全 文 ：此培养基上原球茎继代培养 5 代以上, 能保持较高
的增殖率, 且原球茎不易分化。本研究结果与文献报
道[5 ]的结果有所不同, 文献报道添加土豆提取物时
原球茎增殖量最大, 但原球茎易分化成小苗。
铁皮石斛原球茎固体培养的线性生长期为第
9～ 13周, 随后进入减速生长期。研究结果表明在原
球茎生长的初期加入真菌诱导子, 对原球茎的生长
有一定抑制作用。在原球茎线性生长的后期加入真
菌诱导子, 能提高原球茎的鲜质量和干质量, 说明诱
导子对原球茎的生长有促进作用, 并能影响原球茎
的物质代谢过程, 促进其干物质的积累。这些结果与
已有的研究报道[7 ]结果相符合。
上述研究结果显示, 2 种真菌对原球茎的作用
有一定差别: 原球茎与M F23 诱导子作用时间延长,
鲜质量和干质量有降低的趋势; 原球茎与M F24 诱
导子作用时间延后, 鲜质量和干质量有增加的趋势。
但它们的这种不同作用之间没有显著性差异。推测
M F24 对原球茎的作用较温和。对于菌根真菌对铁
皮石斛原球茎的作用, 还有待于从生理、生化及次生
代谢产物等方面进行深入研究。
参考文献:
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肉苁蓉细胞悬浮培养体系的建立
欧阳杰1, 武彦文2, 王晓东3, 赵　兵3, 王玉春3Ξ
(11 北京林业大学生物科学与技术学院 食品科学与工程系, 北京　100083; 21 清华大学 化学系 生命有机磷化学
教育部重点实验室, 北京　100084; 31 中国科学院过程工程研究所 生化工程国家重点实验室, 北京　100080)
摘　要: 目的　研究由肉苁蓉愈伤组织建立细胞悬浮培养体系的培养条件。方法　在固体培养基上添加不同比例
的生长激素, 考察生长激素、细胞种龄和接种量对细胞生长和次生代谢产物苯乙醇糖苷 (PeG)量的影响。结果　在
添加1 m göL 2, 42D 的B 5 固体培养基上形成的愈伤组织松散易碎, 适于进行悬浮培养。细胞种龄为25 d 和接种量为
3%～ 4% 时细胞悬浮培养的结果最好, PeG 产量达到最大, 为 0182 göL。细胞在悬浮培养时聚集体由大变小, 直径
小于015 mm 的细胞聚集体由接种时的5% 逐渐增加至第20 天时的81% , 其PeG 量为1011%。结论　通过摇瓶培养
建立了较好的细胞悬浮培养体系。
关键词: 肉苁蓉; 悬浮培养; 苯乙醇糖苷 (PeG)
中图分类号: R 28212　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253- 2670 (2008) 03- 0426- 04
Establ ishm en t of C is tanche deser ticola cell l ines in suspen sion culture
OU YAN G J ie1, W U Yan2w en2, W AN G X iao2dong3, ZHAO B ing3, W AN G Yu2chun3
(11 D epartm ent of Food Science and Engineering, Co llege of B io logical Science and T echno logy, Beijing Fo restry U niversity,
Beijing 100083, Ch ina; 21 Key L abo rato ry of B ioo rgan ic Pho spho rous Chem istry & Chem ical B io logy
(M in istry of Education) , D epartm ent of Chem istry, T singhua U niversity, Beijing 100084, Ch ina;
31 State Key L abo rato ry of B iochem ical Engineering, Inst itu te of P rocess Engineering,
Ch inese A cadem y of Sciences, Beijing 100080, Ch ina)
Abstract: Objective　To invest iga te the cu ltu re condit ion s fo r the estab lishm en t of su spen sion cell
lines from C istanche d eserticola callu s1M ethods　A dding differen t k inds and ra t io s of p lan t grow th regu la2
to r to so lid B 5 m edium , the effects of cell age, inocu la t ion size, and p lan t grow th regu la to r on the cell
