全 文 ：鼓槌石斛组织培养研究
徐 红 o刘 峻 o王峥涛 o徐德然 o丁家宜
k中国药科大学 中药学院 o江苏 南京 utssv{l
≈摘要  目的 }建立鼓槌石斛快速繁殖体系 ∀方法 }组织培养 o虫荧光素2荧光素酶生物发光法及苯酚2硫酸法 ∀
结果 }胚在光照及黑暗条件下均可以萌发 o但苗的生长需要光照条件 o ≥ otru  ≥ o…x o‘y培养基对苗的生长均比较
适宜 os qx °ª#p t ‘„„ 与 t °ª#p ty2…„ 利于鼓槌石斛组培幼苗的生长与分化 ∀三磷酸腺苷k¤§¨ ±²¶¬±¨ ·µ¬³«²¶
³«¤·¨ o„× °l在鼓槌石斛培养时发生节律性变化 ∀组培苗多糖含量 z quxw h o原植物为 u q{vv h ∀结论 }光照对胚的
萌发没有影响 o分化出幼苗后 o培养基中的激素 !氮源及有机元素对苗的生长及分化有较大的影响 o因此要及时将
苗转移到附加 ‘„„与 y2…„的  ≥ otru  ≥ o…x o‘y培养基中 ∀ „×°可作为鼓槌石斛培养时的动态指标 o反应其发
育过程中对营养和能量的需求 ∀组培苗的多糖高于原植物 ∀
≈关键词  鼓槌石斛 ~组织培养 ~多糖 ~„× °
≈中图分类号  • u{u qu ~≥ xyz ≈文献标识码  … ≈文章编号  tsst2xvsukusstlsy2svz{2sw
石斛是一种传统的贵重中药材 o有悠久的应用
历史 ∀石斛种子自然条件下繁殖率低 o通常采用营
养繁殖 o但是该方法周期长 o存活率低 o一定时期内
提供的种苗量有限 ∀近年来 o国内外对石斛中的一
些珍贵种类进行了组织培养及商品生产研究 o但尚
未形成规模≈t  ∀我国的石斛药材主要来自野生资
源 o长时间的过量采集 o造成石斛的采集量远大于生
长量 o使野生资源量急剧下降 o难以满足日趋增长的
需求量 ∀因此迫切需要对石斛进行大量繁殖 o在满
足药材生产的同时保护生物多样性 ∀鼓槌石斛是目
前黄草石斛商品市场中的主流品种之一 o又称小爪
黄草≈u  o在我国仅产于云南 o化学成分及药理活性研
究表明 o鼓槌石斛中含有鼓槌菲 !毛兰素等抗肿瘤活
性成分≈v ∗ x  o开发应用前景广阔 o因需求量的增加 o
其资源也面临短缺的局面 ∀为此 o对野生鼓槌石斛
进行了胚培养和快速繁殖研究 ∀
1 材料 !仪器与试剂
1 q1 材料
鼓槌石斛 ∆ενδροβιυ µ χηρψσοτοξυ µ ¬±§¯ q采自
云南西双版纳 ∀
1 q2 仪器与试剂
≥‹ Š2≤ 生物化学发光测量仪k上海上立检测仪
厂l o旋涡混合器k上海环宇仪器厂l o{ss型离心沉
淀器k上海手术器械厂l o≥‹Š2≤ 微机工作站 o˜ ∂2
≈收稿日期  usss2tu2t|
zxw分光光度计k上海第二分析仪器厂l ∀标准 „×°
粉k≥¬ª°¤公司l o荧光素2荧光素酶 o荧光素酶系缓冲
液k购自中科院上海植物生理研究所l o重蒸苯酚 o其
余试剂均为分析纯 ∀
2 方法 !结果与分析
2 q1 方法
2 q1 q1 胚培养
取生长良好未开裂的果实 o用 zs h酒精擦拭表
面 o然后依次用 x h次氯酸钠消毒 !无菌蒸馏水冲洗
后 o切开果实 o用接种勺将胚均匀的播撒于各种培养
