全 文 ：试管地黄诱导技术的研究
薛建平 o石乐义 o张爱民
k淮北煤炭师范学院生物系 o安徽 淮北 uvxsssl
≈摘要 目的 }研究小植株离体条件下试管地黄诱导的最佳培养基和培养条件 ∀方法 }选用地黄/ {x2x0为试
验材料 o研究了植物激素 !蔗糖浓度 !活性炭和日照时间等对地黄试管苗不定根的形成及膨大的影响 ∀结果与结
论 }将试管苗先在 tru ≥ n
t °ª#p t的培养基中诱导生根后 o转入诱导培养基中 o根可膨大形成试管地黄 o其
最适诱导培养基为 ≥ n y2
u °ª#p t n s qt °ª#p t n蔗糖 x h o最适培养条件为 ux ε !光照 u sss ∗ v sss
¬¯ otu «#§p t o培养基中不宜添加活性炭和 v ∀
≈关键词 地黄 ~不定根 ~块根 ~试管地黄 ~诱导
≈中图分类号 ≥ xyz ≈文献标识码
≈文章编号 tsst2xvsukussultt2s{uw2sw
地黄 Ρεηµ αννια γλυτινοσα q为玄参科多年生
药用草本植物 o其新鲜块根或块根的加工品作为鲜
地黄 !生地黄和熟地黄入药 o是我国著名的/四大怀
药0之一 o其产品远销港澳 !东南亚和日本等国 o在国
际市场上享有盛誉≈t ∀ 5神农本草经6中将其列为
上品 o具有滋阴生津的功效 o是临床应用十分广泛的
药物之一 ∀我国大部分地区均有地黄种植 o一般其
主产于河南省的武陟 !温县 !孟县 !沁阳 !博爱k即古
怀庆府l等地 ∀但由于在生产中长期采用块根营养
繁殖 o易受多种病害的侵袭 o其中以病毒侵害最为严
重 o通常田间感染率达 tss h o病毒在植物体内代代
相传 o致使地黄品种退化 o表现为块根变细 !产量下
降 !质量变差 o从而直接影响药农和国家的经济效
益 ∀对于地黄病毒病的防治至今还没有特效药物 o
目前利用茎尖脱毒培养技术是解决地黄病毒病的最
根本途径≈u ∀我国地黄茎尖培养起步较早 o毛文岳
等率先进行了脱毒研究 o并培育出了/茎尖 ty号0新
品种 o日本的赤野地黄也实现了脱毒苗生产 o其产量
和有效成分均高于病感地黄≈v ∗ x ∀但脱毒苗在大
田栽培过程中 o第 t年就有 vs h ∗ xs h再度感染病
毒 ou ∗ v年就要更新 t次种苗 o并且脱毒苗的繁殖
系数小 !成活率低 !育苗周期长 o运输极不便利 o从而
大大限制了其在农业生产上的推广 ∀近年来 o随着
≈收稿日期 ussu2sy2us
≈通讯作者 电话 }ksxytlv{suuux ∞2°¤¬¯}¬∏¨³usss ¼¤2
«²²q¦²° q¦±
植物生物技术的发展 o人们先后在试管中诱导出了
半夏 !马铃薯 !芋等 o试图尝试来替代试管脱毒苗 o其
中试管马铃薯的培养技术日趋成熟 o完全可以替代
试管苗作为商品供应≈y ∀但试管地黄的研究国内
外尚未见报道 o因此本研究开展了试管地黄的诱导
研究工作 ∀试管地黄作为一种休眠和繁殖的器官 o
可直接种植于地中 o减少育苗所需时间 o并且其成活
率远远高于脱毒苗 o且其成本低 !运输便利 o如果结
合无土栽培技术 o有可能成为脱毒苗应用于生产的
对接技术 o从根本上降低脱毒苗生产成本 ∀诱导试
管地黄的形成 o也为研究地黄块根形成的机理提供
了一种较为直观和方便的手段 ∀
1 材料和方法
1 q1 材料 地黄栽培品种/ {x2x0 o采自焦作市温
县农科所 o经本院生物系郭传友先生鉴定为玄参科
植物地黄 Ρ . γλυτινοσα的新鲜块根 ∀
1 q2 培养基及培养条件 选用 ≥基本培养基 o
蔗糖浓度v h o用s qz h 的琼脂固化 o³值x q{ ∗
y qs o分装于 tss °三角烧瓶 o在 tut ε 湿热灭菌
tx °¬±~材料接种后放在光照培养箱中 o培养温度
kux ? tl ε o光照 u sss ∗ v sss ¬otu «#§p t ∀
1 q3 无菌苗的获得 从田间挖取地下块根 o流水
