全 文 ：小秦艽µ• ‘„基因内转录间隔区
测序鉴定的初步研究
姬可平 o张西玲 o刘丽莎 o路权云 o陈 彻
k甘肃中医学院 o甘肃 兰州 zvssssl
≈摘要  目的 }对小秦艽种籽中提取的 ⁄‘„中 µ• ‘„基因内转录间隔区进行碱基序列测定 o以期从分子水平
建立对秦艽种籽的鉴定标准 ∀方法 }常规提取小秦艽种籽 ⁄‘„ o利用合成的特异性引物对其 ⁄‘„中 µ• ‘„基因内
转录间隔区进行套式 °≤ • 扩增 o将扩增产物以四色荧光标记的双脱氧末端终止循环法进行碱基序列测定 ∀结果 }
经琼脂糖凝胶电泳证实 µ• ‘„基因内转录间隔区 °≤ • 扩增产物存在 o测序后得到了小秦艽种籽 µ• ‘„ 基因内转
录间隔区的碱基序列 ∀结论 }µ• ‘„ 基因内转录间隔区的碱基序列可作为分子水平鉴定植物性中药材的又一途径 ∀
≈关键词  小秦艽 ~套式 °≤ • ~⁄‘„测序 ~µ• ‘„基因 ~鉴定
≈中图分类号  ≥ xyz ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussvlsw2svtv2sw
随着分子生物学技术的进展 o中药材的鉴定方
法从最初的性状鉴定 o以至后来所形成的显微 !理
化 !色谱及光谱等方法的应用已发展到了 ⁄‘„ 指
纹等分子水平 ∀目前这类研究已在随机扩增多态
⁄‘„kµ¤±§²° ¤°³¯¬©¬¨§ ³²¯¼°²√³«¬¦ ⁄‘„ o• „°⁄l
及 ⁄‘„ 测定等方面取得了许多进展 o其中 • „°⁄
的研究多集中在植物药材方面≈t ou  o尽管 • „°⁄技
术有无需事先被鉴定药材基因组序列的优点 o但
• „°⁄实验条件苛刻 o任何条件的改变都将影响实
验结果 ∀同时还存在结果判断的主观性较强的缺
点≈v  ∀本文报告以植物 µ• ‘„ 基因内转录间隔区
k以下简称间隔区l通用引物套叠式扩增小秦艽种籽
的第 t和第 u间隔区 o并对扩增产物进行 ⁄‘„ 碱
基序列测定 o以期建立分子水平的鉴定标记 ∀现将
初步研究结果报告如下 ∀
1 材料和方法
1 q1 实验材料 小秦艽 Γεντιανα δαηυριχα ƒ¬¶«种
籽由本课题组张西玲副教授收集并鉴定 ∀
1 q2 实验仪器及试剂 °∞2uwss °≤ • 仪k美国l o凝
胶成像系统k⁄‹2us o中国计量科学院华电公司l o
⁄≠2 „电泳仪k上海生化所西巴斯生物技术开发公
司l× ŠtyŠ台式高速离心机k上海医用分析仪器
≈收稿日期  ussu2sx2us
≈基金项目  甘肃省自然科学基金项目k≥stt2„ux2sx{2≠l
≈通讯作者  ר¯ }ks|vtl{yyyxvw
厂l o°≤ • 核心试剂盒 !蛋白酶 Ž!非离子去污剂
‘°ws k均由无锡市克隆遗传技术研究所糜祖煌研
究员惠赠l ∀
1 q3 ⁄‘„提取 将小秦艽种籽置于特制的铁砧上
用铁锤击碎k铁砧 !铁锤使用前在酒精灯火焰上烤
vs ¶o以防 ⁄‘„污染l ∀取少许粉碎物移入 s qx °
离心管内 o加蒸馏水 xs ˏo置 xx ε 水浴 t «o加 tss
ˏ浓度为 wss Λª#°p t的蛋白酶 Ž溶液k为 s qx h
非离子去污剂 ‘°ws配制l ∀置 xx ε 水浴消化 v «o
然后改置 |x ε 水浴灭活蛋白酶 Žts °¬±o加 ws ˏ
水饱和的非离子去污剂 ‘°ws 吸附金属离子 o置 xx
