全 文 ：·药理与临床·
生川乌对小鼠 Focal adhesion 信号通路毒性影响的实验研究
张仲林1 ,2 ,彭 　成1
①
,刘宏伟3
(11 成都中医药大学 ,四川 成都 　610075 ; 21 成都医学院 ,四川 成都 　610083 ; 31 上海生物芯片有限公司 ,上海 　201203)
摘 　要 :目的 　寻找生川乌的毒性基因 ,探讨其毒性机制。方法 　根据国际 ICH 的要求 ,在 SPF 实验条件下采用
生川乌水煎液 ig 昆明种小鼠进行毒性实验。采用基因表达谱技术 ,就生川乌对小鼠 5 种脏器的毒性进行全基因组
描绘 ,应用 Cluster、GO 和 Pathway 等生物信息学手段对获取的数据进行综合分析并进行定量 PCR 验证。结果
生川乌明显影响小鼠黏着斑 ( Focal adhesion) 通路中的黏附素 ( ECM) 、局部黏附激酶 ( FA K) 和 GTP 结合蛋白
(Cdc42) 等关键基因。结论 　生川乌可能是通过影响小鼠 Focal adhesion 信号通路的关键基因而引起毒性 ,最终
导致毒性的产生。
关键词 :生川乌 ; 毒性 ; 信号通路 ; Focal adhesion
中图分类号 :R285153 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0120075204
Toxicity of Ra dix Aconitii on Focal adhesion signal pathway of mice
ZHAN G Zhong2lin1 ,2 , PEN G Cheng1 , L IU Hong2wei3
(11 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine , Chengdu 610075 , China ; 2. Chengdu Medical College ,
Chengdu 610083 , China ; 3. Shanghai Biochip Co. , L td. , Shanghai 201203 , China)
Abstract : Objective 　To study the toxicity and it s mechanism of R a di x A coni t i i f rom genetic and mo2
lecular levels. Methods 　According to t he requirement s of ICH , t he acute toxicity experiment was carried
out under t he condition of SPF by ig administ ration of t he decoction of R adi x A coni t i i to mice. Gene ex2
pression profiling was used to describe whole2genome of five organs in mice , t he related data were analyzed
by using bioinformatics statistics , such as Cluster , GO , and Pat hway , and t he result s were validated
t hrough quantitative PCR. Results 　The effect s of R adi x A coni t i i on t he key genes of t he Focal adhesion
pathway of mice , such as ECM , FA K , Cdc42 , were remarkably. Conclusion 　The reason why R adi x
A coni t i i produces the toxicity is p robably t hat R adi x A coni t i could cause the toxicity of Focal adhesion sig2
nal pathway t hrough influencing t he key genes.
