全 文 ：·1312· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月
向于苯并吡喃双环进入p环糊精空腔。R。和R。
为一OCH。时，可能由于甲氧基活动空间较大，分子
两种模式包合概率都较大。从受体包合配体的结合
能来看，R。和R。为一H有利于包合，一OH和一OCH。
两者对包合没有差异。
当R。为一H时，D模式和S模式分别出现23和
17个，平均结合能为一97．0kJ／mol。当R6为-OH
时，D模式和S模式分别出现0和7个，平均结合
能为一111．2kJ／tool，表明为一0H时更有利于结合，
主要有利于苯环进入p环糊精空腔。R。与R。一样，
只有多取代时出现，由于只有2个含羟基对接成功，
其他含羟基与甲氧基的结构都没有对接成功，没有
进行统计。
当R，是苯环对位的取代基，通常认为对包合成
功没有决定性的影响，比较有意义的是，当R，为一H
时，D模式和S模式分别出现0和9个，平均结合能
为一106．2kJ／tool。当R，为一OH时，D模式和S模
式分别出现23和15个，平均结合能为一97．4
kJ／mol，结果表明R，为一H时更有利于结合，主要有
利于苯环进入p环糊精空腔。
3讨论
通过利用理论对接计算，研究了p环糊精对黄
酮类结构的包合作用，可以发现：黄酮母核的R。和
R．基团大小直接影响包合的成功率，较小的氢有利
于包合，较大的甲氧基使包合失败。R。或R。有一定
的取代有利于包合形成。R。或R。取代越大越不利
于形成包合物。
黄酮类结构中的苯并吡喃双环和苯环都可以被
p环糊精的空腔包合。R。和R．体积较小有利于苯
并吡喃双环进入}环糊精空腔，增大为一OH时，使
分子倾向于苯环进入p环糊精空腔。R。和R。体积
较小时，有利于苯环进入p环糊精空腔，R。和R。为
一OH时，使分子倾向于苯并吡喃双环进入p环糊精
空腔。当Re为一0H时有利于苯环进入}环糊精空
腔。R，为一H时有利于苯环进入p环糊精空腔。因
此，不同的取代基既可以影响包合的形成也可以改
变包合的模式，在实验中考虑以p环糊精包合黄酮
结构时需要根据取代情况进行仔细分析。以理论计
算为基础，也进行了试验研究，包合效果有一定的价
值，有待于进一步动物试验验证。
参考文献：
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高效液相色谱串联电喷雾质谱法测定大鼠血浆中山茛菪碱
马小红，王新立，陈 勇。，韩凤梅
(湖北大学中药生物技术省重点实验室，湖北武汉430062)
摘要：目的 建立大鼠血浆中山莨菪碱的测定方法，并研究山莨菪碱的大鼠药动学。方法采用液相色谱串联电喷
雾离子阱质谱法测定大鼠血浆中山莨菪碱。大鼠血浆样品经甲醇2次沉淀蛋白并萃取后，以甲醇一2mmol／L醋酸
铵缓冲液(用甲酸调pH3．5)(70·30)为流动相，用AgilentZorbaxEclipseXDB-C18色谱柱分离，通过电喷雾离子
阱质谱，以选择离子反应监测方式进行检测。用于定量分析的离子反应分别为m／z306-*140(山莨菪碱)和m／z
290-．-124(内标，阿托品)．结果山莨菪碱线性范围为10～5000pg／L，r一---0．999，最低检测限为2pg／L，日内、
日间测定值RSD小于4．2％。结论该法快速灵敏。准确度高，适用于大鼠体内山莨菪碱的药动学研究。
关键词：山莨菪碱；液相色谱串联电喷雾质谱；血药浓度
中国分类号：R286．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)09—1312一04
收穑日期：2008—01—19
基金项目：国家自然科学基金重点资助项目(30630075)；湖北省杰出青年基金资助项目(2002AC004)
作者简介：马小红(1968一)，女，湖北武汉人，实验师，1989年毕业于武汉大学化学系分析化学专业。一直从事药物分析及开发工作．
-通讯作者陈勇Tel／Fax：(027)88663590E—mail：cyl 1610@npe．gov．cn
万方数据
中草黄 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月·1313·
Determinationof n sodamineinplasmaofratbyHPLC—MS
MAXiao。hong，WANGXin—li，CHENYong，HANFeng—mei
(HubeiKeyLaboratoryofBio—TechnologyofTraditionalChineseMedicine．
HubeiUniversity，Wuhan430062，China)