基上 ∀培养基 ³‹ x q{ ∗ y qs o培养温度kux ? tl ε o
每日光照 ts ∗ tu «o光照强度 t yss ∗ u sss ¬¯∀
2 q1 q2 „×°的提取及含量测定≈y oz 
2 q1 q2 q1 „×°标准曲线的制定 吸取 uss Λ¯ 不同
浓度的 „×°标准液及无 „×°的空白对照液kuss Λ¯
s qsx °²¯ #p t ×µ¬¶2盐酸缓冲液l于反应池内 o注入
{ss Λ¯ 荧光素酶液 o启动发光 o记录发光强度 ∀以发
光强度的对数值为纵坐标 o„×°浓度的指数为横坐
标 o制作标准曲线 ∀结果表明 „×°在 tsp tu ∗ tsp |
°°²¯#p t呈良好的线性关系 ∀ Ψ € s .{zuysy Ξ n
tu .yusxxw , ρ € s .|| ,回收率 € tuz .w % , ΡΣ∆ €
t .ux%( ν € vl ∀
2 q1 q2 q2 „×°的提取 定量称取待测样品 o加入
适量 s qsx °²¯#pt³‹ z qy ×µ¬¶2盐酸缓冲液 o在沸水
浴中匀浆抽提ts °¬±后 o冷却至室温 ∀然后以uss
µ# °¬±p t离心 tx °¬±o吸取上清液用 ×µ¬¶2盐酸缓冲
#{zv#
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≤«¬±¤²∏µ±¤¯ ²© ≤«¬±¨ ¶¨ ¤·¨µ¬¤  §¨¬¦¤
∂ ²¯ quy o‘²qy
∏±¨ ousst
液定容至 x °¯ o待测 ∀
2 q1 q3 多糖的含量测定k苯酚2硫酸比色法≈{ l
标准曲线的制作 }标准葡萄糖为对照品 o回归方
程 Ψ € z .uwu ≅ tsp v Ξ n s .stuzx , ρ € s .|||y ,换算
因素 φ € t qxtz ∀
样品提取 }鼓槌石斛原植物 !组培苗 ys ε 干燥 o
研成细粉 ∀{s h乙醇热提除杂质 o然后用蒸馏水提
取多糖 ∀
2 q2 结果与讨论
2 q2 q1 光照条件对胚培养的影响
取成熟种胚接种于 tru  ≥培养基上 ows §后 o
胚开始膨大 o逐渐萌发形成圆形的原球茎 oys §后 o
原球茎顶端产生叶原基突起 o发育成幼叶 ∀胚在不
同的光照条件下培养的结果见表 t ∀
从表 t可以看出 o鼓槌石斛成熟胚的培养以光
照条件下为好 o但光照对胚的萌发率影响不大 o而对
原球茎及幼苗的生长有较大的影响 ∀鼓槌石斛生长
在热带雨林高大乔木的树干上 o在自然条件下 o胚的
萌发依靠真菌供给营养 o与光照关系不大 o在分化出
原球茎及幼叶等绿色组织后 o生长速率加快 o仅仅依
靠真菌供给的营养已不能满足生长的需要 o需在光
照条件下进行光合作用 o自身合成营养物质 o供植物
生长发育 ∀因此在进行离体培养时 o必须在胚发育
出原球茎及幼叶时应及时给予适当的光照 o以满足
生长发育的需要 ∀
2 q2 q2 培养基种类对幼苗生长的影响
表 t 光照对鼓槌石斛胚萌发及生长的影响
光照条件 胚萌发率r h 苗况
暗培养 {{ 胚及萌发出的原球茎 !幼叶一直呈淡黄色 o叶片不舒展 o苗生长缓慢 o最后死亡