Key words : R adi x A coni t i i ; toxicity ; signaling pathway ; Focal adhesion
　　乌头类中药是一类主要含有乌头碱类有毒成分
的中药 ,包括川乌、草乌、附子、天雄、雪上一枝蒿、铁
棒槌等。临床报道和现代药理研究都证实乌头类中
药有强烈毒性 ,但目前均无从基因层面研究此类中
药毒性的报道。川乌对中枢神经、心血管系统和呼
吸系统等有明显毒性。本研究以生川乌为模型药
物 ,从分子生物学角度寻找其毒性基因以及探讨其
毒性机制 ,为乌头类中药毒性研究提供基因层面的
研究基础 ,为临床对川乌的毒性认识提供分子生物
学依据。
1 　材料
111 　药物 :生川乌购于成都市荷花池中药材市场 , 经成都中医药大学生药学教研室万德光教授鉴定为乌头 A coni t um carmichael i Debx. 的干燥母根。生川乌水煎液 (含生物碱以乌头碱计为 01274 %) ,由成都中医药大学药学组实验室提供 ,实验前配置成生药 2 g/ mL 备用。112 　试剂 :与 RNA 提取、纯化、双链 DNA 合成和芯片杂交等相关的试剂 ,如 Total RNA Isolation、cDNA Synt hesis and Synthesis of Biotin2LabeledcRNA、GeneChip Hybridization & Scanning 和M ES Free Acid Monohydrate Sigma Ult ra 等系列 ,由上海生物芯片有限公司提供。小鼠 A310 全基因表达谱芯片 ,美国 Affymet rix 公司研究制作。
·57·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
①收稿日期 :2008205223
基金项目 :国家自然科学基金重点项目 (30230410)
作者简介 :张仲林 (1972 —) ,男 ,博士 ,讲师 ,2007 年毕业于成都中医药大学 ,现在成都医学院药学院药理教研室工作 ,研究方向为疾病动物
模型与中药复方药理。Tel : (028) 68289191 　E2mail : zhlzhang2007 @163. com3 通讯作者　彭　成　Tel : (028) 87789954 　E2mail : pengchengcao @126. com
113 　动物 :健康昆明小鼠 20 只 ,雌雄各半 ,体质量
18～22 g ,合格证号 :川实动管字 04211 ,由成都中医
药大学试验动物中心提供 ,在 SPF 环境下正常饲养
1 周后供试。
2 　方法
211 　药物制备 :生川乌粉碎成粒颗粒 ,称取 100 g
置于圆底烧瓶中 ,加 10 倍量水 ,浸泡 30 min ,煮沸
后煎煮 2 h ,趁热滤过 ,用适量水洗涤残渣 3 次 ,合
并洗液和滤液 ,减压浓缩至 50 mL ,由成都中医药大
学药学组实验室提供。
212 　动物实验 :将健康昆明种小鼠 20 只按性别、
体质量随机分为两组 ,每组 10 只 ,即对照组、生川
乌组。通过预试验 ,生川乌组 ig 相应水煎液 0125
mL/ 20 g 时动物出现明显的中毒症状 (神情淡漠、
呆滞不动、呼吸频率加快、体温下降、偶见吐涎液) ,
个别动物在 215 h 后出现死亡 ,故选用 0125 mL/ 20
g 做为毒性检测剂量。生川乌组 ig 相应水煎液 (生
药 1215 g/ kg) ,对照组 ig 等体积的蒸馏水。给药 2
h 后处死小鼠 ,迅速解剖动物 ,取出脑、心、肝、肺、肾
等脏器 ,用含 011 % D EPC 的生理盐水漂洗 ,切成厚
约 2 mm 的组织薄片放入预先装有 RNAlater 的冻
存管中 ,样品在 4 ℃条件下保存 ,孵育过夜后置于
- 20 ℃低温冰箱保存备用。
213 　芯片实验 :取用 RNAlater 冻存的小鼠脑、心、
肝、肺及肾组织块 ,按照《Affymet rix 基因表达谱芯
片操作指南》的步骤进行芯片实验。
214 　PCR 验 证 实 验 : 任 意 选 取 阳 性 基 因
BB703394 ,设计相应引物 ,并对 5 个样品进行相应
的 R T2PCR 实验 ,将实验结果与原芯片数据进行比
