全 文 ：六味地黄汤对佐剂性关节炎大鼠脾脏细胞
表达细胞因子的影响
方 鉴 o张永祥 o茹祥斌 o魏小龙
k军事医学科学院 毒物药物研究所 o北京 tss{xsl
≈摘要  目的 }观察六味地黄汤k• l对佐剂性关节炎k„„l大鼠脾脏辅助 × 细胞k׫l的作用 o并与免疫抑制
剂环磷酰胺k≤¼l !环孢素 „k≤¶„l进行比较 ∀方法 }运用定量 °≤ • 技术 o检测 „„大鼠脾脏 × 淋巴细胞因子 Œƒ‘2Χo
Œ2u oŒ2w和 Œ2ts 的 °• ‘„的表达水平 ∀结果 }„„大鼠脾淋巴细胞 Œ2u °• ‘„ 表达水平与对照组相比有增高
趋势 ~Œƒ‘2ΧoŒ2w和 Œ2ts °• ‘„的表达水平则明显降低 ∀口服 • 对 „„ 大鼠脾细胞的表达水平则具有明显提
高作用 o与 ≤¼和 ≤¶„相比具有明显不同的特点 ∀结论 }• 可能对 „„大鼠脾脏表达的细胞因子水平有调节作用 o
提示 • 可纠正 ׫tr׫u亚群功能的平衡紊乱 ∀
≈关键词  佐剂性关节炎 ~多聚酶链式反应 ~六味地黄汤 ~细胞因子 ~辅助 × 细胞
≈中图分类号  • u{x qx ≈文献标识码  … ≈文章编号  tsst2xvsukusstlsu2stu{2sw
自身免疫病是严重危害人类健康的常见和难治
性疾病之一 o目前尚无满意的治疗药物 ∀不少补益
中药临床用于自身免疫性疾病的治疗 o取得了良好
的疗效 ∀补益中药毒副作用小 o适合于长期用药 o提
示其在防治自身免疫性疾病方面具有较大的前景 ∀
六味地黄汤k• l是中医滋补肾阴的经典代表名方 o
在现代临床医疗中亦被应用于多种自身免疫性疾病
的治疗 o如红斑狼疮 !类风湿性关节炎 !血小板减少
性紫癜等≈t  ∀我们以往研究表明 o• 对自身免疫
引起的佐剂性关节炎大鼠k„„ 大鼠l的踝关节肿胀
具有明显的消肿作用 o降低空肠弯曲杆菌致敏小鼠
k≤小鼠l血清自身抗体的水平 o同时对其免疫功能
紊乱具有明显的纠正作用 ∀目前关于 • 的作用机
制尚不清楚 ∀
近年来已有许多研究提示 o辅助 × 细胞亚群
׫t与 ׫u功能平衡失调与自身免疫病的发生具有
密切关系≈u ov  ∀因此 o调节或恢复辅助 × 细胞亚群
的机能平衡可能是防治自身免疫病的重要途径之
一 ∀由于 × 细胞表达的许多细胞因子在一定程度代
表着 × 细胞的功能 o所以本研究以 „„大鼠为模型 o
运用反转录 °≤ • 技术 o对脾脏 × 淋巴细胞表达的因
子 Œƒ‘2ΧoŒ2u oŒ2w及 Œ2ts的 °• ‘„水平进行了
≈收稿日期  t|||2s{2ux
≈基金项目  国家自然科学基金kv|xzs{xtl及/九五0攀登计划
预选项目资助项目 o国家重点基础研究发展规划项目kŠt|||sxwwstl
检测 o并与免疫抑制剂 ≤¼和 ≤¶„ 进行了比较 o从辅
助 × 细胞亚群平衡的角度研究了 • 的作用机理 ∀
1 材料与方法
111 实验动物
• ¬¶·¤µ大鼠 o雄性 otys ∗ uss ªo军事医学科学
院动物中心提供 ∀
112 主要试剂
六味地黄汤k• l由本所植化室按传统方法制
备 o经过滤 !减压浓缩 !灭菌后保存于 w ε 备用 ∀卡
介苗 o卫生部生物制品检定所 ~环磷酰胺k≤¼l o上海
华联制药厂 ~环孢素 „k≤¶„l o瑞士山德士制药厂 ~Β2
¤¦·¬±oŒ2u oŒ2w oŒ2ts oŒƒ‘2Χ引物 o上海生工生物
工程公司合成 ~总 • ‘„提取试剂盒 !逆转录试剂盒 !