暗培养 ys §后转入光培养 |s 胚发育出幼叶后 o转入光照条件下 o幼叶渐变绿 o生长发育成的小苗较弱
光照培养 {z 胚在膨大萌发过程中变为绿色 o幼叶色绿 o小苗整齐 !粗壮
为寻找适合鼓槌石斛幼苗生长的合适培养基 o
将在光照条件下萌发培养 v个月 o具 t ∗ u片叶子的
小苗及时转入到不同的培养基中 o经过两个月的培
养 o生长情况见表 u ∀
小苗转入上述培养基后 o经过 tx ∗ us §的适应 o
苗变的挺拔 o表明开始进入生长期 oys §后 o在不同
培养基上生长的苗况不一样 o从表 u 可以看出 o ≥ o
表 u 不同培养基对苗生长的影响
培养基
苗高
r¦°
叶片
数
苗况 根数
 ≥ t qw v ∗ w 叶色浓绿 o苗茁壮 t ∗ u
tru  ≥ t qx v ∗ w 叶色浓绿 o苗茁壮 t ∗ u
…x t qy v ∗ w 叶色浓绿 o苗茁壮 t ∗ u
‘y t qw v ∗ w 叶色浓绿 o苗茁壮 t ∗ u
Ž≤ t qu u ∗ v 叶色淡绿 o苗较细弱 t ∗ u
改良 • «¬·¨ t qs u ∗ v 苗从下部开始褐 t ∗ u
化 o株逐渐褐化死亡
tru  ≥ o…x o‘y培养基对苗的生长均比较适宜 o
而兰科植物常用的不含有机元素的 Ž≤ 培养基及硝
态氮低 !不含氨态氮的改良 • «¬·¨培养基对苗的生
长均不利 o说明有机元素和氮元素对苗的生长影响
很大 o是生长不可缺少的因素k见图 tl ∀
2 q2 q3 不同激素对苗生长的影响
将在光照条件下萌发培养 v个月 o具 t ∗ u片叶
子的小苗转入到附加不同激素的 tru  ≥培养基中 o
图 t 培养 |s §后的鼓槌石斛苗
考察激素对苗生长的影响 o经过两个月的培养 o苗的
生长情况见表 v ∀
表 v 不同激素对苗生长的影响kys §后l
tru  ≥ n不同激素
r°ª#p t
苗高
r¦°
叶片
数
苗况 根数
‘„„ s qx t qx{ v ∗ w 叶色浓绿 o苗茁壮 u ∗ v
y2…„ t qs t qxs w ∗ x 叶色浓绿 o苗茁壮 t ∗ u
Ž× t qs t qw{ v ∗ w 叶色浓绿 o苗茁壮 t ∗ u
u ow2⁄ s qt t qw| v ∗ w 叶色浓绿 o苗茁壮 t ∗ u
‘„„ s qx n y2…„ t qs t qxy w ∗ x 叶色浓绿 o苗茁壮 u ∗ v
植物激素对植物组织培养中器官的分化和发育
起着重要的调控作用 o激素试验表明 os qx °ª#p t
#|zv#
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中 国 中 药 杂 志
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∂ ²¯ quy o‘²qy
∏±¨ ousst
‘„„能加快根的分化 ot°ª#pty2…„对叶的分化有
利 ot °ª#ptŽ× 与 s qt °ª#p tu ow2⁄也能加快苗
的生长 o但以 s qx °ª#pt ‘„„ n t °ª#p ty2…„ 最
利于苗的分化与生长 ∀因此在培养基附加 s qx °ª#
pt‘„„与 t °ª#p ty2…„ 利于鼓槌石斛组培幼苗