grow th and the second m etabo lite accum u lat ion, phenylethano id glyco sides (PeG) w ere studied1 Results
·624· 中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
Ξ 收稿日期: 2007205210
作者简介: 欧阳杰 (1971—) , 男, 湖南省安仁县人, 博士, 副教授, 主要从事生化工程方面的研究, 已在国内外发表论文30 余篇。
T el: (010) 62336700　Fax: (010) 62338221　E2m ail: ouyangjoy@ sohu1com
Callu s fo rm edon so lid if ied B 5 m edium supp lem en ted w ith 1 m göL 2, 42D w as spongy and su itab le fo r su s2
pen sion cu ltu re1 T he p roduct ion of PeG reached the h ighest of 0182 göL w hen cell su spended cu ltu re w ith
the cell age of 25 d and inocu la t ion size of 3% - 4% 1 In su spen sion cu ltu re, the ra t io of cell aggregat ion
sm aller than 015 mm changed from 5% at the start to 81% at the day 201 It′s PeG con ten t reached
1011% 1 Conclusion　Op tim al cell su spen sion lines are estab lished after f lask cu ltu re1
Key words: C istanche d eserticola Y1 C1M a; su spen sion cu ltu re; phenylethano id glyco sides (PeG)
　　肉苁蓉C istanche d eserticola Y1C1M a 是一种生
长于盐碱地和戈壁滩的名贵中药材, 具有滋肾壮阳、
清除自由基以及增强免疫力等功效, 其主要的药用
成分是苯乙醇糖苷 (phenylethano id glyco sides,
PeG) , 包括松果菊苷 ( ech inaco side )、洋丁香苷
(acteo side)、2′2乙酰洋丁香苷 (2′2acetylacteo side)
和肉苁蓉苷A (cistano side A )等[1 ]。肉苁蓉寄生在梭
梭等植物的根上, 由于乱采滥挖, 造成资源短缺, 植
被破坏严重, 加速了土地沙化。通过植物细胞培养来
生产次级代谢产物, 可以很好地解决资源短缺的问
题, 并且可以进行工业化大生产。
笔者已对从肉苁蓉种子诱导出愈伤组织的条件
和愈伤组织培养条件的优化进行了研究[2, 3 ]。本实验
对肉苁蓉愈伤组织转入液体培养基建立细胞的悬浮
培养体系进行研究, 为进一步的生物反应器培养奠
定基础。
1　材料与方法
111　实验材料: 将从外植体诱导得到的肉苁蓉愈伤
组织, 在液体培养基中进行悬浮培养, 得到分散的肉
苁蓉细胞及聚集体。
112　肉苁蓉细胞培养方法: 肉苁蓉细胞悬浮培养采
用B 5 培养基, 添加20 göL 的蔗糖。将细胞按1% 的
接种量接种在装有40 mL B 5 液体培养基的100 mL
三角瓶中进行培养 (添加1 m göL 2, 42D )。培养温度
为 (25±1) ℃, 光照强度1 600 lx, 光照时间16 höd,
继代时间为20 d。
113　细胞种龄和接种量对细胞生长及PeG 累积的
影响: 将固体培养基上种龄分别为 5、10、15、20、25、
30 d 的愈伤组织转入液体培养基, 培养20 d, 测生物
量和PeG 产量; 将固体培养基上的愈伤组织分别按
015%、1%、2%、3%、4%、5% 转入液体培养基, 测生
长曲线和PeG 产量。
114　测定方法
11411　干质量测定方法: 取培养 20 d 的肉苁蓉细
胞培养液, 用滤纸滤过, 将细胞置于烘箱中, 60 ℃烘
约24 h 至恒重, 称得其干质量即为生物量。
11412　苯乙醇糖苷类化合物的量测定: PeG 在 332
nm 处有强吸收峰, 由此可绘制标准曲线, 标准曲线
方程为: A 332 nm = 01008 5+ 01012 28 C (C 为PeG 的
质量浓度, ΛgömL )。将肉苁蓉提取液浓缩至膏状, 加
适量水混悬, 经醋酸乙酯脱脂后, 用正丁醇萃取。浓
缩萃取液, 稠膏再用水混悬, 通过大孔吸附树脂。先
后用水和甲醇洗脱, 收集甲醇部分, 然后稀释适当倍