פ´ ⁄‘„聚合酶kx sss ˜#ptl !§‘×°kts °°²¯ #
ptl !琼脂糖 o°µ²° ª¨¤公司 ∀
113 实验方法
11311 „„ 大鼠模型及给药方法 „„ 大鼠模型制
备参见文献≈w 进行 o取羊毛脂与石蜡油ktΒul o加热
混匀 o高压灭菌后 w ε 保存 o使用时加入卡介苗kts
°ª# °¯ p tl o配制成弗氏完全佐剂k≤ƒ„l o大鼠右足
垫皮内注射ks qsx °¯ r只l致敏大鼠 ∀ „„ 大鼠于致
敏后第 z天给予 • o≤¼口服和 ≤¶„ 腹腔注射 o剂
量分别为 { ª#®ªp t ots °ª#®ªp t及 x °ª#®ªp t o连续
tw §∀于致敏后 uu §取脾细胞提取总 • ‘„ 进行半
定量 • ×2°≤ • 实验 o检测细胞因子 °• ‘„ 的表达水
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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平 ∀
11312 总 • ‘„ 提取≈x  大鼠断头取脾 o制备细胞
悬液 o取 x ≅ tsz 的细胞离心 o置于 x °¯ 的厚壁离心
管内 o加预冷的异硫氰酸胍变性溶液 t °¯ o匀浆 ∀加
‘¤„¦ku °²¯#pt o³‹w qsls qu °¯ o酚2氯仿2异戊醇混
和液 t °¯ o震荡 ow ε ots sss µ#°¬±p t离心 us °¬±∀
吸取上清 o加等容积异丙醇 op us ε 放置 u «以上 os
ε ots sss µ#°¬±p t离心 tx °¬±∀吸去上清 o向沉淀
中加 t °¯ 变性溶液 o搅拌至 • ‘„溶解 ∀加 ‘¤„¦ku
°²¯#pt o³‹ w qsl s qt °¯ o酚2氯仿2异戊醇混和液 t
°¯ o震荡 ow ε ots sss µ#°¬±p t离心 us °¬±∀上层水
相转移到 x °¯ 离心管中 o加等容积异丙醇 op us ε
放置 u «以上 os ε ot sss µ#°¬±p t离心 tx °¬±o以预
冷的 zx h乙醇洗涤沉淀 o并按前法离心 !吸去乙醇 o
在真空器中干燥沉淀 tx °¬±o用 t °¯ 无 • ‘„ 酶的
水溶解沉淀 op us ε 保存备用 o同时进行紫外定量 ∀
11313 逆转录反应 在 s qx °¯ ∞³³¨ ±§²µ©管中加
入µ• ‘¤¶¬± kw ≅ tsz ˜#pt s qx Λ¯ o’ ¬¯ª² k§·l tx 引
物k s qx ª#ptl t Λ¯ o总 • ‘„ u Λªo ª≤ u¯kux °°²¯
#ptlw Λ¯ ox ≅ 逆转录缓冲液 w Λ¯ o„  ∂ 逆转录酶
ku qx ≅ tsz ˜#ptls qy Λ¯ o补加无 • ‘„ 酶的水至总
反应容积为 us Λ¯ o混匀 owu ε 反应 t «o|y ε x °¬±
终止反应 o冰浴冷却 x °¬±op zs ε 保存 ∀
11314 引物的设计及 °≤ • 反应 本实验选用 Β2
¤¦·¬±为对照 o根据文献报道≈y  o在 Β2¤¦·¬±oŒ2u oŒ2
w oŒ2ts oŒƒ‘2ª¤°°¤序列的 xχ ovχ分别设计上下游
引物 oΒ2¤¦·¬±} xχ ¦·¤·¦ªª¦¤¤·ª¤ª¦ªª··¦vχ o xχ ¦··¤ª2
ª¤ª··ªªªªª·ªª¦·vχ o片段长度为 zyu ¥³~Œ2u }xχª¦ª2