ε 水浴 us °¬±∀离心kts sss µ#°¬±p tlvs ¶o上清液
即为扩增之模板 ∀
1 q4 引物设计 上网检索美国国立生物信息中心
k‘≤…Œo网址 }«··³}rrººº q‘¦¥¬q±¯ ° q±¬«qª²√rl核
酸库中已登录的 µ• ‘„ 基因 o在保守区设计 x条寡
核苷酸引物 ∀引物序列如下 }
Œ×≥t°2°t }xχ2ŠŠ„ „Š× „„„ „Š× ≤ Š× „„≤ „„Š Š2
vχ ~
Œ×≥t°t }xχ2× ≤ ≤ Š× „ ŠŠ× Š„„ ≤≤ × Š≤ Š Š„2vχ ~
Œ×≥t°u }xχ2Š≤ × Š≤ Š × × ≤ × × ≤ „× ≤ Š„× Š≤2vχ ~
Œ×≥u°t }xχ2Š≤ „ × ≤ Š „× Š „„Š „„≤ Š≤ „ Š≤2vχ ~
Œ×≥u°u }xχ2× ≤ ≤ × ≤≤ Š≤ × × „× × Š„ × „× Š≤2vχ
无锡市克隆遗传技术研究所糜祖煌研究员设
计 ∀
1 q5 扩增步骤 先用引物 Œ×≥t°2°t和 Œ×≥u°u扩
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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增µ• ‘„ 基因内转录间隔区全序列 ~产物经双蒸水
稀释后 o分别由引物 Œ×≥t°t和 Œ×≥t°u ~Œ×≥u°t和
Œ×≥u°u扩增第 t和第 u间隔区 ∀由此完成套叠式
聚合酶链式反应k±¨ ¶·¨§³²¯¼° µ¨¤¶¨ ¦«¤¬± µ¨¤¦·¬²±o
±°≤ • l ∀
1 q6 扩增体系参数 优化后的扩增体系为上 !下游
引物各 s qx Λ°²¯ #pt o§‘×°¶各 uss Λ°²¯ #p t o
Ž≤¯ts °°²¯#p t ok‘‹wlu≥’w { °°²¯#pt o ª≤ u¯
u °°²¯ # pt oΤρισ2‹≤¯k³‹ | qsl ts °°²¯ # p t o
‘°ws s qx h oΤαθ ⁄‘„ 聚合酶 t单位 ∀总反应体
积 us ˏo其中模板液 x ˏ∀Œ×≥t°2°t和 Œ×≥u°u
扩增为吸取 ⁄‘„ 提取液 x ˏ为模板 ~Œ×≥t°t 和
Œ×≥t°u ~Œ×≥u°t 和 Œ×≥u°u 则为将 Œ×≥t°2°t 和
Œ×≥u°u扩增产物经双蒸水稀释 ts倍后吸取 x ˏ
为模板 ∀热循环参数均为 |v ε 预变性 u °¬±o然后
按 |v ε vs ¶ ψ xx ε vs ¶ ψ zu ε ys ¶o共循环 vx
个周期 ∀最后 t个周期 zu ε 延长至 x °¬±∀
1 q7 °≤ • 扩增产物电泳 将经 ±°≤ • 后的模板在
t qx h琼脂糖凝胶上电泳 o以证实小秦艽种籽 µ• ‘„
基因第 t和第 u内转录间隔区 ±°≤ • 扩增产物的存
在 ∀
1 q8 ⁄‘„ 碱基序列测定 乙醇纯化 Œ×≥t°t 和
Œ×≥t°u扩增产物与 Œ×≥u°t和 Œ×≥u°u扩增产物 ∀
前者用 Œ×≥t°t 引物作正向测序 o后者用
Œ×≥u°u引物作反向测序k此步骤由上海博亚生物技
术有限公司应用美国 „…Œ公司生产的 „…Œvzz型测
序仪以四色荧光标记的双脱氧末端中止循环测序法
完成l ∀
2 实验结果
2 q1 小秦艽种籽 µ• ‘„ 基因第 t和第 u内转录间