数, 测定其在 332 nm 下的A 值, 即可计算出肉苁蓉
中PeG 的量[4 ]。
PeG 产量 (göL ) = PeG 量 (% )×生物量 (göL )
11413　不同大小的细胞聚集体的收集方法: 准备网
眼分别为015、1、115 mm 大小的筛网各1 个。先将细
胞悬浮液用 115 mm 的筛网滤过, 用无菌水冲洗一
遍, 收集筛网上的细胞聚集体, 即为> 115 mm 的细
胞聚集体。同样操作可以分别得到 110～ 115 mm、
015～ 110 mm 和< 015 mm 的细胞聚集体。
2　结果和讨论
211　肉苁蓉悬浮培养细胞系的建立: 要建立肉苁蓉
细胞的悬浮培养体系, 需将固体培养基上的愈伤组
织转移到液体培养基, 使聚集成块的愈伤组织分散
为单个细胞或细胞聚集体。在添加015 m göL 62BA
和10 m göL GA 3 的B 5 固体培养基上形成的愈伤组
织和在添加1 m göL 2, 42D 的B 5 固体培养基上形成
的愈伤组织的形态和物理性质不同[3 ]。前者形成的
愈伤组织为灰黄色, 紧密结实, 硬度较大; 而后者形
成的愈伤组织为浅黄色, 半透明, 松软易碎。松散的
愈伤组织是进行悬浮培养最适合的材料, 稍经机械
振荡, 即可使组织分散成单细胞或由几个细胞组成
的小细胞团, 在培养中细胞迅速增殖; 而坚实愈伤组
织中的细胞间被果胶质紧紧地粘着, 因而往往不能
形成良好的悬浮系统。因此在添加1 m göL 2, 42D 的
B 5 固体培养基上生长的愈伤组织适合进行进一步
的悬浮培养, 其生物量、PeG 的量和 PeG 产量分别
为914 göL、1411%、114 göL。
212　细胞种龄对细胞生长和 PeG 累积的影响: 处
于不同生长时期的细胞, 其生理状况不同, 细胞内的
代谢活动情况有较大的差别。因此将固体培养基上
的愈伤组织转入液体培养基时, 细胞种龄对悬浮培
·724·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
养的结果有较大的影响。由图1 可知, 接种的细胞种
龄在 15 d 以下时, 悬浮培养后细胞的干质量和PeG
的量较低; 而种龄在 15 d 以上时, 种龄对细胞生长
和PeG 的合成影响差别不大。种龄为25 d 时悬浮培
养的结果最好, 当接种量为 1% 时, 培养 20 d 后细胞
生物量达到612 göL , PeG 的量为1012% , PeG 产量
为0163 göL。种龄10 d 以上的愈伤组织正处于生长
曲线的对数生长期, 在此阶段, 细胞生长迅速, 代谢
活跃。将此阶段的愈伤组织转接到液体培养基时, 可
以缩短悬浮细胞生长的延滞期, 细胞很快进入对数
生长期。固体培养基上生长的愈伤组织如果种龄过
短, 则种子量少, 实验效率低下, 而且操作性不强, 不
利于培养时的转接。而种龄为 25 d 时, 愈伤组织的
生物量大, PeG 的量也较高, 因此选用种龄为 25 d
的愈伤组织进行实验较为适宜。
细胞种龄öd
图 1　肉苁蓉细胞种龄对细胞生长和PeG 累积的影响
F ig11　Effect of inoculation age on cell growth
of C1 deser ticola and PeG accumulation
in suspen sion culture
213　接种量对肉苁蓉细胞生长和 PeG 累积的影
响: 不同接种量时肉苁蓉细胞的生长曲线见图2。随
着接种量的加大, 细胞的生长周期缩短。接种量为
015% 时, 对数生长末期是第28 天; 接种量为1% 时,
对数生长末期是第 20 天; 接种量为 2%～ 3% 时, 对
数生长末期是第 16 天; 而接种量为 4%～ 5% 时, 对
数生长末期是第12 天。随着接种量的增加, 对数生
长末期时细胞的生物量也随之增加。接种量为5% ,
培养到第12 天时细胞的生物量最大, 生物量达1215
göL , 但此时细胞的增长倍数只有312 倍。接种量为
1% 时, 细胞培养 20 d 后的增长倍数最大, 达到 811
倍, 细胞的生物量为612 göL。
　　接种量对肉苁蓉细胞悬浮培养时PeG 合成的
影响见表1。摇瓶培养时靠空气和培养液表面的接触
传氧, 其传氧效率较低。随着接种量的增加, 单位
培养时间öd
图 2　不同接种量时肉苁蓉细胞的生长曲线
F ig12　Growth curves of C1 deser ticola cells
in suspen sion cultures under differen t
inoculation sizes
表 1　悬浮培养时接种量对肉苁蓉细胞生长和PeG
合成的影响
Table 1　Effect of inoculation size on cell growth
of C1 deser ticola and PeG biosyn thesis
in suspen sion culture