Abstract：ObjectiveToestablisha sensitiveandspecificmethodforthedeterminationofan so—
daminei plasmaofratandtOstudypharmacokineticsofanisodamineinplasmaofrat．MethodsHPLC—
MSwasusedtOdeterminetheconcentrationof nisodamineinplasmaofratwithatropineastheinternal
standard．Theatropinewasisolatedfromplasmabyproteinprecipitationandextractionw thmethanol
twice，thenc romatographedbyusinganAgilentZorbaxEclipseXDB—C18column．Themobilephasecon—
sistedofmethanol一2mmol／Lammoniumacetatesolution(adjustedpHvaluetO3．5withformicacid)70：
30．Electrosprayionization(ESI)sourcewasappliedanop ratedinthepositiveionmode．Selectedr ac-
tionmonitoring(SRM)modewitht etransitionsofm／z306--140andm／z290÷124wasusedtOquantify
anisodaminendthinternalstandard．respectively．ResultsThelinearrangeforanisodaminewas1O一
5000#g／L(，．=0．999O)，thelimitofdetectionfora isodaminewas2#g／L，inter-andintra-dayRSDwas
les$than4．2％．ConclusionThemethodofferstheadvantagesofhighensitivityandaccuracyforthede-
terminationofanisodaminecomparedwiththepreviouslyreportedmethodsandissuitableforthepharma—
cokinetics udyonanisodamineinratinvivo．
Keywords：anisodamine；HPLC—MS；plasmaconcentration
山莨菪碱是从茄科植物山莨菪Scopolia
tanguticaMaxim．中分离出来的一种生物碱，由于
其结构和阿托品相似但对中枢神经的副作用较小而
常被用作M一胆碱受体阻断剂[1]，用于感染中毒休
克、急性肾炎、风湿性关节炎、肠胃炎症、惊厥和肺损
伤等疾病的治疗[引，甚至用来治疗非典(severe
acuter spiratorysyndrome，SARS)。文献报道了采
用TLC和HPLC法分析山莨菪碱在家兔、小鼠和
人体内的药动学[3州]，但灵敏度和专属性不够高，不
适合用于血液及生物组织中痕量山莨菪碱的定量分
析。本研究建立了一种灵敏度与专属性更高，且快速
简便的测定大鼠血浆中山莨菪碱的液相色谱串联电
喷雾离子阱质谱(LC／ESI—ITMS)法，该方法适合用
于山莨菪碱的药动学研究。
1材料与试剂
美国Finnigan公司LCQD’10型液相色谱一离子阱
质谱仪，包括电喷雾电离源(ESI)，TSPP4000泵，
TSPAS3000自动进样器，LCQXcalibur数据处理
系统和LCQuanl．2定量软件；TGL一16C高速离心
机(上海安亭科学仪器厂)。
山莨菪碱(质量分数98％以上)购于中国药品
生物制品检定所，阿托品(质量分数98％以上)购于
美国Sigma公司。甲醇、乙腈为色谱纯(美国Fisher
公司)，甲酸为分析纯，水为超纯水。
Wistar大鼠，体质量(200土20)g，雌雄兼用，由
湖北省实验动物研究中心提供，合格证：SCXK(鄂)
2003—2005。ig给药前禁食12h，全程不禁饮水。
2方法与结果
2．1 色谱与质谱条件：AgilentZorbaxEclipse
XDB—C18色谱柱(150m．m×2．1mm，5弘m)，并配有
Agilent公司相同柱填料的保护柱(12．5mm×4．6
mm，5肛m)；流动相：甲醇一2mmol／L醋酸铵缓冲液
(用甲酸调pH3．5)(70l 30)；体积流量：0．2
