ot1u h ot1w h和 t1v h ∀
21114 日间精密度实验 将黄曲霉毒素混标品连
续 x §进样 o每天进样 t次 o每次 us ˏo以各化合物
的峰面积进行计算 o结果黄曲霉毒素 Šu oŠt o…u o…t
的 • ≥⁄分别为 u1s h ou1t h ot1x h和 u1s h ∀
21115 回收率实验 党参 !桃仁 !神曲 v种药材 o代
表了常用中药的 v种基质 o且这 v种药材经过免疫
亲合柱处理之后 o进 ‹°≤检测是基线 o对添加的标
准品检测无干扰 o故用来做回收率实验 ∀本实验添
加了 u个水平的混标品溶液 o水平 t }总黄曲霉毒素
为 u1xw{ Λª#®ªpt o其中 …t为 s1|ys Λª#®ªpt o…u为
s1u{{ Λª#®ªpt oŠt为 t1sss Λª#®ªpt oŠu为 s1vss Λª#
®ªpt ~水平 u }总黄曲霉毒素为 t1uzw Λª#®ªpt o其中
…t为 s1w{s Λª#®ªpt o…u为 s1tww Λª#®ªpt oŠt为 s1xss
Λª#®ªpt oŠu为 s1sys Λª#®ªpt ∀见表 u ∀
#v{t#
第 vs卷第 v期
ussx年 u月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vs oŒ¶¶∏¨ v
ƒ ¥¨µ∏¤µ¼oussx
表 u 过溴化溴化吡啶柱后衍生化检测黄曲霉素回收率试验k ν € yl h
黄曲霉毒素 …t
回收率均值 • ≥⁄
黄曲霉毒素 …u
回收率均值 • ≥⁄
黄曲霉毒素 Št
回收率均值 • ≥⁄
黄曲霉毒素 Šu
回收率均值 • ≥⁄
党参水平 t |x1y v |y1y w ||1s v |{1| u
水平 u |s1w x |y1x y || qz y |{ q| z
桃仁水平 t |y1v x |z1z v ||1w v |z q| w
水平 u |v1s | |x1w | |w1| y |w1s x
神曲水平 t |u1{ tu |z1y x |v1z { |x qs x
水平 u {| qz | |x qy y {| qs y |t qx y
212 样品测定
运用此方法测定了以下药材 o有的药材经过免
疫亲合柱前处理后 o经 ‹°≤ 测定为基线 o无任何峰
出现 o用/ p 0表示 ∀有的药材经过免疫亲合柱前处
理以后 o经 ‹°≤测定有色谱峰出现 o但这些色谱峰
对检测的黄曲霉毒素色谱峰无干扰 o用 / ≅ 0表示 ∀
药材为北京市场随机购买获得 ∀见表 v ∀
3 结论
表 v 样品中黄曲霉毒素检测结果 Λª#®ªp t
样品 结果 样品 结果 样品 结果 样品 结果
蛹虫草k培养l p 茯苓 p 生谷芽 p 白芷 ≅
大黄 p 天麻 p 大山楂丸k湿l p 甘草 ≅
决明子 p 瓜蒌 p 桔梗 p 菟丝子 ≅
丹参 p 莱菔子 p 天冬 p 秦艽 …u s1yzx z
金银花 p 苦参 ≅ 北沙参 p 生建曲 …t s1|vt u ~…u s1ts| w
苦荞 p 鲜橘皮 ≅ 白术 p 生麦芽 …t s1yvw x
黄芩 p 麻黄 ≅ 小白蔻 p 杏仁 …t u1yt| { ~…u s1t|u t
淡豆豉 p 陈皮 ≅ 益智仁 p
薏米仁 p 半夏曲 ≅ 胖大海 p
生神曲 p 沉香舒气丸 ≅ 大山楂丸k干l ≅
采用免疫亲合柱净化 !结合柱后衍生化的高效
液相色谱2荧光检测器检测几十种常用中药材中的
黄曲霉毒素 …t o…u oŠt oŠu o具有快速 !简便 !灵敏 !准
确 !自动化高等优点 o完全能满足批量检测的需要 ∀
≈参考文献 
≈t  ×µ∏¦®¶¨¶¶ • o≥·¤¦®  ∞o‘¨¶«¨¬° ≥ o ετ αλ. Œ„≤ ¦²∏³¯¨º¬·«¶²¯∏2
·¬²± ©¯∏²µ²° ·¨µ¼ ²µ ¬¯´∏¬§¦«µ²°¤·²ªµ¤³«¼ ³²¶·¦²¯∏°± §¨µ¬√¤·¬½¤·¬²± ©²µ
§¨·¨µ°¬±¤·¬²± ²©¤©¯¤·²¬¬±¶¬±¦²µ±o³¨ ¤±∏·¤±§³¨¤±∏·¥∏·¨µ}¦²¯ ¤¯¥²2
·¤·¬√¨ ¶·∏§¼q Ασσοχ Οφφ Αναλ Χηεµ ,ussu ozw }wux q
