全 文 ：川黄柏毛状根的诱导及活性成分的产生
王跃华 t3 o苟小军 t o吴 洁 u o阎文昭 u o马先军 t o杨 毅 t
kt1成都大学 生物工程系 o四川 成都 ytstsy~ u1四川省农业科学院 o四川 成都 ytssyyl
≈摘要   目的 }诱导川黄柏毛状根的发生 ∀方法 }利用发根农杆菌 „×≤≤tx{vwo„wo• tyss和 • tsss诱导川黄
柏不同外植体产生毛状根 ∀结果与结论 }经 °≤• 扩增实验证实发根农杆菌 • ¬质粒的 ×2⁄‘„片段已整合进入川黄
柏植物核基因组中 o‹ °≤测定结果显示 o川黄柏毛状根培养物中含有盐酸小檗碱 o并且其含量高于川黄柏组培苗
和愈伤组织 ∀
≈关键词   川黄柏 ~毛状根 ~盐酸小檗碱 ~发根农杆菌
≈中图分类号   ≥ xyz ≈文献标识码   „ ≈文章编号   tsst2xvsukussyluu2t{xv2sw
≈收稿日期   ussx2s|2s{
≈通讯作者   3 王跃华 o ר¯} ksu{l {|{yv||yo ƒ¤¬} ksu{ l
{vvwtssvo ∞2°¤¬¯}·¯©²µƒ «²·°¤¬¯1¦²°
川黄柏为芸香科植物黄皮树 Πηελλοδενδρον
χηινενσε ≥¦«± ¬¨§的干燥树皮 o是著名的川产道地药
材 o具有清热燥湿 !泻火除蒸 !解毒疔疮等功效 ∀近
年来川黄柏资源遭到严重破坏 o许多地区野生的川
黄柏资源正在急剧减少 ∀毛状根具有生长迅速和遗
传稳定以及能在无激素的培养基上生长的特点 o它
能够合成与原植物含量相当或高于原植物含量的次
生代谢产物 ≈tou  ∀因此毛状根培养已成为近年来发
展起来的生产药用植物有效次生代谢物的培养系
统 ∀目前 o关于木本植物川黄柏的毛状根诱导培养
尚缺乏报道 ∀本研究首次报道利用发根农杆菌遗传
转化川黄柏外植体产生毛状根的离体培养系统 o为
川黄柏药物资源的可持续开发利用提供技术支持 ∀
1 材料与方法
111 材料 川黄柏采自成都市都江堰虹口镇 o经四
川师范大学马丹伟副教授鉴定为芸香科植物黄皮树
Π1 χηινενσε∀
112 方法
11211 菌 种 活 化 培 养 将 发 根 农 杆 菌
„×≤≤tx{vwo• tysso„w和 • tsss菌株在 ≠∞…≈v 固
体培养基上划线 o u{ ε 暗培养 uw «后 o挑取单菌
落接入 ≠∞…液体培养基中 ou{ ε 振荡 ktvx µ#
°¬±pt l培养 uw «后 o在 yss ±°处测得菌液 Α值为
s1xx左右即可用于外植体浸染 ∀
11212 植物材料培养 将川黄柏种子剥去种皮 o
用 s1th的升汞消毒 ts °¬±o无菌水冲洗 u ∗ v次 o
接种在  ≥ ny2…„ s1x °ª# pt培养基上 o u{ ε 培
养 us §后 o获得川黄柏无菌幼苗 ∀
11213 愈伤组织的诱导 切取川黄柏无菌小植株
的茎段 o接种在  ≥ nuow2⁄ t °ª# pt n y2…„ u °ª
# pt的培养基上 o培养温度 kux ? ul ε o光强 u sss
¬¯o每天照射 ts «∀培养 v §后外植体开始产生愈伤
组织 ∀在相同培养条件下 o每 ts §继代 t次 ∀
11214 外植体转化 选择生长健壮的川黄柏无菌
幼苗 o切取子叶 !下胚轴 !带芽下胚轴 !幼茎 !根 !叶柄
作为转化外植体接种于预培养培养基  ≥ n ‘„„
s1t °ª# pt n 乙磺酸 s1x ª# pt n蔗糖 vs ª#
pt上 o ux ε 预培养 uw «∀取上述培养的农杆菌液