隔区 ±°≤ • 扩增结果见图 t ∀电泳条带显示小秦艽
种籽第 t内转录间隔区kŒ×≥tl和第 u内转录间隔区
kŒ×≥ul序列长度均  uts ¥³o且 Œ×≥u序列长度 
Œ×≥t序列长度 ∀
2 q2 小秦艽种籽 µ• ‘„ 基因第 t和第 u内转录间
隔区 ±°≤ • 扩增产物测序结果 ∀小秦艽种籽 µ• ‘„
基因内转录间隔区 Œ×≥t oŒ×≥u碱基序列长度分别
 uts ¥³和  vts ¥³o与电泳分析结果相符合 ~将其
Œ×≥t oŒ×≥u的正反向序列拼接后得到小秦艽种籽
µ• ‘„基因间隔区碱基完整序列k见图 ul ∀
图 t 小秦艽种籽 µ• ‘„基因扩增产物电泳图谱
3 讨论
3 q1 已有的中药材分子鉴定方法 us世纪末 o国
内学者应用 • „°⁄技术进行植物类中药材的鉴
定≈t ou  ∀优点是取材微量 o无须事先知道受试药材
的 ⁄‘„基因组资料 ~缺点是需筛选许多引物 o实验
要求高 ∀且结果的判断具有一定的主观性≈v  ∀
3 q2 本研究的创新思路与策略 药材经击碎后用
蛋白酶 Ž消化 o免除了传统十六烷基溴化铵
k≤ × „…l破壁和酚2氯仿提取的繁琐步骤≈u ov  ∀由于
采用 ±°≤ • 扩增技术 o故检测灵敏度极高 ∀国内外
已有的 ±°≤ • 研究报告中均认为受检标本中只要有
一个拷贝的靶基因 o即可被 ±°≤ • 扩增检出≈w ox  ∀
目前植物性中药材其基因组序列绝大多数没有阐
明 o我们利用真核细胞中 t{≥2x q{≥2u{≥µ• ‘„ 基因
的保守区序列 o自行设计引物扩增由 t{≥2x q{≥间的
第 t间隔区和 x q{≥2u{≥间的第 u间隔区 ∀本文不
仅成功的扩增了小秦艽种籽µ• ‘„基因的第 t和第
u间隔区 o并完成了该二间隔区扩增产物的 ⁄‘„碱
基序列的测定 ∀引物 Œ×≥t°u和引物 Œ×≥u°t为互
补的等位基因k见引物 Œ×≥t°u和引物 Œ×≥u°t的碱
基序列l o第 t间隔区和第 u间隔区分别进行正 !反
向测序 o由此将二段序列进行拼接 o从而得到了两间
隔区的完整序列 ∀并已申请登录美国 Š ±¨¥¤±®核
酸数据库 ∀由于生物µ• ‘„基因内转录间隔区进化
极快 o存在科 !属 !种 o甚至株之间的差异 o因此近年
来已被国内外学者广泛用于真核生物或原核生物物
种鉴别≈y oz  ∀植物性中药材 µ• ‘„ 基因间隔区的扩
增和测序有望成为新的应用分子生物学技术鉴定药
材的途径之一 ∀
3 q3 植物性中药材µ• ‘„基因间隔区的扩增和测
序方法的优点与作为分子鉴定方法急需解决的问题
由于本方法在真核生物µ• ‘„基因保守区设计引
物 o因此尽管国内植物性中药材绝大多数k包括我国
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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图 u 小秦艽种籽 µ• ‘„基因间隔区碱基完整序列
横线处示二间隔序列拼接处
特有的药材l基因组序列尚不明了 o但仍有分析区别
的可能 o当务之急是对国内道地名贵中药材尽早进
行µ• ‘„ 基因间隔区序列分析 o并建立相应的数据
库 ∀
≈致谢  无锡市克隆遗传技术研究所糜祖煌研究员在
技术及各方面支持 ∀
≈参考文献 
≈t  吴 o王义权 o余伯阳 o等 q • „°⁄在山麦冬属四种植物分类