¦¤¦¦¦¤¦··¦¤¤ª¦¦¦·vχ oxχ¦¦¤¦¦¤¦¤ª··ª¦·ªª¦·¦¤vχ o片段长
度为 vxt ¥³~Œ2w }xχ ¤·ª¦¤¦¦ª¤ª¤·ª···ª·¤¦¦vχ oxχ
···¦¤ª·ª··¦·ª¤ª¦ª·ªª¤vχ o片段长度为 uzx ¥³~Œ2ts }
xχ. ·ª¦¦··¦¤ª·¦¤¤ª·ª¤¤ª¤¦·vχ o xχ ¤¤¤¦·2
¦¤··¦¤·ªª¦¦··ª·¤vχ o片段长度为 vwy ¥° ~Œƒ‘2ª¤°°¤}
xχ¦¦¦·¦·¦·ªª¦·ª··¤¦·ª¦vχ oxχ¦·¦¦····¦¦ª¦··¦¦··¤ªvχ o片段
长度为 wt| ¥³∀在 s qx °¯ ∞³³¨ ±§²µ©管中依次加入
灭菌水 vw qzw Λ¯ ots ≅ °≤ • 缓冲液 x Λ¯ o ª≤ u¯kux
°°²¯#ptlx Λ¯ ow ≅ §‘×°kts °°²¯#ptlt Λ¯ o细胞
因子或 Β2¤¦·¬± ku qx Λ°²¯ #ptlvχ和 xχ端引物各 u
Λ¯ o逆转录产物 u Λ¯ ooפ´ ⁄‘„ 聚合酶kx sss ˜#
ptl s qux Λ¯ o混匀 ∀覆盖石腊油 ws Λ¯ o稍加离心 o
|x ε 变性 v °¬±∀反应程序 }|w ε 变性 t °¬±oxx ε
退火 t °¬±ozu ε 延伸 t °¬± vs ¶o周期为 vw个循
环 o最后 zu ε 延伸 ts °¬±≈z  ∀
11315 凝胶电泳 吸取 tu Λ¯ °≤ • 产物 o加入 v Λ¯
的凝胶载样缓冲液 o在 u h的琼脂糖凝胶k∞…浓度
为 s qy Λª# °¯ p tl ot ≅ ׅ∞缓冲液电泳 o电泳结果经
扫描后进行图像数据分析 o以细胞因子rΒ2¤¦·¬±的比
值反映细胞因子的 °• ‘„表达水平 ∀
11316 统计学处理 所有实验数据均以均数 ? 标
准差k ξ ? σ)表示 ,组间显著性检验采用 τ检验进
行 ∀
2 实验结果
„„大鼠 Œ2tsrΒ2¤¦·¬±与 Œƒ‘2ΧrΒ2¤¦·¬±的比值
明显低于正常对照组 o提示 „„大鼠脾细胞 Œ2ts和
Œƒ‘2Χ °• ‘„的表达水平较正常对照组明显降低 ∀
≤¼对 „„大鼠脾细胞 Œ2ts的表达水平具有明显的
升高作用 o对 Œƒ‘2Χ的表达水平也有一定的提高 o但
与正常对照组相比无统计学显著性差异 ∀ ≤¶„ 对
Œ2ts的表达有一定的提高作用 o但与正常对照组相
比无统计学显著性差异 o对 Œƒ‘2Χ °• ‘„ 的表达则
表现为进一步降低 ∀与 ≤¼和 ≤¶„ 不同 o给予 •
对 „„大鼠 Œ2ts及 Œƒ‘2Χ °• ‘„的表达水平均具
有明显提高作用 o其中对 Œƒ‘2Χ °• ‘„ 表达的增高
作用尤为明显 ∀
对脾细胞 Œ2u 和 Œ2w °• ‘„ 的检测结果表
明 o„„大鼠脾细胞 Œ2u的表达水平与正常对照组
相比有一定的升高 o但无统计学差异 ~Œ2w的表达则
显著降低 o低于检测限 o检测不出 ∀ ≤¼处理组 „„
大鼠脾细胞 Œ2u表达水平较 „„ 对照组明显增高 o
对 Œ2w的表达具有提高作用 ∀ ≤¶„对 „„大鼠脾细
胞 Œ2u的表达具一定的抑制作用 o但与 „„ 对照组
相比无统计学显著性差异 ~对 Œ2w的表达则具有明
显的提高作用 ∀与 ≤¼及 ≤¶„不同 o• 对 „„大鼠
脾细胞 Œ2u的表达具有明显的抑制作用 o对 Œ2w的