在 x sss µ# °¬±pt ow ε 的条件下离心 tx °¬±后加
入到含有 ws °ª# pt乙酰丁香酮的  ≥悬浮培养液
中 o其中蔗糖 s1vx ª# pt o在 u{ ε 振荡 ktvx µ#
°¬±pt l混匀培养 tu « o用于浸染 ~外植体浸染 tu
°¬±后 o用无菌滤纸将多余菌液吸干 o再接种到共培
养培 养 基 trts ≥ n „≥ k乙 酰 丁 香 酮 l
ws °ª# pt n葡萄糖 us ª# pt oux ε 暗培养 v ∗ w
§后 o待外植体周边出现菌斑 o将转化外植体用无菌
水清洗 v次 o再用含 xss °ª# pt头孢噻肟钠的脱
菌水浸泡 us °¬±o并放于无菌滤纸上吸干表面的水
分后 o转入含 xss °ª# pt头孢噻肟钠的 tru ≥除
菌培养基上培养 ∀待毛状根长出 o切取 v ¦°左右的
毛状根仍然置于上述除菌培养基上除菌培养 v ∗ x
次 o可获得无菌的毛状根 ∀同时做对照 o除不与发根
农杆菌接触外 o其余操作均相同 ∀
#vx{t#
第 vt卷第 uu期
ussy年 tt月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯1vtoŒ¶¶∏¨ uu
‘²√ °¨¥¨ µoussy
11215 毛状根的鉴定 用 ≤ׄ…法提取转化和未
转化外植体基因组 ⁄‘„≈w  o碱裂解法提取质粒
⁄‘„≈x  ∀阳性对照为菌株 „×≤≤tx{vw的质粒 ⁄‘„
扩增产物 o阴性对照为未转化外植体 ⁄‘„扩增产
物 ∀分别设计并合成扩增 µ²¯…和 µ²¯≤的特征 °≤•
引 物 o µ²¯… 引 物 } °t} xχ Š≤×≤×׊≤„Š×2
Š≤ׄŠ„×××vχ~°u} xχŠ„„ŠŠ×Š„„Š≤×≤≤×≤×≤vχ∀
µ²¯≤ 引物 } °t} xχ≤×≤≤׊„≤„×≤„„„≤×≤Š×≤vχ~
°u} xχ׊≤××≤Š„Š×ׄ׊ŠŠ×„≤„vχ∀反应总体积
ux ˏk反应成分 }ts ≅ …∏©©¨µu1x ˏoux °°²¯# pt
 ªu n t1x ˏots °°²¯ # pt §‘×° t ˏoux ±ª#
ˏpt前后引物各 u ˏo ts ±ª# ˏpt ⁄‘„ x ˏo x
˜# ˏpt的 פ´ 酶 t ˏlo反应物混匀后 o加入适量
的矿物油覆盖 o扩增反应在 …Œ’ ∞ׄ• 型 °≤• 仪上
进行 ∀扩增程序为 }|w ε 预变性 v °¬±o|w ε t °¬±~
x{ ε ws ¶~ zu ε t °¬±ovs个循环 ~zu ε 延伸 ∀反
应结束后 o将样品置于 w ε 的冰箱 o放置片刻 o在扩
增产物中分别加入 x ˏ加样缓冲液 ≈|{h去离子甲
酰胺 ots °°²¯# pt ∞⁄ׄk³‹ {1slos1suxh二甲苯
青 ƒƒos1suxh溴酚蓝  o混匀后各取 z ˏ在 t1sh
的琼脂糖凝胶上 k预先加入溴化乙锭 ∞…lo用 x ∂ #
¦°pt电压梯度恒压电泳大约 t «k电泳缓冲液为 t ≅
ׅ∞lo用 …Œ’ו „⁄凝胶成像系统成像并观察实验
结果 ∀
11216 毛状根基本培养基的筛选和生长速度的测
定 基本培养基的筛选 }取等量已除菌的毛状根分
别接种在 tru ≥o• «¬·¨o…x和  ≥的无激素培养基
上 o在 ux ε !光照 ts «!光照强度 t xss ¬¯条件下培
养 ovx §后收集毛状根分别进行鲜质量和干质量测
定 ∀鲜质量以布氏漏斗抽虑至无水滴下时测得 o干
质量以 ys ε 烘干至恒重后测得 ∀
毛状根的生长速度测定 }取相同重量除菌完全 !