冲洗干净 o于超净工作台上 o用 zs h酒精表面消毒
vs ¶o再用 tu h的双氧水和 s qt h的升汞混合液对
块根消毒 ts °¬±o然后用无菌水冲洗 x ∗ y次 ∀将带
芽眼的部分切成小块放入添加了不同种类和浓度的
tru ≥培养基中 o在光照培养箱中培养 ∀
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1 q4 幼苗的增殖培养 待无菌苗长至约 u ¦°时
自基部切下 o移至 ≥ n y p
t °ª#p t n
s qt °ª#pt培养基中 o在光照培养箱中进行继代增
殖培养 ∀
1 q5 幼苗的生根培养 当在增殖培养基中的苗
高至 u ∗ v ¦°时 o自基部切下 o移至 tru ≥ n
t
°ª#pt培养基中 o放在光照培养箱中进行生根培
养 ∀
1 q6 试管地黄诱导培养 当地黄幼苗的根长 s .x
∗ t ¦°时 o及时转至试管地黄诱导培养基中 o光照
时间分别设定为 { «#§p t ots «#§p t和 tu «#§p t o培
养温度为kux ? tl ε o观察试管地黄诱导情况 ∀
2 结果
2 q1 无菌体系的建立 地黄/ {x2x0的带芽眼小块
在 tru ≥ otru ≥ n y2
t °ª#pt o ≥ n ×s qx
°ª#pt n v s qx °ª#pt和 ≥ n v t °ª#p t
w种培养基中 ous §后均可获得 v ∗ w片叶的小苗 o
其中以 ≥ n × s qx °ª#p t n v s qx °ª#pt成
苗最多 o可见 v具有打破休眠 o促进萌发的作用 ∀
而在 ≥ n × s qx °ª#p t n s qt °ª#pt组
合的培养基中 o块根有白色根长出 o说明 的加
入有利于根的形成而不利于芽的萌发 ∀
2 q2 幼苗试管地黄的诱导
2 q2 q1 植物激素对幼苗不定根形成及膨大的影响
不定根的形成和膨大是试管地黄形成的前提 ∀
将继代培养的幼苗切成单株 o转入添加了不同植物
激素的培养基中 ous §后观察植株的生长情况k见
表 tl ∀试验结果表明 o当 浓度超过 s qx °ª#
pt后 o随着其浓度的进一步提高 o植株基部愈伤
化 o苗细弱 o叶片肿胀呈水浸状 o玻璃化现象严重 o植
株上即或有少量气生根产生 o但未见膨大 o说明在试
管地黄诱导过程中 o 浓度不宜过高 ∀另外 o随
着培养基中 y2
浓度的升高 o幼苗基部和腋芽可
形成丛芽 o但苗细弱 ~v 虽然有利于苗的伸长 o但
和高浓度的激素配合使用易引起玻璃化严重≈z ∀
因而诱导小植株气生根的形成和膨大 o宜选择低浓
度的 和低浓度的 y2
组合 ov 不宜添加 o
以 ≥ n y2
u °ª#p t n s qt °ª#pt效果
较好 o植株生长健壮 o幼苗可产生大量气生根 o但仅
有部分气生根可膨大形成试管地黄k图 tl ∀
图 t 部分气生根膨大
表 t 植物激素对植株试管地黄形成的影响
激素组合
y2
v
植株生长及试管地黄诱导情况
s qx s qt ) 幼苗健壮 o有大量气生根产生 o部分气生根接触培养基后膨大
s qx s qx t 幼苗长势良好 o植株长出少量不定根 o但未见膨大
s qx t qx t 幼苗长势差 o大部分叶片肿胀加厚 o有少量不定根形成 o未彭大
s qx u qs t 幼苗长势差 o出现玻璃化现象 o基部愈伤化 o未见不定根产生
t qs s qt ) 幼苗健壮 o有大量气生根产生 o部分气生根接触培养基后膨大
t qx s qt ) 幼苗健壮 o产生大量气生根 o部分气生根接触培养基后膨大
t qx s qx t 幼苗叶片肿胀 o出现轻度玻璃化 o不定根少 o未膨大
t qx t qx t 幼苗叶片肿胀 o出现玻璃化现象 o未见不定根形成
t qx u qs t 幼苗玻璃化现象严重 o基部大量愈伤化 o未见不定根形成