的生长与分化 ∀
2 q2 q4 胚培养过程中能量物质 „×°的变化k图 ul
图 u 鼓槌石解 „×°的动态含量
„×°是生物体的能量/通货0及重要的代谢调节
物质 o与生命活动至关重要 ∀随着生物有机体的生
长发育 o„×°含量呈现出一定的变化趋势 o反映出生
物体的生长代谢情况 ∀为了掌握胚培养过程中对营
养的需求 o观察研究了能量物质 „×°的变化 ∀实验
结果发现鼓槌石斛种子在萌发前 o„×°的释放量较
少 o表明细胞代谢活动处于相对静止状态 o对营养的
需求较低 ovs ∗ ws §o种子由黄色变为绿色 o胚萌动 o
突破种皮 o萌发出原球茎 o„×°的释放量逐渐增加 o
表明细胞代谢活动逐渐由相对禁止期进入活跃期 o
植物对营养的需求逐渐增多 ~ys §原球茎发育出幼
叶时 o„×°的释放达到最高峰 ~ys §以后 o进入苗的
生长期时 o„×°的含量稍有下降 o但基本稳定 o表明
植物在这些时期一直进行着活跃的代谢活动 ∀因此
在进行鼓槌石斛培养时 o可以根据 „×° 的变化情
况 o结合苗的生物学特性 o给予适当的营养条件 o以
满足不同时期的植物对营养物质的需求 ∀
2 q2 q5 多糖的含量变化
近年来的研究表明 o植物中的水溶性多糖能增
强人体的免疫能力 o具有抗癌 !抗动脉硬化 !抗高血
压等多种生物活性 o石斛类药材中富含多糖类成分 o
其生理活性的强弱与多糖的含量有一定的关
系≈| ots  ∀试验结果表明鼓槌石斛组培苗的多糖含量
kz quxw h l高于原植物ku q{vv h l o从利用多糖的角
度 o有较大的应用前景 ∀
≈参考文献 
≈t  王康正 o范 磊 o高文远 o等 q药用石斛栽培的研究概况 q中国中
药杂志 ot||{ ouvkyl }vws q
≈u  马国祥 o徐国钧 o徐珞珊 o等 q商品石斛的调查及鉴定k ¶l q中
草药 ot||x ouykzl }vzs q
≈v  马国祥 o徐国钧 o徐珞珊 o等 q鼓槌石斛化学成分的研究 q药学学
报 ot||w ou|ktsl }zyv q
≈w  马国祥 o徐国钧 o徐珞珊 o等 q鼓槌石斛及其化学成分的抗肿瘤
活性研究 q中国药科大学学报 ot||w ouxkvl }uw q
≈x  王天山 o陆跃鸣 o马国祥 o等 q鼓槌石斛中化学成分对 Žxyu肿瘤
细胞株生长抑制作用体外试验 q天然产物研究与开发 ot||z o|
kul }t q
≈y  „¬¨ ¯ Ž²²³o° ·¨¨µ‹ q≤²±·¬±∏²∏¶…¬²¯∏°¬±¨ ¶¦¨±·²±¬·²µ¬±ª²©≤¼2
·²³¯¤¶°¬¦ „×° ¬± ≥¬±ª¯¨ Œ¶²¯¤·¨§ • ¤· ‹ ³¨¤·²¦¼·¨¶ ⁄∏µ¬±ª
 ·¨¤¥²¯¬¦°²¯¶²±¬±ªq…¬²¦«¨ ° t||v ou|x }tyx q
≈z  Ž²¶½¨ ª¬ × o Ž¨¯¯ µ¨°¤¼ µ¨  o Ž²√ ¦¨¶ ƒ o ·¨¤¯ q …¬²¯∏°¬±¨ ¶¦¨±·
²±¬·²µ¬±ª²© „×° • ¨¯ ¤¨¶¨ ©µ²° ‹∏°¤± • §¨…¯ ²²§≤¨¯ ¶¯×µ¨¤·¨§
º¬·« ‘²±¬²±¬¦ ⁄¨ ·¨µª¨ ±·q2≤ ¬¯±2≤«¨ °2≤ ¬¯±2…¬²¦«¨ ° t||{ o uy