较 ,考察 Chip 与 PCR 数据的拟合性。
215 　数据处理 : Gene Array Scanner 3000 7 G , Af2
fymet rix Fluidics Station 450 , Affymet rix Gene2
chip Hybridization Oven 640 Affymet rix , GCOS 数
据处理软件 (均为 Affymet rix 提供) 。应用 Clus2
ter、GO 和 Pat hway 等生物信息学工具 ,对获取的
数据进行综合处理与分析。
3 　结果
311 　小鼠组织样品 mRNA 质检和质控结果 :对生
川乌 ig 小鼠后的 5 种脏器的组织标本 ,采用 TR2
Izol 法抽提组织 RNA ,得到的 RNA 样品浓度、总
量和质控琼脂糖电泳结果 ;通过判断 28 S 和 18 S
的亮 度 比 例 可 以 初 步 评 价 总 RNA , 可 见
28 S ∶18 S ≥2 ,表明其总 RNA 质量较好 ,可以用
于后期的芯片杂交实验。结果见表 1 和见图 1。
表 1 　小鼠 5 个组织样品 RNA 浓度、总量和电泳信息
Table 1 　RNA Concentration , total amount ,
and electrophoresis information
of f ive tissue samples of mice
样品 质量浓度/ (μg ·μL - 1) 总量/μg 琼脂电泳质检
脑 31 89 389 合格
心 11 11 111 合格
肝 31 70 1 480 合格
肺 11 86 186 合格
肾 21 41 241 合格
图 1 　生川乌处理后小鼠 5 个组织样品琼脂糖电泳图
Fig. 1 　Agarose electrophoregram of f ive tissue
samples of mice treated by Radix Aconitii
　　利用质检合格的样品 ,按照实验操作指南进行
芯片实验。芯片结果采用 Affymet rix 扫描仪进行
扫描 , GCOS 软件读取、处理数据。差异基因筛选标
准 :扫描值变化率为 I 或 MI ,扫描值变化率取 2 为
底的对数值 ≥1 ,实验组 Detection 为 P 的为上调基
因 ;扫描值变化率为 D 或 MD ,扫描值变化率取 2
为底的对数值 ≤- 1 ,对照组 Detection 为 P 的为下
调基因。由此法得到生川乌处理后的组织样品散点
图。图中当对照组、实验组的检测值都为 P 时以红
色表示 ,其中一个为 P 时以蓝色表示 ,两个都为 A
时以黄色表示。结果显示 ,图像与背景平行线相平
行 ,说明基因芯片信号强度及芯片均一性 ,结果具有
均一性和可信性 (图略) 。
312 　生川乌芯片数据基因 GO 分类 :根据基因生物
学功能描述 ,以 Gene Ontology Biological Process 为
索引 ,按照国际基因 GO 分类法对生川乌芯片数据检
测差异基因进行基因功能的分类统计 ,由数据可见在
GO 功能分类中 ,以结合、代谢、凋亡几类基因占优
势。具体主要分类的统计结果见图 2。
　　采用分子功能注释 (MAS) 系统数据库 ,对生
川乌小鼠芯片的阳性基因中与结合相关的基因进行
GO2terms 统计处理 ,可以评价该药物的全部功能
GO 基因的显著性 ,即判断这些 GO 基因在全部功
能基因数据库中的权重与可信度 (以 P 和 Q 值进
行衡量 : P 值 < 0105 且 Q 值 < 0105) 。结果见表 2。
313 　生川乌的 Focal adhesion 通路的关键基因 :以
生川乌小鼠芯片阳性表达基因 gene symbol 为目
·67· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
录 ,输入京都基因及基因组学数据库 ( KEGG) 得到
其蛋白 Pathway 通路。以通路中出现的阳性基因
为序 ,找到其对应的基因 symble 和注释 ,并对其上
调、下调情况进行统计 ,结果见表 3。
图 2 　生川乌对小鼠阳性基因表达分类
Fig. 2 　Classif ication of positive gene expression of mice treated by Radix Aconitii