u qs s qt ) 幼苗健壮 o有大量气生根产生 o仅有少量气生根接触培养基后膨大
v qs s qt ) 幼苗生长健壮 o可产生少量气生根 o个别气生根接触培养基后膨大
v qs s qx t 幼苗健壮 o基部轻微愈伤化 o可产生少量气生根 o未见不定根膨大
v qs t qx t 幼苗基部叶片肿胀 o轻度玻璃化 o基部愈伤化 o未见不定根的形成
v qs u qs t 幼苗出现玻璃化现象 o基部愈伤化严重 o有少量气生根产生未膨大
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2 q2 q2 蔗糖浓度对试管地黄形成的影响 在以
≥ n y2
u °ª#pt n s qt °ª#pt的基本培
养基中 o分别添加 v h ox h和 { h的蔗糖 o将继代培
养的幼苗丛芽切成单株接种于上述 v种培养基中进
行光照培养 ous §后观察发现 o和 v h蔗糖浓度的培
养基相比 o在含 x h和 { h蔗糖的高糖培养基中 o幼
苗叶片深绿平展 o苗不伸长 o处于生长抑制状态 o植
株仅有 t ∗ u个不定根产生 o但均可膨大 o形成试管
地黄 o且发育良好 o说明高糖培养有益于根的膨大
k图 ul ∀进一步实验 o我们把继代培养的苗切成单
株先在 tru ≥ n
t °ª#pt培养基中培养 ov ∗
x §后即可在苗基部诱导出 v ∗ x条长 t ∗ t qx ¦°的
不定根 o然后将已生根的苗即时转入到 x h和 { h的
上述高糖培养基中 ou §后部分不定根即明显开始
膨大 oy §后几乎所有的不定根都膨大形成试管地
黄 o苗基部未伸长的根原基也出现膨大 o而且苗生长
良好 o叶片深绿平展 o未见叶片枯死黄化现象k图
vl ∀因而高浓度的蔗糖虽抑制了幼苗腋芽和顶芽的
生长 o但对不定根膨大形成试管地黄起着至关重要
的作用 o培养基以 ≥ n y2
u °ª#pt n s qt
°ª#pt n x h蔗糖为最好 ∀
图 u 高糖培养不定根膨大
图 v 所有不定根膨大
2 q2 q3 v对试管地黄形成的影响 在 ≥ n y2
u °ª#pt n s qt °ª#pt n x h蔗糖的培养
基中 o添加 t °ª#pt的 v o将在生根培养基中已
诱导出根的单株转入其中 ov §后发现根均能膨大
形成试管地黄 o但当 y §后 o试管地黄膨大速度减缓
或停滞 o部分地黄表皮破裂愈伤化 ovs §后 o试管地
黄可进一步长出不定芽 ∀因而结合表 t 的试验结
果 o在试管地黄的诱导过程中 o不宜添加 t °ª#p t
的 v o而在试管地黄的成苗中可以考虑加入 v o
因为 v有打破休眠的作用≈z ∀
2 q2 q4 活性炭对试管地黄诱导的作用 在 ≥ n
y2
u °ª#pt n s qt °ª#p t n x h 蔗糖和
≥ n y2
v qs °ª#pt n s qt °ª#pt n x h
蔗糖的培养基中均添加 s qx h的活性炭 o然后将诱
导生根的单株转入上述 u种培养基中 ov §后均未见
根膨大 ovs §后仍不见根膨大 o只是见到根进一步
伸长插入培养基中 o且根上有大量的根毛 o植株生长
仍然健壮 o未见叶片枯黄衰老现象 ∀因而活性炭虽
然对根的伸长和生长有利 o但不利于块根的形成和
膨大 ∀
2 q2 q5 光照时间对试管地黄诱导的作用 将已
生根的单株转入高糖培养基中诱导试管地黄 o分别
在不同的光照培养箱中予以 tu «#§p t ots «#§p t和
{ «#§p t的光照时间 o发现在 { «#§p t情况下 o第 x §
才开始膨大 o且膨大的速度明显慢于 tu «#§p t的光
照时间 o因此试管地黄的诱导予以 tu «#§p t的长日
照为宜 ∀
3 讨论
地黄地下的药用成分 o过去的一些文献资料称
呼不一 o有称为块茎或根茎 o有称为块根 o那么仅从
我们的试验结果来看 o应称为块根植物 ∀