ktsl }x|| q
≈{  李满飞 o徐国钧 o平田义正 o等 q中药石斛类多糖的含量测定 q中
草药 ot||s outktsl }tsz q
≈|  黄民权 o阮金月 q六种石斛属水溶性多糖的单糖组分分析 q中
国中药杂志 ot||z ouukul }zw q
≈ts  黄民权 o黄步汉 o蔡体育 o等 q铁皮石斛多糖的提取 !分离和分
析 q中草药 ot||w ouxkvl }tu{ q
Στυδιεσ ον Τισσυε Χυλτυρε οφ ∆ενδροβιυµ χηρψσοτοξυµ Λινδλιν ςιτρο
÷ ˜ ‹²±ªoŒ˜ ∏±o • „‘Š «¨ ±ª2·¤²o ÷ ˜ ⁄¨ 2µ¤±o⁄Œ‘Š ¬¤2¼¬
k≤«¬±¤ °«¤µ°¤¦¨∏·¬¦¤¯ ˜±¬√ µ¨¶¬·¼ o‘¤±­¬±ª utssv{ o¬¤±ª¶∏o≤«¬±¤l
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε:ײ ¶¨·∏³¤¶¼¶·¨° ©²µ·«¨ ¦∏¯·∏µ¨ ²© ⁄¨ ±§µ²¥¬∏° ¦«µ¼¶²·²¬∏° ¬± √¬·µ²q Μετηοδ :
׬¶¶∏¨ ¦∏¯·∏µ¨ o©¬µ¨ ©¯¼ ∏¯°¬±¨ ¶¦¨±¦¨ ¤±§³«¨ ±²¯2‹u≥’w ° ·¨«²§q Ρεσυλτ : ׫¨ ¨°¥µ¼² ¦²∏¯§ ª¨µ°¬±¤·¨ º¬·« ²µ
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·¬²±o¥∏··«¨ ³«¼·²«²µ°²±¨ o±¬·µ²ª¨ ±¶²∏µ¦¨ ¤±§²µª¤±¬½¨ §¨¯¨° ±¨·¶¤µ¨ ¬°³²µ·¤±··²·«¨ ªµ²º·«¤±§§¬©©¨ µ¨±·¬¤2
·¬²± ²©·«¨ ¶³µ²∏·º«¬¦«¶«²∏¯§¥¨ ·µ¤±¶©¨µµ¨§·²·«¨  ≥ otru  ≥ o…x o‘y ° §¨¬∏°¶¬±·¬°¨¶∏³³¯¨° ±¨·¨§ º¬·«
‘„„与 y2…„ o „×° °¤¼ ¥¨ ¶¨µ√ §¨¤¶·«¨ §¼±¤°¬¦¬±§¬¦¤·¬²± ²©±²∏µ¬¶«° ±¨·§¨ °¤±§¬±·«¨ ³¯¤±·q׫¨ ¦²±·¨±·
²©³²¯¼¶¤¦¦«¤µ¬§¨ ¬±·«¨ ¶³µ²∏·¬¶«¬ª«¨µ¤±§¦¤± ¥¨ ∏·¬¯¬½¨ §q
[ Κεψ ωορδσ] ∆ενδροβιυ µ χηρψσοτοξυ µ ~·¬¶¶∏¨ ¦∏¯·∏µ¨ ~³²¯¼¶¤¦¦«¤µ¬§¨ ~„×°
≈责任编辑 王康正 
蜜环菌不同发育阶段多糖成分的研究
陈晓梅 o郭顺星 o王秋颖 o肖培根
k中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所 o北京 tsss|wl
≈摘要  目的 }对蜜环菌不同发育阶段体内多糖的性质和含量进行研究 ∀方法 }提取 !分离 !纯化蜜环菌菌丝
体 !发酵液 !菌索和子实体多糖 o应用红外光谱分析法 !高效液相色谱法 !凝胶渗透色谱法和凝胶色谱法等方法测定