接种量ö% 培养时间öd 生物量ö(g·L - 1) 生长倍数 PeGö% 　 PeG 产量ö(g·L - 1)
015 28 318±014 716 1113±110 0143±0109
1 20 612±016 811 1012±019 0163±0111
2 20 811±017 513 918±110 0180±0115
3 16 1011±110 414 810±018 0182±0116
4 16 1113±110 317 712±017 0182±0115
5 12 1215±112 312 611±016 0177±0115
质量细胞的传氧减少, 营养物质的传递效率也逐渐
减弱, 因此肉苁蓉细胞的生长速率和PeG 的量逐渐
下降。接种量低于4% 时, 随着接种量的增加, 生物量
也增加, PeG 产量明显提高。当接种量为 3%～ 4%
时, PeG 产量达到最大, 为0182 göL。接种量继续增
加到5% 时, PeG 产量又有所下降。
214　悬浮培养时细胞聚集体大小随时间变化的分
布: 将在添加 1 m göL 2, 42D 的B 5 固体培养基上生
长的愈伤组织转接到相同的液体培养基中, 放于摇
床上进行培养 (转速110 röm in)。随着培养时间的延
长, 愈伤组织越来越分散, 细胞聚集体由大变小。由
图3 可见, 直径小于015 mm 的细胞聚集体从接种时
的5% 逐渐增加到第20 天时的81% , 而115 mm 以上
的细胞聚集体则由接种时的 80% 逐渐降至第 20 天
时的10%。培养第20 天时, 介于015～ 110 mm 的细
胞聚集体的比例为 713% , 110～ 115 mm 的细胞聚
集体占 116%。由图 4 可见, 肉苁蓉细胞之间的
细胞间质较少, 细胞极易脱离分散, 细胞聚集体较
·824· 中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
培养时间öd
图 3　液体悬浮培养时肉苁蓉细胞聚集体大小随时间
变化的分布
F ig13　D istr ibution of cell aggregation size
with changes of culture time in cell
suspen sion culture of C1 deser ticola
图 4　肉苁蓉细胞聚集体的显微照相图
F ig14　M icroscope photos of C1 deser ticola
cell aggregation
小, 不容易形成大的细胞聚集体。
215　细胞聚集体大小和PeG 量的关系: 愈伤组织转
入液体培养基后, 随着培养时间的延长, 逐渐形成大
小不同的细胞聚集体。从图5 可见, 不同大小的肉苁
蓉细胞聚集体之间PeG 的量差别较小。介于 015～
110 mm 的细胞聚集体PeG 的量最高, 为1113% , 是
介于 0～ 015 mm 的细胞聚集体 PeG 的量 (1011% )
的112%。大于115 mm 的细胞聚集体PeG 的量又稍
有下降, 为1011%。不同的植物种类, 其细胞聚集体
大小和次级代谢产物量之间的关系差别很大。在水
母雪莲S aussu rea m ed usa M ax im 1 红色系悬浮培养
物中, 细胞聚集体大小在 110～ 510 mm 时, 黄酮的
量最高; 而细胞聚集体小于 110 mm 或大于 510 mm
时, 黄酮的量下降[5 ]。
3　结论
和固体培养相比, 液体悬浮培养有良好的混合、
流动性能及更高的传质效率, 但溶氧有限, 可能对植
细胞聚集体ömm
图 5　肉苁蓉细胞聚集体大小和PeG 量的关系
(细胞培养时间为 20 d)
F ig15　Relation sh ip between cell aggregation size
of C1 deser ticola and PeG con ten t
物细胞的生长有一定的限制作用。愈伤组织由固体
培养基转至液体培养时, 愈伤组织逐渐分散成单个
细胞或多个细胞的聚集体。在悬浮培养过程中, 随着
细胞的生长和增殖, 细胞的聚集度又慢慢提高, 细胞
聚集体不断增大[6 ] , 聚集体的大小与液体悬浮过程
中产生的剪切力有关, 并与次级代谢产物的量之间
也存在着一定关系。
在肉苁蓉细胞悬浮培养的过程中, 当细胞种龄
为25 d 和接种量为3%～ 4% 时结果最好, PeG 的产
量达到最大, 为0182 göL。细胞在悬浮培养时聚集体
由大变小, 直径小于 015 mm 的细胞聚集体由接种
时的5% 逐渐增加至第20 天的81% , 介于 015～ 110
mm 的细胞聚集体由5% 变为713%。大小介于015～
110 mm 的细胞聚集体PeG 的量最高, 达到1113%。
通过摇瓶培养建立了较好的肉苁蓉细胞培养体系, 培
养条件为温度25 ℃, 光照强度1 600 lx, 光照时间16
höd, 为下一步的放大培养打下了基础。
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