全 文 ：·1552· 中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年lo月
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899．
栽培黄连群体遗传关系的SRAP分析
陈大霞，李隆云，瞿显友，彭锐，钟国跃
(重庆市中药研究院，重庆400065)
擒 要：目的 揭示栽培黄连Coptischinensis群体的遗传关系。方法以24个不同来源地的栽培黄连群体为试材，采
用SRAP分子标记技术，用Treeconw软件分析遗传相似系数，UPGMA方法聚类，构建遗传系统树。结果36对引物
共得到276条扩增条带，其中有120条呈现多态性，占43．48％，从DNA分子水平显示出供试种质遗传多样性并不丰
富。遗传相似系数变化范围在0．877040．9519。聚类结果显示栽培黄连群体遗传关系与来源地无明显相关性，仅在
小分支中表现出一定的地域相关性。结论栽培黄连群体的遗传多样性水平较低。显示遗传背景较为单一．
关键词：黄连，相关序列扩增多态性；遗传关系
中图分类号：R282．2 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)10—1552—05
GeneticrelationshipamongpopulationsofcultivatedCoptischinensisrevealedbySRAP
CHENDa—xia，LILong—yun，QUXian—you，PENGRui，ZHONGGuo—yue
7(ChongqingAcademyofChineseMateriaMedica．Chongqing400065，China)
Abstract：ObjectiveTorevealthegeneticrelationshipamongopulationsofcultivatedCoptis
chinensis．MethodsTwentyfourpopulationsofcultivatedC．chinensisfromdifferenthabitatswere
employedtobeanalyzedbytheapproachofsequence—relatedamplifiedpolymorphism(SRAP)．Systematic
relationshipwasconstructedbasontheUPGMAmethodbyTreeconws ftware．ResultsAtotalof276
bandswerescored，amongwhich120werepolymorphicbands．Theaveragepercentageofpolymorphic
bandswas43．48％，indicatingtha hematerialsnthetesthavelowgeneticd versity．Geneticsimilarity
coefficientsw rechangedfrom0．8770to0．9519．Byclusteranalysis，thegeographicaldistributionwas
notveryobvious。butitwasalsoshowedsomeofthecultivatedC．chinensisfromthesameregionwerein
thesamegroup．ConclusionDifferentg rmplasmsdiversityofcultivatedC．chinensispopulationislower
andgeneticbackgroundismoresingle．
Keywords：CoptischinensisFranch．；sequence—relatedamplifiedpolymorphism(SRAP)；genetic
relationship
相关序列扩增多态性(sequence—related
amplifiedpolymorphism，SRAP)是由美国加州大
学Li和Quiros(1]发展起来的一种基于PCR的新型
分子标记。该标记采用独特的引物对ORFs(open
收藕日期：2008—01—04
基金项目：国家科技攻关计划资助项目(2004BA721A32)I国家中医药管理局攻关项目(国中医药科2004ZX06-1)·重庆市科技计划资助
项目(8847)
作者筒介t陈大霞(1968一)，女，重庆人，助理研究员，硕士，主要从事药用植物分子生物学研究．
Tell(023)89029190E—mail：17837@163．corn

万方数据