表 2 　生川乌处理小鼠的与 Focal adhesion 相关
GO 分类名称和 P、Q值表
Table 2 　GO2terms , P and Q values related
to Focal adhesion pathway of mice
treated by Radix Aconitii
GO 分类名称 基因总数 P 值 Q 值
GO : 0020037 铁红素结合 36 010 010
GO : 0005506 铁离子结合 45 010 110 E26
GO : 0005178 整联蛋白结合 10 310 E26 319 E25
GO : 0005507 铜离子结合 16 111 E25 1108E24
GO : 0005525 三磷酸腺苷结合 42 314 E25 2184E24
GO : 0008201 肝磷脂结合 12 418 E25 3185E24
GO : 0005509 钙离子结合 74 3147E24 01002 368
表 3 　生川乌处理小鼠的 Focal adhesion 通路阳性基因
Table 3 　Some positive genes of Focal adhesion pathway
of mice treated by Radix Aconitii
阳性基因位置 阳性基因 描 　述 表达情况
受体或配体基因 EMC 黏附素 上调
ITGB 整联蛋白 a29 下调
GF 表皮生长因子 上调
PT K 蛋白酪氨酸激酶 上调
调节节点基因 c2jun 原癌基因 上调
PKC 蛋白激酶 C 下调
FA K 蛋白酪氨酸激酶 上调
PTEN 磷酸酯酶 下调
PI3 K 磷脂酰肌醇 (23)激酶 上调
Yinculin 纽蛋白 下调
IL K 整合素连接激酶 下调
Crk 肉瘤病毒致瘤基因同系物 下调
PD K1 32磷酸肌醇依赖蛋白激酶 1 下调
c2jun 胸腺瘤病毒原癌基因 1 上调
Akt/ PKB 胸腺瘤病毒原癌基因 1 下调
B2Raf 环吡酮胺转化基因 下调
Vav 致癌基因 上调
PA K P21 基因 (抑瘤基因)激活激酶 下调
GSK23β 糖原合成酶激酶 3β 下调
β2catenin B21 连环蛋白 下调
Bcl22 B2淋巴细胞 上调
效应基因 Actin 胞质β2肌动蛋白 下调
CycD 细胞周期蛋白 D1 下调
cIAPs 颗粒症病毒免疫黏连重复2封闭蛋白 下调
314 　阳性基因的 PCR 验证 :任意选取阳性基因
BB703394 进行对心、肝、脾、肺和肾中相应的 5 组样
品进行 PCR 验证 ,并通过比较定量 PCR 数据和芯
片数据之间的关系 ,考察两者数据的拟合度。实验
结果显示 ,该基因芯片变化值与定量 PCR 所得出
的结果非常一致 ,主体变化趋势大致相符 (图 3) 。
说明实验数据真实可信。
图 3 　基因 BB703394 芯片与 PCR 数据的拟合度示意图
Fig. 3 　Curve of f itting degree between PCR
data and array data of BB703394
4 　讨论
　　细胞骨架 (cytoskeleton) 是指真核细胞中的蛋
白质之间搭建起来的纤维骨架网络结构。目前认
为 ,细胞骨架主要功能是 : (1) 维持细胞整体形态和
内部空间有序分布 ; (2)与细胞运动、物质运输、能量
转换、信息传递、细胞分裂、基因表达、细胞分化等生
命活动密切相关。在细胞骨架中有一重要的结
构 ———黏着斑 , 黏着斑由细胞膜外的黏附素
( ECM) 、细胞膜上的整联蛋白 (integrins) 和细胞
内的细胞骨架蛋白等相互连接集聚而成。黏着斑又
是以黏附分子凭借其黏附作用为动力而形成的 ,黏
·77·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
附斑的功能有机械结构功能和信号传递功能。细胞
正是依靠“黏着斑”这种特殊结构将细胞嵌合在体内
正确位置 ,从而保持细胞的正常结构和发挥其正常
功能[ 1 ,2 ] 。本实验中 ,观察到动物出现四肢发冷、鼠
尾颜色苍白等能量不足的反应 ;另外 ,生川乌水煎液
的长期毒性实验结果显示 ,动物胃壁内分泌细胞线
粒体肿胀 ,胃平滑肌细胞的线粒体嵴减少、肿胀明