生长速度快的毛状根接入于无激素的 tru ≥液体
培养基中 o每 xs °三角瓶中装培养液 vx °o每 w
§测 t次鲜质量 o每次测定 v瓶 o以测定的平均质量
为指标绘制毛状根的生长量曲线 k毛状根的生长
量 €收获毛状根鲜质量 p接种毛状根鲜质量 l∀
11217 盐酸小檗碱含量测定 盐酸小檗碱的提取 }
将川黄柏的未转化的组培苗 !愈伤组织和毛状根在
xx ε 下烘干至恒重后 o精确称量 u1ss ª置于索氏提
取器中 o加入甲醇冷浸过夜 o水浴回流提取至无色 o
将提取液转入旋转蒸发器中蒸掉多余的甲醇 o最后
用甲醇定容至 ux °∀用 ‹°≤测定各样品提取液 o
并利用外标法计算各样品中盐酸小檗碱含量 ∀
色谱条件 }日本岛津 ≤ 2y„~色谱柱 ’⁄≥ ≤t{柱
kw1y °° ≅ uxs °°l~柱温 ux ε ~处理器 ≤ p • v„~
流动相 s1ssu x °²¯ 磷酸溶液 k用三乙胺调 ³‹
v1s ? s1tl2乙腈 kzxΒuxl~流速 t °# °¬±pt ~检测
波长 uzz ±°∀
2 结果和分析
211 毛状根的诱导
由表 t可知 ow种发根农杆菌浸染川黄柏的下
胚轴和带芽下胚轴外植体都能不同程度的诱导出毛
状根 o但不同菌株的诱导率不同 ~从 vx §后的统计
结果显示 o„×≤≤tx{vw菌株的毛状根诱导率最高为
vt1wsh o • tsss诱导率最低仅 z1yuh ∀川黄柏所
产生的毛状根较粗 o有浓密的白色根毛 o生长迅速 o
多数无向地性 o有向上 !贴壁向上或沿培养基表面生
长的特性 ∀将诱导的毛状根切下置于无外源激素的
tru ≥培养基中培养 o毛状根能自主生长 o并形成
较多分枝 ∀而未经农杆菌浸染的川黄柏外植体 k对
照 l在其他条件相同的情况下连续培养 vx §后 o有
uh的外植体产生根 o但形成的根具向地性 !生长速
度慢 !根毛少 o不能在无外源激素的 tru ≥培养基
中自主生长 o并随培养时间的延长而逐渐褐变死亡 ∀
这是因为非转化根中不含有发根农杆菌 ×2⁄‘„上
携带的 µ²¯ 基因和生长素合成酶基因 k·°¶to
·°¶ul≈y  o因此不能分泌出生长素来满足自身生长的
需求 o而通过转化的毛状根则可以 ∀
表 t w种不同农杆菌对川黄柏毛状根的诱导结果
菌株
处理外植
体数 r个
产生毛状根
外植体数 r个
毛状根
诱导率 rh
„×≤≤tx{vw tut v{ vtqws
„w |w t| usqut
• tsss tsx { zqyu
• tyss |z tz tzqxv
对照 tss u uqss
实验结果说明发根农杆菌诱导率与其所含 • ¬
质粒的类型有密切关系 ∀不同发根农杆菌对川黄柏
植物毛状根的诱导率是不同的 o其中川黄柏植物对
„×≤≤tx{vw菌株最为敏感 o所以 o以下的研究均选
用 „×≤≤tx{vw菌株进行 ∀
212 „×≤≤tx{vw对不同外植体转化的影响
用 „×≤≤tx{vw对川黄柏子叶 !下胚轴 !带芽下
胚轴 !幼茎 !根 !叶柄不同部位的外植体进行感染诱
#wx{t#
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导 ovx §后统计毛状根的诱导率 ∀从表 u结果显示 o
带芽下胚轴毛状根诱导率最高为 wv1suh o而子叶 !