蜜环菌 w种多糖的性质 !多糖组成 !多糖含量和多糖分子量 ∀结果 }蜜环菌菌丝体和发酵液多糖为单一葡萄糖组成
的葡聚糖 ~菌索和子实体多糖由葡萄糖 !木糖组成 o这两种单糖在菌索多糖中的摩尔比为 tΒtw o在子实体多糖中的
摩尔比为 tΒts ∀蜜环菌多糖的分子量为 t万 ∗ z万 ∀蜜环菌不同发育阶段多糖含量分别为菌丝体含 | qss h ~发酵
液含 s q{zª#ktss °¯ l p t ~菌索含 t qtu h ~子实体含 u quz h ∀结论 }蜜环菌不同发育阶段多糖成分的研究 o为综合开
发利用蜜环菌提供了科学依据 ∀
≈关键词  蜜环菌 ~发育阶段 ~多糖
≈中图分类号  • u{u qy ~• u{w qt ≈文献标识码  … ≈文章编号  tsst2xvsukusstlsy2sv{t2sw
近年来 o药用真菌多糖的研究已引起人们的广
泛注意 ∀先后从香菇 Λεντινυσ εδοδεσ k…¨ µ®ql ° 2¨
ª¯ µ¨!冬虫夏草 Χορδψχεπσ σινενσισ k…¨ µ®¨ ¯¨ ¼l ≥¤¦¦q!
金顶侧耳 Πλευροτυσ χιτρινοπιλεατυσ ≥¬±ªq!槐耳
Τραµετεσ ροβινιοπηιλα  ∏µµq等药用真菌中分离出
多糖≈t ∗ w  o并对多糖的结构进行了研究 o药理实验证
明有些真菌多糖具有抗肿瘤活性≈x  ∀关于蜜环菌
Αρµιλλαρια µελλεα k∂¤«¯ q} ƒµql ± ∏¨¯q的化学成分
已有较多的研究 o仅从该菌中就分离得到 vs多个具
有原伊鲁烷骨架的倍半萜芳香酸酯≈y oz  ∀经药理学
研究证明 o原伊鲁烷倍半萜芳香酸酯类化合物均有
不同程度的抗菌作用≈{  ∀也有从蜜环菌子实体中分
离出多糖的报道≈|  ∀但这些化合物大部分分离自蜜
环菌培养的菌丝部分 o对于该菌不同发育阶段
≈收稿日期  usss2s|2sw
≈资助项目  国家自然科学基金资助项目kv|xzsstul
体内化学成分的变化未见资料报道 ∀本文主要研究
蜜环菌菌丝体 !发酵液 !菌索 !子实体中多糖的性质
和量的变化规律 o为该菌的发育学及应用研究提供
科学依据 ∀
1 实验材料与方法
1 q1 实验材料
菌丝体和发酵液 }蜜环菌 Α . µελλεα 液体发酵
培养 tv §o用尼龙网过滤分开菌丝体和发酵液 ∀菌
丝体用流水冲洗 o彻底去除培养基 oys ε 以下烘干 !
粉碎 !过 ws目筛 ~发酵液低温保存待用 ∀
菌索 }采自上述蜜环菌培养的菌索 oys ε 以下
烘干 !粉碎 !过 ws目筛 ∀
子实体 }采自上述蜜环菌培养的子实体 oys ε
以下烘干 !粉碎 !过 ws目筛 ∀
1 q2 方法
1 q2 q1 多糖的提取 !分离和纯化≈ts  精确称取蜜
环菌菌丝体粉 !菌索粉 !子实体粉各 ts ªo分别加入
#t{v#
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≤«¬±¤²∏µ±¤¯ ²© ≤«¬±¨ ¶¨ ¤·¨µ¬¤  §¨¬¦¤
∂ ²¯ quy o‘²qy
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