表达则具有明显的促进作用 ∀Œ2ts oŒƒ‘2ΧoΒ2¤¦·¬±
与 Œ2u oŒ2w oΒ2¤¦·¬±反转录2°≤ • 产物凝胶电泳见
图 t o表 t为对凝胶电泳图进行图象分析的结果 ∀
3 讨论
本研究发现 o„„ 大鼠脾细胞 Œƒ‘2Χ °• ‘„ 的
表达水平较正常对照组明显下降 oŒ2u的表达则比
正常对照组轻度升高 o但无统计学差异 ∀已知二者
均为 ׫t 所分泌的细胞因子 o因而提示 „„ 大鼠
׫t功能异常 ∀Œ2w 和 Œ2ts 由 ׫u 分泌 o„„ 大
鼠 Œ2w及 Œ2ts °• ‘„的表达水平均较对照组明
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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表 t • o≤¶„及 ≤¼对 „„大鼠脾脏细胞表达细胞因子 °• ‘„的影响
组别 剂量r °ª#®ªp t ≅ § Œ2tsrΒ2¤¦·¬± Œƒ‘2ΧrΒ2¤¦·¬± Œ2urΒ2¤¦·¬± Œ2wrΒ2¤¦·¬±
正常对照组 t qst ? s qvt s q{{ ? s qts s q|w ? s qs| t quv ? s qwu
„„对照组 s qw{ ? s qs|tl s qyv ? s qs|tl t quv ? s qus stl
„„ n ≤ ≠ ts ≅ tw u qt{ ? s qx{ul s q{u ? s qs{ u qtw ? s quvul s qtx ? s qsuul
„„ n ≤¶„ x ≅ tw s qyz ? s qtz s qv{ ? s qsx t qs{ ? s quw s qzy ? s qutul
„„ n • {sss ≅ tw t qsw ? s qvtul u q{v ? t quzul s quz ? s quwul t qs{ ? s qysul
注 }≠共进行 v次实验 ξ ? σ ν € v t) 与正常对照组相比 Π s qsx ul与 „„对照组相比 Π s qsx
图 t Œ2ts oŒƒ‘2ΧoŒ2u oŒ2w oΒ2¤¦·¬±的 °≤ • 产物凝胶电泳结果
t q正常对照组 u q关节炎大鼠对照组 v q关节炎大鼠 ≤¶„治疗组
w q关节炎大鼠 ≤¼治疗组 x q关节炎大鼠 • 治疗组
显降低 o提示其 ׫u功能低下 ∀因此 o„„大鼠 ׫tr
׫u功能的平衡机制存在明显障碍 o与其自身免疫
的发生具有密切关系 ∀
Œƒ‘2Χ曾被认为是自身免疫病发病过程中的一
种炎性因子 o但最近有研究表明亦不尽然 o用抗
Œƒ‘2Χ单抗治疗自身免疫小鼠k  • r¯ ³µl发现病情
没有任何改善≈{  ∀临床研究发现 Œƒ‘2Χ对 • „病人
有一定的治疗效果≈|  o因此 Œƒ‘2Χ被认为更有可能
作为一种调节因子而不是炎性因子在自身免疫病中
发挥有益作用 ∀已有许多研究表明 Œ2u在 • „病人
的血液及关节滑液中大量增加≈ts  o除了作为炎性因
子损伤关节滑膜之外 o也可能参与了免疫平衡紊乱
的病理过程 ∀因此 oŒ2u的大量增加对维持机体免
疫机能的平衡可能是一个不利因素 ∀Œ2ts对 ׫t
细胞分泌 Œ2u oŒƒ‘2Χ等因子具有抑制作用 ∀大量
的研究提示 Œ2ts在免疫应答过程中发挥负调节作
用 o对于调节和维持机体免疫机能平衡 !防止某些自
身免疫病的发生具有重要作用 ∀如在糖尿病 ……大