显 ,肠上皮细胞线粒体嵴部分消失 ,线粒体轻度肿
胀。可见 ,生川乌可能是通过影响细胞骨架来影响
细胞的正常结构和功能 ,出现细胞功能紊乱而产生
毒性反应。
ECM2整合素2细胞骨架蛋白所构成的黏着斑是
整合素信号传导的结构基础 ,许多信号蛋白通过与
黏附斑结合 ,在整合素介导的信号传导中发挥作用 ,
如局部黏附激酶 ( FA K) , 32磷脂酰肌醇激酶
( PI23 K) 等[3 ,4 ] 。在芯片结果中 , FA K、PI23 K 均出
现了阳性表达 ,可见二者的变化将直接影响黏附斑
正常的生理结构和功能 ,这可能就是毒性产生分子
基础。芯片结果中大量与细胞的锚定、骨架、运动、
增殖和存活的基因 (如 Actin、CycD、CIAp s 等) 出
现阳性表达。此外 ,与局部黏附相关的 GTP 结合
蛋白 Cdc42、Rac 和 Rho 亦出现阳性表达。对与结
合相关的 GO 进行统计结果也显示 ,药物对小鼠组
织中多数与结合相关的基因有影响。可见 ,乌头类
中药可能就是通过影响局部黏附作用来影响黏附斑
进而导致黏附斑通路的异常而出现毒性。
成都中医药大学彭成教授在国家自然科学基金
重点项目“乌头类有毒中药毒安全性研究”课题过程
中 ,提出有毒中药的“毒性物质基础 —毒作用机制 —
抗毒方法”的安全性评价模式。本研究正是在彭教
授的“有毒中药安全性评价模式”思路指导下 ,运用
基因芯片技术研究乌头类有毒中药的生川乌的毒性
基因、毒性机制 ,为乌头类有毒中药毒性提供分子生
物学依据。通过研究 ,寻找到了川乌对动物 Focal
adhesion 通路影响的毒性效应基因 ,并对其毒作用
机制进行了简单探讨。当然这些基因是否就是最终
的毒性靶基因 ,更深入和细微的毒性机制又是什么 ,
这些问题的解决一方面需要与本课题的其他研究结
果互参 ;另一方面 ,需要对筛选出的毒性基因进行进
一步锁定 ,对最感兴趣的基因进行原位杂交 ,进而对
RNA 和蛋白进行定位 ,并采用 Western blot ting 进
行蛋白水平层面的验证。
参考文献 :
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槲寄生黄酮苷对大鼠心肌缺血的保护作用及其机制
李 　晶 ,刘清梅 ,王志勇 ,乔国芬 ,吕延杰 ,初文峰 3 ①
(哈尔滨医科大学 药理学教研室 ,黑龙江省生物医药重点实验室 ,黑龙江 哈尔滨 　150081)
摘 　要 :目的 　观察槲寄生黄酮苷对心肌缺血大鼠的保护作用 ,并进一步明确其对血小板激活因子 ( PA F) 的调控
作用。方法 　结扎大鼠冠状动脉左前降支造成急性心肌梗死模型 ,通过观察不同剂量槲寄生黄酮苷 (15、75 mg/
kg) 及 PA F 受体特异性阻断剂 BN52021 (10 mg/ kg) 对梗死范围的影响 ,对比评价槲寄生黄酮苷对缺血心肌的保
护作用 ;分离正常大鼠心肌细胞 ,Fluo23/ AM 荧光染色 ,采用共聚焦显微镜技术研究 ,预先给予不同剂量槲寄生黄
酮苷 30 min 后对 PA F (1 ×10 - 11 mol/ L) 诱导心肌细胞钙超载的拮抗作用。结果 　与模型组比较 ,槲寄生黄酮苷
和 BN52021 均可缩小大鼠梗死心肌范围 ,降低心肌梗死大鼠血清乳酸脱氢酶 (LD H) ,丙二醛 (MDA) 水平 ,提高
血清超氧化物歧化酶 ( SOD) 水平 ,并成剂量效应关系。PA F 可直接诱导心肌细胞钙超载 ,而槲寄生黄酮苷和
BN52021 可直接对抗这种钙超载作用。结论 　槲寄生黄酮苷对心肌缺血具有保护作用 ,作用机制与其抑制 PAF
·87· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
①收稿日期 :2008205208
基金项目 :黑龙江省自然科学基金重点项目 ( ZJ Y0501) ; 中国博士后基金资助项目 (20070410915) ;
黑龙江省青年科学基金资助项目 (QC06C070)
作者简介 :李　晶 (1976 —) ,女 ,黑龙江省哈尔滨市人 ,药理学硕士研究生。Tel : (0451) 55986019 　E2mail : ljlj1325 @163. com3 通讯作者　初文峰　E2mail : cwf76928 @163. com