中草焉 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年10月· 553·
readingframes)进行扩增。上游引物对外显子进行
特异扩增，下游引物对内含子、启动子区域进行特异
扩增，因不同物种、不同个体的内含子、启动子与间
隔区长度不等而产生多态性。该标记操作简便、稳定
可靠，已在多种植物的遗传多样性研究方面显示出
其独特的优势[2~‘]。近年来已有将SRAP分子标记
运用于国内药用植物分类[副、遗传多样性研究[61等
方面的报道。
毛茛科多年生植物黄连Coptischinensis
Franch．是常用中药之一。具有泻火、解毒、清热、燥
湿和良好的抗菌作用。因而倍受国内外药学工作者
的关注，目前应用SRAP分子标记对黄连种质资源
进行研究尚未见报道。本实验采用SRAP技术对栽
培黄连群体的遗传关系进行研究，以期为黄连资源
的合理保护利用和新品种选育提供一些科学依据。
1材料和方法
1．1试验材料：黄连C．chinensisFranch．来源于
四川、重庆、陕西、湖北等主产地，均为人工栽培，共
24份材料(表1)，由重庆市中药研究院生药栽培室
李隆云研究员鉴定。根据均匀分布、随机取样原则进
行采样，尽量覆盖该地区的整个栽培范围。每个产地
各取5株以上生长了5年的成熟植株，采集当年萌发
的健康幼嫩叶片，低温下带回实验室洗净、晾干，冻
于--80℃超低温冰箱中备用。
裹1材料来源
Table1 Listofmaterialsusedinstudy
编号 来源 编号 来源
1 重庆石柱楠木磨子坪 13 重庆武隆羊角镇
2 重庆石柱悦昧镇 14 重庆江津四面山
3 重庆石柱三益乡 15 四川成都峨嵋黄连乡
4 重庆石柱龙潭乡 16 四川成都斜源镇
5 重庆石柱黄水镇 17 四川成都白鹿乡
6 重庆石柱粟新乡 18 陕西镇坪百家乡
7 重庆石柱枫木乡 19 陕西平利八仙镇
8 重庆石柱冷水乡 20 湖北利JII谋道镇
9 重庆黔江马嗽乡 21 湖北恩施太庙
10 重庆巫溪中鹿乡 22 湖北利川福宝山
11 重庆城口明中乡 z3 湖南桑植八大公山乡
12 重庆南川金佛山 24 湖南龙山大安乡
1．2方法
1．2．1 模板DNA的制备：每个产地黄连材料等量
混合，采用CTAB法提取基因组DNA，1％琼脂糖凝
胶电泳检测DNA的质量。用SmartSpecTM3000型分
光光度计(Bio—Rad公司)测定其浓度和质量分数，将
样品稀释为40ng／#L，置于一20℃冰箱中保存备用。
1．2．2 SRAP—PCR扩增：SRAP引物采用Li和
Quiros[1]已发表的引物。本研究所用引物序列见表
2。SRAP—PCR反应体系为：总反应体积25弘L，内含
1×PCR反应缓冲液，MgCl22．0mmol／L，dNTPs
200ttmol／L，正向和反向引物各0．2／LImol／L，
TaqDNA聚合酶1U，模板40ng，不足部分ddH20
补足。PCR扩增于EppendorfMastercycler固gradient
梯度PCR仪(Eppendorf)上进行。SRAP热循环程
序采用复性变温法，共40个循环，即94℃预变性5
rain；前5个循环：94℃变性1rain，35℃退火1rain，
72℃延伸1．5rain；后35个循环：94℃变性1min，50
℃退火1rain，72℃延伸1．5min；循环结束后72℃
延伸7min，4℃保存。
寰2本实验中所用的SRAP引物
Table2 SRAPPrIme噶usedin tudy
正向引物5’一3’ 反向引物5’---3’
TGAGTCCAAACCGGATA
TGAGTCCAAACCGGAGc
TGAGTCCAAACOGGAAT
TGAGTCCAAACCGGAcc
TGAGTCCAAACCGGAAG
TGAGTCCAAACCGGT从
TGAGTCCA从OCGGTCC
TGAGTCC从ACCGGTGc
TGAGTCCAAACCGGTAG
TGAGTCCAAACCGGCAT
TGAGTCCAAACCGGTcT
GACTGcGTACGAATTAAT
GACTGCGTACGAA下rrGc
GACTGcGTACG从竹GAC
GACTGCGTACGAArrrGA
GACTGCGTACGAATTAAC
ACTGcGTACGAATrGCA
A T(℃GTACGAATTcAA
ACTGcGTAcG从rrcTG
GACTGcGTACGAATTCGA
GACTGcGTACGAATTCAG
ACTGcGTACGAATTCCA
GACTGCGTACGAATTGAT
GACTGCGTAcGAAlvrCCT