鼠胰岛区曾发现有 Œ2ts°• ‘„ 水平的异常变
化≈tt  oŒ2ts 对 ∞„∞大鼠的症状具有明显改善作
用≈tu  ∀Œ2w对自身免疫病的发生亦具有抑制作用 o
临床试验发现 Œ2w对 • „等自身免疫病具有治疗作
用 ∀因此 oŒ2w和 Œ2ts水平的降低与自身免疫病
的发生具有密切关系 ∀
六味地黄汤临床不仅被应用于自身免疫病的治
疗 o同时也被应用于肿瘤等表现为免疫功能低下疾
病的治疗 ∀实验药理学研究发现 o• 对多种原因
所致免疫功能低下均具有明显的改善作用≈tv  o提示
• 对免疫功能具有调节作用 ∀因此 o• 对自身免
疫性疾病的防治是基于其免疫调节作用 o但关于
• 对自身免疫病所表现的免疫功能紊乱的作用机
理还有待深入研究 ∀本研究结果表明 o• 对 „„大
鼠脾细胞 Œƒ‘2Χ °• ‘„ 的表达具有明显促进作用 o
对 Œ2u°• ‘„的表达则具有显著抑制作用 ~对 Œ2w
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和 Œ2ts°• ‘„的表达则具有明显促进作用 ∀与 ≤¼
和 ≤¶„相比 o• 具有明显不同的特点 o在所观察的
剂量条件下 o≤¼对 „„ 大鼠已有增高趋势的 Œ2u
°• ‘„的表达具有明显促进作用 o但对Œƒ‘2Χ和Œ2
w °• ‘„表达水平低下的提高作用不明显 ∀ ≤¶„ 则
对 Œ2ts °• ‘„的表达水平低下提高作用不明显 o
对 Œƒ‘2Χ °• ‘„表达水平进一步降低 o反映了二者
免疫抑制剂的一些作用特点 ∀以上结果提示 o•
可能影响 „„大鼠脾脏 ׫t细胞表达细胞因子的水
平 o发挥纠正机体平衡紊乱的作用 o这也可能是 •
临床防治自身免疫性疾病药效的重要机理之一 ∀由
于自身免疫病的发生机理复杂 o影响因素多 o• 的
作用可能是多方面的 o其更为深入的作用机理有待
进一步研究 ∀
≈参考文献 
≈t  聂 伟 o张永祥 1 六味地黄方的现代药理学研究进展 1 中药药
理与临床 ot||{ otwkxl }wt q
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׫tr׫u ≤¼·²®¬±¨ °¤··¨µ±¶¤±§·«¨ „µ·«µ¬·²ª¨ ±¬¦ • ¶¨³²±¶¨ ¬±
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‘¨ ∏µ²¬°°∏±²¯ ot||x oyt }tsz q
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中国药理学报 ot||z ot{ }wzt q
≈y  ¬¶¤  ≥ o ’µ¯¼ „ „ o ≤¤·«¨µ¬±¨ ƒ q ≤²¯ ¤¯ª¨ ±2Œ±§∏¦¨§ „µ·«µ¬·¬¶¬±
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≈tv  聂 伟 o张永祥 o茹祥斌 o等 1 六味地黄汤活性部位 ≤ „w的抗
肿瘤作用研究 1 中草药 ot||| ovsk增刊l }tut q
Εφφεχτ οφ Λιυωει ∆ιηυανγ ∆εχοχτιον , ον τηε Χψτοκινε Εξπρεσσιον
ιν Σπλενοχψτεσιν ΑΑ Ρατσ