中的应用 q中草药 ot||{ ou|ktl }vz q
≈u  马小军 o汪小权 o邹喻革 q人参 • „°⁄指纹鉴定的毛细管 °≤ •
方法 q中草药 ot||{ ou|kvl }t|t q
≈v  王建云 o熊丽娟 q分子生物学技术鉴定药材 q中国药学杂志 o
t||{ ovvktul }zxz q
≈w  ‹¤µ¤¶¤º¤ • q °≤ • } „³³¯¬¦¤·¬²± ²© ‘¨¶·¨§ °≤ • ·² ⁄¨ ·¨¦·¬²± ²©
 ¼¦²³¯¤¶°¤¶q≥¤± ⁄¬¨ª²ot||y otxk|l }xu q
≈x  糜祖煌 o陆亚华 o秦 玲 q肺部炎性疾病者生殖支原体套式
°≤ • 检测研究 q中国人兽共患病杂志 ot||| otxk|l }xu q
≈y  ¤®¬°∏µ¤Žoפ°∏µ¤ ≠ o ²¦«¬½∏®¬× o¨·¤¯ q°«¼¯ ²ª¨ ±¨ ·¬¦≤ ¤¯¶¶¬©¬2
¦¤·¬²± ¤±§≥³¨ ¦¬¨¶Œ§¨ ±·¬©¬¦¤·¬²± ²© ⁄¨ µ°¤·²³«¼·¨ ≥·µ¤¬±¶…¤¶¨§²±
⁄‘„ ≥¨´ ∏¨ ±¦¨¶²© ‘∏¦¯ ¤¨µ•¬¥²¶²°¤¯ Œ±·¨µ±¤¯ ×µ¤±¶¦µ¬¥¨ §≥³¤¦¨µ
t • ª¨¬²±¶q ≤ ¬¯± ¬¦µ²¥¬²¯ ot||| ovzkwl }|us q
≈z  李国利 o庄玉辉 o赵 路 o等 qty≥2uv≥ µ⁄‘„内转录间隔区序列
分析及其在分支杆菌鉴定中的应用价值 q中华结核和呼吸杂
志 oussu ouxkvl }tyy q
Πριµ αρψ Στυδψ ον Μεασυρινγ τηε Ιντερναλ
Τρανσχριβεδ Σπαχερ λ Ρεγιονσ οφ ρΡ ΝΑ Γενειν σεεδσ οφ Γεντιανα δαηυριχα
Œ Ž¨2³¬±ªo ‹ „‘Š ÷¬2¯¬±ªoŒ˜ ¬2¶«¤o˜ ±∏¤±2¼∏± o≤ ‹∞‘Š ≤«¨
kŠ¤±¶∏ ≤²¯¯¨ ª¨ ²© ×µ¤§¬·¬²±¤¯ ≤«¬±¨ ¶¨  §¨¬¦¬±¨ o Š¤±¶∏ zvssss o¤±½«²∏o≤«¬±¤l
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ ¤°³¯¬©¼·«¨ °≤ • º¬·«·«¨ ¬±·¨µ±¤¯ ·µ¤±¶¦µ¬¥¨ §¶³¤¦¨µ¯ µ¨ª¬²±¶° ¤¨¶∏µ¨ ·«¨ ¥¤¶¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²©·«¨ ¤°2
³¯¬©¬¨§³µ²§∏¦·¶²© ⁄‘„ o¤±§·²¶¨·∏³¤±¬§¨ ±·¬©¬¨§¶·¤±§¤µ§²±·«¨ ¯¨ √¨¯ ²© °²¯ ¦¨∏¯¨q Μετηοδ : ⁄‘„ ©µ²°·«¨ ¶¨ §¨¶²© Γ . δαηυριχα
#xtv#
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º¤¶ ¬¨·µ¤¦·¨§¥¼¦²±√ ±¨·¬²±¤¯ ° ·¨«²§o¤±§¦²°³²¶¨§³¨ ¦∏¯¬¤µ³µ¬° µ¨º¤¶∏¶¨§·²¤°³¯¬©¼ º¬·«·«¨ ¬±·¨µ±¤¯ ·µ¤±¶¦µ¬¥¨ §¶³¤¦¨µ¯ µ¨ª¬²±¶