1．2．3扩增产物电泳检测：扩增产物采用6％非变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。取2pL6×Loading
buffer与5弘L扩增产物混匀后上样，以0．5×TBE
为缓冲液，稳压150V，电泳至溴酚蓝距凝胶边缘2～
3cm处结束。银染检测电泳结果。
1．2．4SRAP数据处理：仅统计有差异、易于识别
的多态性条带，有带记为1，无带记为0，作0、1矩阵
输入计算机。采用Treeconw(Version1．3)分析软件
计算材料间遗传相似系数，按UPGMA(unweighted
pairgroupmethodarithmeticaverages)方法进行聚
类分析。
2结果与分析
2．1 引物筛选及SRAP标记的多态性分析：本研究
从70个SRAP引物组合中，筛选出谱带易于识别，
并呈现多态性的引物组合36对，对供试的24份材料
进行SRAP—PCR扩增，图1为引物组合me8一emll
的扩增图谱，扩增结果见表3。
SRAP反应扩增片段大部分集中在100-100
bp．在大于800bp的区域，扩增带多且密，不易辨
认，小于100bp的扩增带多数较弱，也不易辨认。在
1
Z
3
4
5
6
7
8
9加U地”
咖
眦
眦
锄
恤
恤
鼬
眦
眦
吼
唧
唧
哪
!2
3
4
5
6
7
8
9
1
1
眦
呲
眦
呲
眦
m
眦
毗
耻
m
眦

万方数据
·1554· 中草喃 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第lo期2008年10月
图1引物组合me8-emil的扩增图谱
(泳道序号对应供试材料见表1)
Fig．1ResultofPCRamplificationusingprimer
combinationofme8一emll(Lanenumber
issameasTable1)
100--800bp，扩增带易于辨认记录，故多态性带多
来自这部分。36对引物组合共产生276条扩增带，带
数在3～14不等，平均每对引物组合可产生7．67条
带。在这276条DNA扩增条中，有120条带呈多态
性，每引物可扩增出1～10条多态性带，平均每对引
物产生3．33条多态性带。每对引物组合产生的多态
性带的比例为12．50％～71．43oA，平均为43．48％。
以上统计结果表明：供试栽培黄连群体的多态性并
不丰富。
2．2遗传相似系数分析：用Treeconw软件计算供
试材料间的遗传相似系数。表4结果表明：湖南桑植
县八大公山乡与湖南龙山县大安乡之间的遗传相似
系数最高，为0．9519，表明二者的亲缘关系最近；重
裹3 SRAP引物组合、扩增带数及多态性带数
Table3 NumberoftotalndpolymorphicfragmentsperSRAPprimercombination
引物组合 总带散 多态性带数 多态性比率／％ 引物组合 总带数 多态性带数 多态性比率／％
mel_eml9 3 33．3 me5一eml 12 6 50．00
reel—em3 8 1 12．50 rne5一em4 5 3 60．00
reel—em5 5 l 20．00 me5一em7 9 4 44．44
mel-em610 4 40．00 me5一eml2 7 3 42．86
mel—em8 12 5 41．67 me6一ern7 7 3 42．86
reel—em9 8 3 37．50 me7一em5 7 3 42．86
mel_eml06 2 33．33 me8一em5 9 4 44．44
me卜emll5 2 40．00 me8一ewlll 1l 5 45．45
me2一eml 7 5 71．43 me8一eml2 7 3 42．86
me2-em66 4 66．67 me9一em5 14 10 71．43
me3一eml 9 4 44．44 reel0-ern4 7 4 42．86
me3·em3 5 1 20．00 reel0一em6 10 4 40．00
rne3一em4 5 2 40．00 reel0一em8 8 3 37．50
me3一em7 5 2 40．00 reell一eml 9 6 66．67
me3一eml310 4 40．00 mell—em6 6 2 33．33
me4-em44 2 50．00 reel卜emll 6 2 33．33
me4-em57 3 42．86 mell一eml2 9 3 33．33
me4一emll3 l 33．33 总数 276 120
me4一eml29 3 33．33 平均 7．67 3．33 43．48
庆石柱枫木乡与湖北恩施太庙之间遗传相似系数最
低，为0．8770，提示它们之间亲缘关系最远。24个