ƒ„‘Š ¬¤±o ‹ „‘Š ≠²±ª2¬¬¤±ªo • ˜ ÷¬¤±ª2¥¬±o • ∞Œ ÷¬¤²2¯ ²±ª
kŒ±¶·¬·∏·¨ ²© °«¤µ°¤¦²¯²ª¼ ¤±§ ײ¬¬¦²¯²ª¼ o „¦¤§¨ °¼ ²© ¬¯¬·¤µ¼  §¨¬¦¤¯ ≥¦¬¨±¦¨¶o…¨ ¬­¬±ª tss{xs o≤«¬±¤l
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ׫¨ ©¨©¨ ¦·²©¬∏º ¬¨⁄¬«∏¤±ª§¨¦²¦·¬²± k• l ²±·«¨ ©∏±¦·¬²± ²©¶³¯ ±¨¬¦× «¨ ³¯¨µ
¦¨¯¯¶k׫l º¤¶¶·∏§¬¨§¤±§¦²°³¤µ¨§ º¬·«·«²¶¨ ²©·«¨ ¬°°∏±¨ ¬±«¬¥¬·²µ¶¶∏¦«¤¶¦¼¦¯²³«²¶³«¤°¬§¨ k≤¼l ¤±§
¦¼¦¯²¶³²µ¬± „ k≤¶„l ¬± „„ µ¤·¶q Μετηοδσ: ׫¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²© °• ‘„ ©²µŒƒ‘2ΧoŒ2u oŒ2w ¤±§Œ2ts ¬±
¶³¯ ±¨¬¦×2¼°³«²¦¼·¨¶²© ¤§­∏√¤±·¤µ·«µ¬·¬¶k„„l µ¤·¶ º¤¶ √¨¤¯∏¤·¨§ ∏¶¬±ª µ¨√ µ¨¶¨ ·µ¤±¶¦µ¬³·¬²± ³²¯¼° µ¨¤¶¨
¦«¤¬± µ¨¤¦·¬²± k• ×2°≤ • l ·¨¦«±¬´∏¨ qΡεσυλτσ: °• ‘„ ¬¨³µ¨¶¶¬²±¯¨ √¨¯ ²©Œ2u «¤§¤·¨±§¨ ±¦¼·²¨¯ √¨¤·¨ o¥∏··«¨
°• ‘„ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¯¨ √¨¯¶²©Œƒ‘2ΧoŒ2w ¤±§Œ2ts º µ¨¨ ¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼ §¨¦µ¨¤¶¨§¬± „„ µ¤·¶¬± ¦²°³¤µ¬¶²± º¬·«
¦²±·µ²¯ ªµ²∏³¶q• ·µ¨¤·° ±¨·¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼¬±«¬¥¬·¨§·«¨ °• ‘„ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©Œ2u ¤±§³µ²°²·¨§·«¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²±
²©Œƒ‘2ΧoŒ2w ¤±§Œ2ts ¬± ¶³¯ ±¨²¦¼·¨¶²© „„ µ¤·¶oº¬·«¤± ²¥√¬²∏¶¦«¤µ¤¦·¨µ¬¶·¬¦¤¶¦²°³¤µ¨§ º¬·«·«¤·²© ≤¼
²µ≤¶„ qΧονχλυσιον : • ¦¤±¦²µµ¨¦··«¨ ¬°§¬©©¨ µ¨±·¥¤¯¤±¦¨ ²©·«¨ ©∏±¦·¬²±¶²©¶³¯ ±¨²¦¼·¨ ׫tr׫u¬± „„ µ¤·¶q
[ Κεψ ωορδσ] ¤§­∏√¤±·¤µ·«µ¬·¬¶~ • ×2°≤ • ~¬∏º ¬¨⁄¬«∏¤±ª§¨¦²¦·¬²±~¦¼·²®¬±¨ ~ × «¨ ³¯¨µ¦¨¯¯
≈责任编辑 方文贤 
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