植物激素 !日照时间 !蔗糖浓度和活性炭对不定
根的发生及试管地黄的形成均有重要作用 o但经过
多次试验 o发现几者之间并没有明显的互作关系 o而
是彼此影响着块根形成的不同阶段 ∀块根的形成前
提必须首先有不定根的发生 o低浓度的 y2
和
配合使用可诱导植株产生不定根 ~为了更高效
地获得不定根 o将植株转移到附加有
t °ª#p t
的 tru ≥培养基上直接诱导大量不定根的产生 o可
以说是一条经济方便的捷径 ∀不定根形成后 o高浓
度的蔗糖可加速不定根的膨大和试管地黄形成的质
量 o但蔗糖浓度过高 o由于培养基渗透压过高 o则同
时会影响到小植株本身的营养吸收和光合效率 o以
x h为宜 ∀活性炭的添加对不定根的膨大有负面影
响 o是活性炭强烈吸附了培养基中的激素的缘故 o还
是其它方面的原因 o有待进一步研究 ∀
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大田栽培中不定根膨大形成地黄的分子机制 o
知之甚少 ∀在块根植物甘薯的块根形成中有详细的
资料报道 ∀ ≥³²µ¤°¬±作为一种在甘薯块根中特异
表达的贮藏蛋白 o是块根形成的一种生化标志 o对甘
薯块根形成具有重要的影响 o即在甘薯植株的发育
过程中 o块根一旦发生 o便在发生部位伴随着大量
≥³²µ¤°¬±的合成 o块根形成期间 o≥³²µ¤°¬±的含量
不断增加≈{ ~蔗糖诱导 !光合产物积累对 ≥³²µ¤°¬±
基因具有正调控作用≈| ∀另外 o≥³²µ¤°¬±基因的表
达还能接受
信号的诱导而提高表达水平 ov
则阻遏其表达≈ts ∀我们的试验也发现增加光照时
间 !高浓度的蔗糖均有利于地黄不定根的膨大 o而
v对块根的膨大有一定的负面效应 o那么在地黄
块根中是否存在着和甘薯类似的块根特异性基因 o
是否有相同的分子调控机制 o值得更加深入的研究 ∀
≈参考文献
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≈| «·¤¶o ¤··²µ¬ × o ²µ¬®¤°¬ q ¬ª«2¯ √¨¨¯ ∞¬³µ¨¶¶¬²± ²©
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«²µ°²±¨ ¶o¦²±¦¨±·µ¤·¬²± ²©¶∏¦µ²¶¨ o¤¦·¬√¨¦¤µ¥²± ¤±§ ¬¯ª«··¬°¨¬±©¯∏¨ ±¦¨§©²µ°¤·¬²± ²©¤§√ ±¨·¬·¬²∏¶µ²²·¤±§ °¬¦µ²·∏¥¨µ ιν ϖιτρο
©µ²° ³¯¤±·¯¨·²© Ρεηµ αννια γλυτινοσα k{x2xl qΡεσυλτ ανδ Χονχλυσιον : × «¨ ³¯¤±·¯¨·¶º µ¨¨ ¦∏¯·¬√¤·¨§²±·«¨ ° §¨¬∏° ²© °¬¦µ²·∏¥¨µ¬±2
§∏¦·¬²± ¤©·¨µµ²²·¶º µ¨¨ ¬±§∏¦¨§²±·«¨ tru ≥ ° §¨¬∏° º¬·«
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·¬√¨¦¤µ¥²± ¤±§ v ¶«²∏¯§±²·¥¨ ¤§§¨ §·²·«¨ ° §¨¬∏° o º«¬¦« º¤¶±²·¶∏¬·¤¥¯¨©²µ·«¨ ¬±§∏¦·¬²± ²© °¬¦µ²·∏¥¨µq
[ Κεψ ωορδσ] Ρεηµ αννια γλυτινοσα ~·∏¥¨µ²∏¶µ²²·~¤§√ ±¨·¬·¬²∏¶µ²²·~ °¬¦µ²·∏¥¨µ~¬±§∏¦·¬²±
≈责任编辑 袁桂京
本刊重要启事
为加快稿件刊用周期及扩大期刊信息量 o本刊将自 ussv年起调整页码 o由 ussu年的 {s页增加为 |y页 o杂志售价由 ts
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