叶柄和根未能诱导出毛状根 ∀
表 u 川黄柏不同外植体的毛状根诱导率
感染外植
体部位
感染外植
体数 r个
产生毛状根
外植体数 r个
毛状根
诱导率 rh
根 zs s s
带芽下胚轴 {y vz wvqsu
下胚轴 {s tx ttqzx
幼茎 z| tt tvq|u
子叶 tss s s
叶柄 {| s s
由此可见 o川黄柏不同部位外植体对
„×≤≤tx{vw农杆菌 • ¬质粒具有不同的敏感性 ∀一
般认为 o幼嫩的植物材料 o细胞分裂越活跃 o对农杆
菌的感染越敏感 ∀但是 o从多次重复试验结果可知 o
幼嫩的子叶 !叶柄和根并未能诱导出毛状根 ∀
213 毛状根的 °≤• 检测
µ²¯…和 µ²¯≤是发根农杆菌 • ¬质粒 ×2⁄‘„左臂
上的 u个生根基因 o从图 t可见 o利用合成的 µ²¯…和
µ²¯≤引物 o能够从川黄柏毛状根的总 ⁄‘„中分别扩
增到 xws ¥³和 zzs ¥³左右的特异性 ⁄‘„片段 o该
片段与作为阳性对照的 „×≤≤tx{vw农杆菌 • ¬质粒
⁄‘„中扩增出的特异性片段大小一致 ~而从川黄柏
非转化植物的总 ⁄‘„中扩增不到此类片段 ∀这说
明发根农杆菌 „×≤≤tx{vw含有的 µ²¯…和 µ²¯≤基因
已整合入川黄柏毛状根基因组中 ∀
图 t 川黄柏毛状根 °≤• 扩增产物的凝胶电泳
t1⁄‘„  ¤µ®¨ µ~ uov1毛状根 µ²¯≤~ w1 • ¬tx{vw µ²¯≤ ~ x1非转
化根 µ²¯≤~ yoz1毛状根 µ²¯…~ {1 • ¬tx{vw µ²¯…
214 毛状根生长培养基的筛选及生长曲线的测定
从表 v可知 o川黄柏毛状根在不同的培养基中
生长 o其生物量的积累是不同的 ∀在 tru  ≥培养基
中毛状根生长最好 o鲜质量和干质量均达到最大 ∀
此结果与笔者在川黄柏植物组织培养中筛选出的生
根培养基是一致的 o由此说明了植物毛状根在生长
过程中对培养基成分的需求与普通根基本是一致
的 ∀由图 u可知 o川黄柏毛状根在 tru  ≥的液体培
养基中生长呈 / ≥0型曲线 ∀毛状根在前 tu §生长较
慢 o在 tu ∗ uw §生长速率大幅度提高 ouw §时达到
最大 ∀以后由于毛状根开始出现老化现象 o颜色变
褐色 o生长量随时间延长而出现下降的趋势 ∀由此
可以确定川黄柏毛状根最适的继代时间在 uw §左
右 ∀
表 v 不同培养基对毛状根生长的影响
培养基种类 毛状根鲜质量 rª 毛状根干质量 rª
 ≥ yqxz ? sqyw sqvu ? sqsvt
tru  ≥ zqzy ? sq{z sqvz ? sqsvz
…x yqs{ ? sqyx squ| ? sqsu|
• «¬·¨ xq|{ ? sqzx sqvt ? sqsuw
图 u 毛状根的生长曲线
215 毛状根 !组培苗和愈伤组织中盐酸小檗碱的含
量测定
提取川黄柏毛状根 !未转化的组培苗和愈伤组
织中的盐酸小檗碱 o并用 ‹°≤测定各样品中盐酸
小檗碱的含量 o结果如表 w所示 ∀测定结果显示 o川
黄柏毛状根中盐酸小檗碱含量为 t1vwyh o均高于
组培苗和愈伤组织 o而且毛状根中盐酸小檗碱含量
是愈伤组织的 z1z{倍 ∀
表 w v种材料中盐酸小檗碱的含量
材料种类 含量 rh
毛状根 tqvwy
组培苗 tquvt
愈伤组织 sqtzv
3 讨论