供试材料间的遗传相似系数都比较大，在87％以上，
平均0．9140．说明栽培黄连群体遗传分化不明显，
其遗传背景较为单一。
2．3 SRAP聚类结果：按UPGMA法进行聚类分
析，建立聚类分支树状图(图2)。从聚类图中可以看
出，这24个样品的聚类比较复杂，可聚为5大类：第1
大类最为复杂，包括来源于重庆、四川、湖南、湖北、
陕西的13份黄连种质，可细分为4个亚类，其中C、D
亚类全为重庆产黄连，A、B亚类则较为混杂；第2大
类全为重庆产黄连，包括2份石柱产黄连和1份城口
产黄连；源于陕西平利八仙镇的黄连独为第3类；第
4类包括来源于重庆、四川共5份黄连种质；第5大
类全为重庆石柱产黄连。从总体上看，聚类结果表现
出一定的地域性分布规律：来源于湖南的2份种质
无论在大分类中，还是在亚分类中均聚在一起；源于
湖北的3份种质在大分类中是聚在同一大类，但亚
分类中仅2份聚在一类；来源于重庆的14份种质大
部分是聚同一大类或同一亚类，如8份重庆石柱产
黄连。
各类群的划分与来源地无明显相关性，如重庆、
四川、陕西产黄连并未完全聚为同一类，而是分散在
各类群中。
3讨论
本室曾采用ISSR标记对栽培黄连种质资源的
遗传多样性进行了研究，揭示了各栽培黄连种质之
间亲缘关系较近，未表现出明显的遗传分化‘7]．。本研

万方数据
中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年10月· 555·
1 1．000O
2 0．9l2 3 1．000O
3 o．9050 0．92981．000O
l O．92800．9183 0．92091．000
5 0．8964 0．9346 0．9184 0．92131．000O
6 0．9032 0．923l0．9353 0．9286 o．92131．000
7 0．909l0．9167 0．90l00．9152 0．9123 0．90961．000
8 0．9109 0．9257 0．9043 O．92l6 0．9146 0．9169 0．94331．0000
9 0．8922 0．9369 0．9153 0．9039 0．9290．9087 0．9063 0．92091．000
100．8889 0．93300．921Z 0．9194 0．9124 0．9242 0．9203 0．9267 0．91871．000O
1l 0．8976 0．90310．896Z 0．9040 0．9060．9040 0．9133 0．9346 0．903l0．90911．0∞O
12 O．891l0．9314 0．8998 0．8932 0．9057 0．8884 0．9029 0．9153 o．9314 0．9227 0．8926 1．O∞O
13 O．9013 0．90200．9140．9029 0．9057 m9029 0．船24 0．8959 0．91l8 0．9179 0．9022 0．91581．000
14 0．9037 0．9187 0．9117 0．9194 0．917l0．91000．9357 0．9362 0．9187 0．9057 0．9184 0．91300．91791．∞0
15 0．897l0．9359 0．9194 0．9129 0．9153 0．9170．9156 0．9296 0．9169 0．94l5 0．9259 0．9209 0．91l3 0．94l51．000
16 m8945 0．9197 0．9078 m91080．91800．9301．8987 0．9279 0．9197 0．9065 0．9052 0．9189 0．91400．9257 0．92381．咖O
17 0．915O 0．9153 0．91300．916l0．9040．9209 O．9ll5 0．9234 0．9104 0．9212 0．8962 m9047 0．9095 0．9165 0．9242 0．90781．000
18 0．9105 0．9070．9054 O．914l0．9113 0．9188 0．897l0．9242 0．9156 0．9165 0．9200 0．9147 0．9330 0．9246 0．9196 0．9235 0．90031．000
19 O．909l0．9140．92200．9096 0．8988 0．9056 0．9029 0．9179 0．8949 0．9157 0．9095 0．9136 0．9185 0．9253 0．9187 0．897l0．9024 0．9191．000O
200．8844 0．9246 0．9l2 6 0．8964 0．9134 0．89l6 0．9005 0．9039 0．9343 0．9065 0．89l0 0．9238 0．9238 0．9161O．9000．912Z 0．89810．9203 O．92161．O伽0