²©·«¨ µ• ‘„ ª¨ ±¨ o¤±§·«¨ ¥¤¶¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²©·«¨ ¤°³¯¬©¬¨§³µ²§∏¦·¶¥¼¶·²³³¬±ª·«¨ ¦¬µ¦¯¨²©·«¨ ±¨§²©§²∏¥¯¨§¨ ²¬¬§¤·¬²± ²©©²∏µ¦²¯²µ
©¯∏²µ¨¶¦¨±·°¤µ® º¤¶° ¤¨¶∏µ¨§ qΡεσυλτ : Œ·º¤¶³µ²√ §¨¥¼ ¤ª¤µ¶∏ª¤µª¨¯¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶·«¤··«¨ °≤ • ¤°³¯¬©¬¨§³µ²§∏¦·¶²©·«¨ ¬±·¨µ2
±¤¯ ·µ¤±¶¦µ¬¥¨ §¶³¤¦¨µ¯ µ¨ª¬²±¶²©·«¨ µ• ‘„ ª¨ ±¨ ¬¨¬¶·¨§q× «¨ ¥¤¶¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²©·«¨ ¶¨ §¨¶²© Γ . δαηυριχα. ¶¬±·¨µ±¤¯ ·µ¤±¶¦µ¬¥¨ §¶³¤¦2
µ¨¯ µ¨ª¬²±¶²©·«¨ µ• ‘„ ª¨ ±¨ º¤¶° ¤¨¶∏µ¨§qΧονχλυσιον : ײ ° ¤¨¶∏µ¨ ·«¨ ¥¤¶¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²©¬±·¨µ±¤¯ ·µ¤±¶¦µ¬¥¨ §¶³¤¦¨µ¯ µ¨ª¬²±¶²©·«¨
µ• ‘„ ª¨ ±¨ ¬±·«¨ ¶¨ §¨¶²© Γ . δαηυριχα. ¶¬¶¤ ° ·¨«²§·²¬§¨ ±·¬©¼ √ ª¨¨·¤¯ ≤«¬±¨ ¶¨ ·µ¤§¬·¬²±¤¯ ° §¨¬¦¬±¨ ²±·«¨ ¯¨ √¨¯ ²© °²¯ ¦¨∏¯¨q
[ κεψ ωορδσ] Γεντιανα δαηυριχα ~±°≤ • ~ ° ¤¨¶∏µ¨ ·«¨ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²© ⁄‘„ ~µ• ‘„ ª¨ ±¨ ~¬§¨ ±·¬©¬¦¤·¬²±
≈责任编辑 袁桂京 
三七 ‹°≤ 指纹图谱的建立
王 雁t o毕开顺u
kt q辽宁省盘锦市药品检验所 o辽宁 盘锦 tuwsts ~
u q沈阳药科大学 o辽宁 沈阳 ttsstxl
≈摘要  目的 }建立三七药材的高效液相指纹图谱k‹°≤2ƒ°l o在量上为三七的鉴定与合理应用提供依据 ∀
方法 }∏±¤≤t{kul色谱柱 o流动相 }k„l乙腈2k…ls qsx h磷酸梯度洗脱 os ∗ { °¬±kus h „ o{s h …l o{ ∗ us °¬±kus h
„ ∗ ws h „ o{s h … ∗ ys h …l ous ∗ vs °¬±kws h „ ∗ us h „ oys h … ∗ {s h …l ovs ∗ vy°¬±kus h „ ∗ tss h „ o{s h … ∗
sl ovy ∗ xs °¬± ktss h „l oxs ∗ yx °¬±ktss h „ ∗ us h „ os ∗ {s h …l o流速 t qs °#°¬±p t o检测波长 usv ±° ∀咖啡
因为内标物 ∀结果 }通过聚类分析 out个不同产地 !不同规格的三七样品被聚为 w类 }地道药材优级品 !地道药材 !