发根农杆菌的种类 o被感染植物外植体类型以
及生理状况等方面的因素差异 o使农杆菌 ×2⁄‘„插
入植物基因组的位置 !长度和拷贝千差万别 ≈z  ∀本
实验用 • tysso„×≤≤tx{vwo• tssso„w等 w种发根
农杆菌感染川黄柏的外植体 o结果发现 „×≤≤tx{vw
菌株对川黄柏外植体的浸染能力最强 ∀同时还得
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知 o„×≤≤tx{vw农杆菌 • ¬质粒对川黄柏 y种不同部
位外植体具有不同的敏感性 o这主要是因为农杆菌
• ¬质粒的 ×2⁄‘„转移进入植物基因组中是一个非
常复杂的过程 o它通常涉及到外植体细胞的各种生
理状态和伤口部位细胞的脱分化能力 o具体来说与
细胞受伤后的创伤生理反应 !细胞内源激素水平和
细胞壁的结构等因素有关 ∀从转化过程看 o农杆菌
感染外植体主要在切口部位 o即使是老的外植体 o如
果在内外源激素的作用下 o伤口附近的细胞易脱分
化形成较多的感受态细胞 o也是有利于农杆菌诱导
毛状根产生 ∀从试验结果可知 o川黄柏带芽下胚轴
外植体诱导率最高 o为不带芽下胚轴外植体的 v1yy
倍 ~并且发现毛状根产生的部位主要集中在带芽下
胚轴的形态学下端 o这可能是由于芽是生长素的合
成场所 o带芽的下胚轴能不断合成生长素 o并通过极
性运输送到近根端 o因此其近根端的生长素含量比
不带芽的下胚轴更高 o其发根能力也就更强 ≈{  ∀同
一植物不同组织细胞对农杆菌感染的敏感性差异在
其他植物中也有报道 ≈|ots  ∀这与本试验的结果是相
一致的 ∀
≈参考文献  
≈t  ≤«¬¯·²±  ⁄o × ³¨©¨µ⁄ „o ° ·¨¬·„o ·¨¤¯q „ªµ²¥¤¦·¨µ¬∏° µ«¬½²2
ª¨ ± ¶¨¬±2¶¨µ·¶×2⁄‘„ ¬±·²·«¨ ª¨ ±²° ¶¨²©·«¨ «²¶·³¯¤±·µ²²·¦¨¯¯¶
≈ q ‘¤·∏µ¨o t|{uo u|x} wvuq
≈u  常振战 q • ¬质粒转化植物用于生产天然活性成分的研究进
展 ≈ q中草药 o t||{o u|ktsl}zsxq
≈v  赵东利 o张春广 o王新宇 o等 q发根农杆菌对苦豆子高频转
化条件的优化 ≈ q药物生物技术 oussuo|kwl}uusq
≈w  ≤ ¤¯µ®  ≥q ° ¤¯±·°²¯ ¦¨∏¯¤µ¥¬²¯²ª¼2¤ ¤¯¥²µ¤·²µ¼ °¤±∏¤¯≈  q北
京 }高等教育出版社 o t||{q
≈x  ≥¤°¥µ²²® o ƒµ¬·¶¦«∞ ƒo  ¤±¬¤·¬¶×q  ²¯ ¦¨∏¯¤µ¦¯²±¬±ª} „ ¤¯2
¥²µ¤·²µ¼ °¤±∏¤¯≈  1u±§ §¨1‘¨ º ≠ ²µ®} ≤²¯§ ≥³µ¬±ª‹¤µ¥²µ¤2
¥²µ¤·²µ¼ °µ¨¶¶o t|{|q
≈y  ¬¤±ª o ≤«¨ ± ÷ ≠ o ¬± ≥ o ·¨¤¯ q„§√¤±¦¨ ²©¶·∏§¬¨¶²±
Αγροβαχτεριυµ ρηιζογενεσ • ¬³¯¤¶°¬§µ²¯ ª¨ ± ¶¨¤±§·«¨ ¬µ¤³³¯¬¦¤2
·¬²± ©²µ©²µ¨¶··µ¨¨ ª¨ ± ·¨¬¦ ¬°³µ²√ °¨ ±¨·≈  q ≤«¬± …∏¯¯ …²·o
ussuo t|kyl} yxsq