mL／min；柱温40℃。
ESI离子源；扫描范围m／z100～1000；离子源
喷射电压4．5kV；毛细管电压13V；毛细管温度
175℃；鞘气(N。)流速40个单位；碰撞诱导解离
(CID)能量为30％；自动进样器直接进样，正离子检
测；扫描方式为选择反应检测(SRM)，用于定量分
析的离子反应分别为m／z306--，140(山茛菪碱)和
m／z290---124(内标，阿托品)。单次扫描时间0．3s，
含3次微扫描。
2．2血浆样品处理：大鼠ig给药60mg／kg后，眼
球静脉丛取血，肝素抗凝，3000r／rain离心10min，
抽取血浆样品0．1mL置1．5mLEp管中，依次加
入0．1mL甲醇，0．1mL内标(阿托品500}tg／L)涡
漩振荡1min后，加入1．0mL甲醇，涡漩振荡
1min，12000r／min离心10rain，将上层离心液转
万方数据
·1314· 中草喃ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月
移至另一试管中，重复上述操作1次，合并离心液。
将离心液在35℃氮气流下挥干，残渣用0．1mL流
动相溶解，12000r／min离心10min后取上清液置
进样小瓶中。自动进样器吸取20弘L进行
LC／MS／MS分析。
2．3质谱分析：对山莨菪碱进行一级质谱正离子全
扫描，准分子离子为m／z306，对其进行碰撞诱导解
离，失去托品酸(C。H。。0。，m／z166)生成主要碎片
m／z140，用于定量分析。对内标阿托品进行一级质
谱正离子全扫描，准分子离子为m／z290，对其进行
碰撞诱导解离，脱去托品酸(C。H。。O。，m／z166)生成
主要碎片离子m／z124，用于定量分析。山莨菪碱和
内标阿托品的二级质谱全扫描图见图1。
140 124
A
27637,
9．1 1；2 郾8l
B
93 260290
9lI (272I
50 100 150 20025030050 100 150 200250
m{≈ m／z
图1 山蓖菪碱(A)和阿托品(B)的[M+H]+二级质谱
全扫描图
Fig．1MS2Spectraof[M+H]+foranisodamine
(A)andatropine(B)
2．4方法专属性：分别取6只大鼠的空白血浆，进
样分析，几乎没有物质响应；将一定质量浓度的山莨
菪碱对照品溶液加入空白血浆中，同法处理，结果山
莨菪碱的保留时间为1．99min，内标的保留时间为
2．01min，色谱图见图2。取大鼠单剂量ig60mg／kg
山莨菪碱9h后收集的血浆样品，同法处理，结果血
浆中的内源性物质不干扰山莨菪碱及内标的测定，
见色谱图2。通过对比分析含10pg／L山莨菪碱与
500pg／L内标水溶液和血浆溶液的质谱响应，在
血浆溶液中的山莨菪碱和内标的色谱峰面积分别比
在水溶液中的降低5．6％和4．8％，说明血浆基质对
山莨菪碱和内标没有明显的电离抑制。
2．5标准曲线：取空白血浆0．10mL，分别加入不
同质量浓度山莨菪碱0．10mL和500,g／L内标阿
托品，配制成含山莨菪碱分别为10、50、100、500、
1000、5000pg／L的血浆样品，进样测定。以血浆样
品质量浓度为横坐标，待测物与内标峰面积比为纵
100
冰80
越60
董竺
O
100
堡80
越60
婪40
罂20
0
O l 2 3 4 5 6
‘jmin
l
1
零
＼
糕
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1
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髓
卅
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0 l 2 3 4 5 6
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D
＼)
1一山莨着碱2一网托品
1-anisodamine2-atropine
图2含10t_Ig／L山蓖菪碱血浆样品(A)、含500pg／L内
标的血浆样品(B)、单剂量lg60mg／kg山蓖菪碱
9h后大鼠血浆样品(c)和含内标大鼠血浆
样品(D)的选择离子色谱图
Fig．2ChromatagramsinselectiveIonmonitoringmode
ofplasmasamplespiked10呜／Lanlsodamlne(A)
and500嵋／Latropine(B)，plasmasample9h
afterigadministeredanisodamine(60mg／kg)(C)·