市售一般品和次品 ∀通过相似度计算 out个三七样品的相似度均在 s q| ∗ t qs之间 o{个常见伪品的相似度均小于
s q| ∀结论 }该色谱图可作为三七的 ‹°≤2ƒ° o用于三七的真伪鉴别和质量评价 ∀
≈关键词  三七 ~指纹图谱
≈中图分类号  • u{u qx ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussvlsw2svty2sx
指纹图谱≈t 作为中药材及中成药的一种新的
质量控制技术 o正得到普遍关注 ∀三七≈u  o性味甘 !
微苦 !温 ∀主要用于治疗咯血 !衄血 !外伤出血 !跌打
肿痛 ∀药理资料证明≈v ow  o三七具有抗血栓 !改善心
血管功能和很强的止血作用 ∀中国中医研究院中药
研究所与云南文山州科委合作进行的开发应用三七
的基础研究结果表明 }在耐缺氧 !抗衰老 !提高机体
免疫力方面 o在相同剂量下 o三七皂苷的作用大于人
参皂苷 ∀因此 o三七成为目前最为常用的贵重中药
材 ∀血塞通 !血栓通注射液为三七总皂苷的水溶液
制剂 o同时三七也是多种中成药复方丹参片 !三七
片 !脑得生片等的主要组成成分≈x  o因而 o市场上三
≈收稿日期  ussu2s|2us
≈通讯作者  ר¯ }kswuzlu{s{ysv ƒ¤¬}kswuzlu{sssu{ ∞2
°¤¬¯}¶§®xx| ƒ ¼¤«²²q¦²° q¦±
七掺杂使假的现象时有发生 ∀为了有效打击假劣药
品 o保证药品质量 o同时为了实现中药标准标准化 o
推动中药材 Š„° 的实施 ∀本实验建立了三七的
‹°≤ 指纹图谱并对该指纹图谱的特征峰数据进行
系统聚类分析和相似度计算 o同时比较了三七与其
常见的伪品≈y oz  ) ) ) 姜黄 !高良姜 !郁金 !三棱 !白
术 !白芷 !白及 !莪术的高效液相色谱的差异 ∀
1 仪器与试剂
≥≥Œ ≥∞• Œ∞≥ Œ∂ 双泵高效液相色谱仪 o≥≥Œ xss
紫外检测器 o„±¤¶·¤µ色谱工作站 ∀
乙腈k色谱纯 l o磷酸k分析纯 l o内标咖啡因k
熔点标准品 o批号 tst2{wsv o中国药品生物制品检
定所提供l ∀
对照品 三七皂苷 • tk批号 szwx2usssszl !人
参皂苷 • ªtk批号 szsv2ussttzl !人参皂苷 • ¥tk批
号 zsw2ussttwl o均为化学对照品 !含量测定用 o中
国药品生物制品检定所提供 ∀
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