≈z  ⁄¤√¬§≤o ° ·¨¬·„ o × °¨³¨ q ×2⁄‘„ ¯¨ ±ª·«√¤µ¬¤¥¬¯¬·¼ ¬± °¤±±²2
³¬±¨«¤¬µ¼µ²²·} °²µ¨ ·«¤± xs ®¬¯²¥¤¶¨ ³¤¬µ¶²©³• ¬×2⁄‘„ ¦¤± ¬±2
·¨ªµ¤·¨ ¬± ³¯¤±·¦¨¯¯¶≈ q ° ¤¯±·≤¨¯¯• ³¨o t|{{o z} |uq
≈{  黄菊辉 o周长久 o秦凤琴 o等 q发根农杆菌 • ¬2⁄‘„对茎用芥
菜的遗传转化 ≈ q植物学报 ot||wo vyktul}|ttq
≈|  徐香玲 o李伟华 o李集临 q • ¬质粒转化番茄的初步研究 ≈ q
生物技术 o t||vovktl}usq
≈ts  徐子勤 o贾敬芬 q红豆草 ‘°×µ基因转化率的建立和影响转
化的因素 ≈ q兰州大学学报 k自然科学版 lo t||wo vsk增
刊 l}tsyq
Ηαιρψ ροοτσ ινδυχφιον οφΠηελλοδενδρον χηινενσε ανδ
προδυχτιον οφ ιτσαχτιϖε χονστιτυεντσ
• „‘Š ≠ ∏¨ 2«∏¤t o Š’˜ ÷¬¤²2­∏±t o • ˜ ¬¨u o ≠ „‘ • ±¨2½«¤²o  „ ÷¬¤±2­∏±o ≠ „‘Š ≠¬
(t1 ∆επαρτµ εντ οφ ΒιολογιχαλΕνγινεερινγ , Χηενγδυ Υνιϖερσιτψ, Χηενγδυ ytstsy, Χηινα;
u1 Σιχηυαν Αχαδεµ ψ οφ ΑγριχυλτυραλΣχιενχε, Χηενγδυ ytssyy, Χηινα )
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ ¬±·µ²§∏¦¨ ·«¨ «¤¬µ¼ µ²²·¶²©Πηελλοδενδρον χηινενσε ¤±§§¨ ·¨µ°¬±¨·«¨ ¦²±·¨±·²©¬·¶¤¦·¬√¨¦²±¶·¬·∏2
±¨·¶1Μετηοδ : ×µ¤±¶©²µ° §¨«¤¬µ¼ µ²²·¶²©Π1 χηινενσε º µ¨¨ ²¥·¤¬± §¨ ¥¼ ·«¨ ·µ¤±¶©²µ°¤·¬²± ²©Αγροβαχτεριυµ ρηιζογενεσ „wo • tysso
„×≤≤tx{vw ¤±§• tsss1 Ρ εσυτλτ ανδ Χονχλυσιον: Œ·º¤¶¦¯ ¤¨µ¯¼ §¨ °²±¶·µ¤·¨§·«¤·×2⁄‘„ ²©Α1 ρηιζογενεσ • ¬³¯¤¶°¬§º¤¶¬±·¨ªµ¤·¨§
¬±·²·«¨ ¦¨¯¯¶²©«¤¬µ¼ µ²²·¶¥¼ °≤• 1 ׫¨ ¦²±·¨±·²©¥¨ µ¥¨ µ¬±¨«¼§µ²¦«¯²§µ¬§¨ o º«¬¦« º¤¶§¨ ·¨µ°¬± §¨¥¼ ‹°≤o º¤¶«¬ª«¨ µ¬± «¤¬µ¼
µ²²·¶·«¤± ·«¤·¬± ·«¨ ¤¬¨ ±¬¦³¯¤±·¨·¤±§¦¤¯ ∏¯¶1
[ Κεψ ωορδσ] Πηελλοδενδρον χηινενσε~ «¤¬µ¼ µ²²·¶~ ¥¨ µ¥¨ µ¬±¨«¼§µ²¦«¯²§µ¬§~ Αγροβαχτεριυµ ρηιζογενεσ
≈责任编辑 张宁宁  
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