andplasmacontainingatropine(D)
坐标，用加权最ib--乘法进行线性回归，结果山莨菪
碱的线性范围为10～5000,ug／L，回归方程为y=
5．407x104x+3．680x10一，，．=0．9990，最低检测
限为2弘g／L。
2．6 回收率与精密度试验：制备含山莨菪碱20、
200、2000弘g／L样品各6份，制备供试品溶液，进样
测定，根据回归方程计算样品中山莨菪碱的质量浓
度与实际配制样品中山莨菪碱的质量浓度的比值，
求得方法回收率，并计算RSD。同样方法连续测定
3d，计算RSD。结果见表1。
制备含山莨菪碱20、200、2000pg／L样品各6
表1大鼠血浆样品中山莨菪碱分析的准确度与精密度
(拜=6)
Table1 Accuracyandprecisionfora alysisof
aniso—damineInplasmaofrats(矗一6)
万方数据
中草莠ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月·1315·
份，进样测定，以沉淀蛋白并萃取后的待测物色谱峰
面积与未经沉淀蛋白直接进样获得的色谱峰面积之
比，考察样品提取回收率，结果见表1。内标经同样
处理，其回收率为72．8％。
2．7稳定性试验：取含山莨菪碱20、200、2000gg／L
样品各5份，考察了在3次冷冻一解冻循环、血浆样
品放置24h、血浆样品处理后室温放置8h条件下
山莨菪碱的稳定性，结果山莨菪碱的方法回收率的
RSD均在士10％以内，见表2。
裹2大鼠血浆样品中山蓖菪碱的稳定性(万=5)
Table2 Stabilityofanisodamineinplasma
ofrats(一=5)
测得的质量浓度
条件 回收率／％ RSD／％
／(腿·L。1)
2．8体内药一时曲线：取6只Wistar大鼠，单剂量
ig60mg／kg山莨菪碱，分别于不同时间取血约0．3
mL，分离血浆，制备供试品溶液，进行LC—MS2测
定，绘制药一时曲线(图3)，并用药动学软件DAS2．0
进行曲线拟合，确定山莨菪碱血药浓度动态变化规
律符合二室开放模型，主要药动学参数见表3。
一
三1000
恺
强
誊500
O
0 2 4 6 S lO 12
t／h
图3 口服山莨菪碱后大■血浆中山莨菪碱的药一时曲线
Fig．3Meanplasmaconcentration—timecurveofaniso-
daminei ratsafterasingleoraldose
3讨论
莨菪烷类生物碱无色，在紫外光区的吸收系数
表3山蓖菪碱大鼠体内动力学参数
Table3 Pharmacokineticparametersofanisodamine
inrats／n一●1口
小，亦无荧光。因此，文献报道的方法[3~63灵敏度较
低，不能满足生物样品中痕量莨菪烷类生物碱的测
定。本实验建立的LC—MS2方法用于测定莨菪烷类
生物碱，不仅灵敏度比文献报道的方法高2个数量
级，而且方法的抗干扰能力更强，线性范围更宽。
莨菪烷类生物碱均有自己的特征子离子，应用
LC—MS2定量分析莨菪烷类生物碱，应采用选择反
应检测模式。山莨菪碱的二级质谱特征碎片离子为
m／z140，阿托品的为m／z124，故本实验分别选择
m屈140、124作为山莨菪碱和内标阿托品的定量选
择反应检测离子，这样有利于提高分析方法的专属性。
应用LC—MS2进行定量分析，内标物的选择很
重要。尽管SRM具有多窗口同时检测的特点，原则
上只要求内标物具有特征性离子反应，而不必像
HPLC那样需要内标与被分析物等严格分离。但为
了保证分析方法回收率，一般选择结构类似物作为
内标。因此，本实验选择山莨菪碱的结构类似物阿托
品为内标。
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万方数据
高效液相色谱串联电喷雾质谱法测定大鼠血浆中山茛菪碱
作者： 马小红， 王新立， 陈勇， 韩凤梅， MA Xiao-hong， WANG Xin-li， CHEN Yong， HAN
Feng-mei
作者单位： 湖北大学中药生物技术省重点实验室,湖北,武汉,430062
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(9)
被引用次数： 1次
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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200809012.aspx