2l 0．8843 0．9105 O．9082 0．8867 0．8947 0．8966 0．877O 0．8993 0．9204 0．9ll8 0．89l0 0．9096 0．9297 0．9069 0．8954 0．9127 0．8983 0．929l0．9023 O．9371．O∞O
22 0．8922 0．9272 0．9201．9183 0．9252 0．923l0．9086 0．9257 0．9369 0．9187 0．9078 0．9216 0．9167 0．937B 0．93110．9343 0．9249 0．9306 o．9193 0．9294 0．93531．0000
23 0．8980 0．9208 0．9037 0．8993 0．9139 0．9ll8 0．9043 0．8976 0．9185 0．9047 0．8942 0．907m9227 0．91710．9056 0．92800．8980．9295 0．8978 0．928O 0．9215 m92571．000
Z‘O．9203 O．9304 0．9005 0．9163 0．9234 0．9064 0．9043 0．9140 0．9330 0．9047 0．9056 0．9200．9246 O．92l6 0．9223 0．9270．91580．9243 0．9123 0．9177 0．9262 O．9353 0．9Sl91．000O
圈2 24份栽培黄连种质的聚类图
Fig．2Dendrogramof24germplasmic
resourcesofC．cbinensis
究采用新型的SRAP标记再次证实了上述结论。研
究表明，两种标记系统都可以扩增出其各自的多态
性谱带，均能有效地揭示栽培黄连种质较低的遗传
多样性，因此分子标记可作为黄连种质资源的鉴定、
分类及遗传多样性评价的有效手段。但两种标记在
多态检出率、遗传相似系数、聚类图方面有一定的差
异：SRAP标记的多态检出率为43．48％，ISSR分析
的多态检出率为48．1％，由此可看出，ISSR比
SRAP能检测到较多的遗传多态性；从供试材料的
遗传相似性系数上看，SRAP分析的遗传相似系数
分布在0．877O～0．9519，平均为0．9140，ISSR分
析的遗传相似系数分布在0．826～0．935，平均为
0．8825，相对而言，ISSR比SRAP可检测到较高的
种质问遗传变异；显然，以上差异与两种标记原理不
同，在对基因DNA进行扩增时引物结合位点的不同
有直接关系。此外，基于2种标记得出了不同的遗传
距离，由此产生的聚类图存在一定差异。已有的研究
结果表明，同时采用2种标记进行遗传多样性研究，
群体的遗传分化程度小，两种技术的聚类分析结果
难以完全吻合[8。]。
我国黄连栽培历史悠久，人工栽培技术已相当
成熟。目前市场上所售的黄连，几乎全是人工栽培，
基本上能满足市场需求，这在很大程度上缓解了对
野生黄连资源的压力。但在经济利益的驱动下，对野
生黄连资源的过度采挖从未停止过。目前黄连已被
列为国家重点保护的濒危野生药材之一，面临着资
¨丝：宝∞M∞n”堪幢5
2
9
7
0¨悖，6竹m坫●4

万方数据
·1556· 中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年10月
源枯竭的严重境地，野生黄连仅十分稀少地见于陕
西南部、湖北西部和四川东部的一些地区。如果不进
行有效的保护，随着野生黄连分布区域的继续缩小
和资源的大量流失，将导致黄连遗传多样性的进一
步降低，甚至有可能难以找到野生资源。此外，生产
上长期的人为选择加上药材市场的调控，丢失了许
多农家品种资源，造成黄连栽培群体遗传基础狭窄，
基因组差异缩小，降低了居群间的遗传多样性水平。
因此，在黄连遗传多样性保护上，一方面需人为增加
个体间的基因流动，促进基因重组，对物种进行复
壮l另一方面要在广泛调查的基础上大量收集和保
护野生、农家品种的优质种内变异，在适宜地建立田
间种质资源圃，最大限度地对遗传多样性进行保护，
并进行植物形态学、生长发育规律和繁殖生物学的
研究，使种质资源的收集和保护更具有目的性和有
效性。本室利用分子标记技术对黄连栽培种质资源
进行遗传多样性分析，不仅可以对黄连的育种工作
中亲本的配置提供理论依据和指导作用，而且在遗
传多样性恢复和保护中具有重要价值。
致谢：分子生物学实验在西南大学蚕桑学重点
实验室完成。
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黄独带芽茎段增殖和生根的初步研究