≈u  Ž¯¤∏¶• ¬¨©o • ²¯©ª¤±ª  ·¨½ª¨µq ⁄¨ ·¨µ°¬±¤·¬²± ²©¤©¯¤·²¬¬±¶¬± ° §¨¬¦¬2
±¤¯ «¨µ¥¶¤±§³¯¤±·¨ ¬·µ¤¦·¶q Χηροµατογρ Αot||x oy|u }tvt q
≈v  Š… t{|z|2ussv食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲合层析净化高
效液相色谱法和荧光光度法 q
≈w  °  ≥¦²·oŠ „ ¤ºµ¨±¦¨1 ⁄¨ ·¨µ°¬±¤·¬²± ²©¤©¯¤·²¬¬±¶¬± ¥¨ µ¨q ΑΟΑΧ
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ªµ¤³«¬¦§¨·¨µ°¬±¤·¬²± ²©¤©¯¤·²¬¬± ¯¨ √¨ ¶¯¬± ³¨ ¤±∏·¥∏·¨µ¶∏¶¬±ª¤±¬°2
°∏±²¤©©¬±¬·¼¦²¯∏°± ¦¯ ¤¨±∏³ °¨ ·«²§}¬±·¨µ±¤·¬²±¤¯ ¦²¯ ¤¯¥²µ¤·¬√¨ ·µ¬¤¯ q
ΑΟΑΧΙντ . usss o{vkul }vus q
ΗΠΛΧ αναλψσισ οφ αλφατοξινσιν µεδιχιναλ ηερβ εξτραχτσ βψιµ µ υνοαφφινιτψ
χολυµ ν χλεανυπ ανδ ποστ2χολυµ ν βροµινατιον
‹„‘Š ÷∏¨2«∏¬o≤‹∞‘¬¤±2°¬±
(Ινστιτυτε οφ Μεδιχιναλ Πλαντ ∆εϖελοπµεντ , Χηινεσε Αχαδεµψ οφ Μεδιχαλ Σχιενχεσ ανδ Πεκινγ Υνιον Μεδιχαλ Χολλεγε , Βειϕινγ tsss|w , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε:ײ §¨ √¨¯²³¤ ±¨ º ¤±§¤¦¦∏µ¤·¨ ° ·¨«²§·² ∏´¤±·¬©¼ ¤©¯¤·²¬¬±¶¬± ° §¨¬¦¬±¤¯ «¨µ¥¶q Μετηοδ : ׫¬¶° ·¨«²§¦²±¶¬¶·¶
²©¶¤°³¯¨ ¬¨·µ¤¦·¬²± ¥¼ ∏¶¬±ª  ’¨‹2‹u’ kzΒvl o©²¯ ²¯º §¨¥¼ ¦¯ ¤¨±2∏³ º¬·«¤±¬°°∏±²¤©©¬±¬·¼ ¦²¯∏°±o¤±§©¬±¤¯ ¼¯ ‹°≤ §¨·¨µ°¬±¤·¬²± º¬·«
©¯∏²µ¨¶¦¨±¦¨ §¨·¨¦·¬²±q„©¯¤·²¬¬±¶…t ¤±§ Št ¤µ¨ §¨·¨µ°¬±¨ §¤¶·«¨¬µ¥µ²°¬±¨ §¨µ¬√¤·¬√ ¶¨o³µ²§∏¦¨§¬± ¤± ²±2¯¬±¨ ³²¶·2¦²¯∏°± §¨µ¬√¤·¬½¤·¬²±
¶¼¶·¨° q Ρεσυλτ }׫¨ ²√ µ¨¤¯¯¤√ µ¨¤ª¨ µ¨¦²√ µ¨¬¨¶©²µ§¬©©¨µ¨±·° §¨¬¦¬±¤¯ «¨µ¥¶¶³¬®¨ §¤··º²¯¨ √¨¯¶²©¶·¤±§¤µ§¶º µ¨¨ ©µ²° |s qw h ·²|| qz h q׫¨
§¨·¨¦·¬²± ¬¯°¬·º¤¶s qsy Λª#®ªp t©²µ¤©¯¤·²¬¬±¶Šu ¤±§…u o¤±§s qus Λª#®ªp t©²µ¤©¯¤·²¬¬±¶Št ¤±§…t qΧονχλυσιον }׫¨ ∏¶¨ ²©¬°°∏±²¤©©¬±¬2
·¼ ¦²¯∏°± ³µ²√¬§¨¶ ¬¨¦¨¯¯ ±¨·¦¯ ¤¨±∏³²©¬±·¨µ©¨µ¬±ª¶∏¥¶·¤±¦¨¶q׫¨ ° ·¨«²§«¤¶¥¨ ±¨ ¤³³¯¬¨§¶∏¦¦¨¶¶©∏¯¯ ¼·²¤±¤¯¼½¨ |y ±¤·∏µ¤¯ §µ∏ª¶q
[ Κεψ ωορδσ] ¤©¯¤·²¬¬±¶~ ‹°≤ ~¬°°∏±²¤©©¬±¬·¼ ¦²¯∏°±~³²¶·2¦²¯∏°± ¥µ²°¬±¤·¬²± ≈责任编辑 王康正 
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中 国 中 药 杂 志
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