洪森荣，尹明华。，赵美娜
(1-饶师范学院生命科学系，江西上饶334001)
摘要：目的对黄独带芽茎段的增殖和生根进行初步的研究。方法采用单因子试验和植物组织培养的方法。结
果 6-BA或KT与NAA组合有利于黄独带芽茎段增殖；蔗糖质量浓度过高将导致黄独带芽茎段愈伤化不利于黄
独带芽茎段增殖l液体培养有利于黄独带芽茎段增殖；在一定范围内NAA质量浓度的增加有利于黄独带芽茎段生
根，但质量浓度太高将会抑制生根。结论 黄独带芽茎段增殖的最佳培养基为MS+KT2mg／L+NAA1mg／L或
MS+6-BA2mg／L+NAA0．5mg／L；黄独带芽茎段再生的最佳蔗糖量为30g／L，最佳培养方式为液体培养，最佳
的生根培养基为MS+NAA2mg／L。
关键词：黄独I带芽茎段；增殖；生根；组织培养
中圈分类号：R282．2 文献标识码：A 文章缩号：0253—2670(2008)10—1556—05
Primarystudyonproliferationandro tingofstemwithabudinDioscoreabulbifera
HONGSen—rong，YINMing—hua，ZHAOMei—na
(DepartmentofLifeScience。ShangraoNormalCo lege，Shangrao334001t China)
Abstract：ObjectiveTos udytheffectsof everalf ctorsnbudproliferationandrootingof
Oioscoreabultnferastemwithabud．MethodsSinglefactortestandplanttissueculturemethodswere
applied．ResultsThecombinationof6一BAorKTandNAAhelpedtheproliferationofstemwithabudin
收稿日期：2008．01—04
基金项目：江西省自然(青年)科学基金资助项目(0630103)I江西上饶师范学院2008--2009年度院级科技资助项目
作者简介：洪森荣，男，江西永新人，硕士，讲师。主要从事生物技术方面的研究．
-通讯作者尹明华

万方数据
栽培黄连群体遗传关系的SRAP分析
作者： 陈大霞， 李隆云， 瞿显友， 彭锐， 钟国跃， CHEN Da-xia， LI Long-yun， Qu Xian-
you， PENG Rui， ZHONG Guo-yue
作者单位： 重庆市中药研究院,重庆,400065
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(10)
被引用次数： 7次

参考文献(9条)
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6.李敏;王琦;付福友 不同品种部金的SRAP研究[期刊论文]-中草药 2006(08)
7.陈大霞;李隆云;彭锐 黄连种质资源遗传多样性的ISSR研究[期刊论文]-中国中药杂志 2006(23)
8.饯韦;葛颂;洪德元 采用RAPD和ISSR标记探讨中国疣粒野生稻的遗传多样性[期刊论文]-植物学报 2000(07)
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本文读者也读过(10条)
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引证文献(7条)
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2.赵红燕.冯尚国.沈波.王慧中 金钗石解相关序列扩增多态性反应体系的正交优化研究[期刊论文]-中草药
2010(8)
3.张春平.何平.胡世俊.袁凤刚.王瑞波.高姗 药用三角叶黄连遗传多样性的ISSR分析[期刊论文]-中国中药杂志
2009(24)
4.张春平.何平.何俊星.张益锋.乔元宝.张敏.石章田.胡世俊 药用峨眉野连遗传多样性的RAPD分析[期刊论文]-中
国中药杂志 2010(2)
5.王维婷.单成钢.倪大鹏.王志芬 不同来源丹参种质遗传多样性的SRAP标记分析[期刊论文]-中草药 2010(4)
6.周先容.彭福荣.熊正贤 石柱黄连的民族植物学研究[期刊论文]-湖北农业科学 2012(2)
7.张春平.何平.胡世俊.王瑞波.张益锋.刘长坤.高姗 黄连遗传多样性的ISSR分析[期刊论文]-中草药 2009(10)


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