全 文 ：·药材与资源·
黄连 N-甲基乌药碱-3′-羟化酶基因的克隆及序列分析
周嘉裕 1, 2 ,彭书明 1 ,雷泞菲 1 ,廖　海 2 ,陈　放 1
( 1. 四川大学生命科学学院 ,四川 成都　 610064; 2. 西南交通大学药学院 ,四川 峨眉　 614202)
摘　要:目的　克隆黄连 Coptis chinensis N -甲基乌药碱 -3′-羟化酶 [ ( S ) -N -methylcoclaurine-3′-hydroxylase ]基因
并做序列分析。方法　采用 RT-PCR方法 ,以新鲜的黄连嫩叶 cDN A为模板 ,克隆出黄连 N -甲基乌药碱 -3′-羟化酶
基因的全部序列。 结果　克隆到的基因 (命名为 CYP80B3)全长为 1 680 bp,编码一个 488个氨基酸残基组成的多
肽。其氨基酸序列与日本黄连、唐松草、罂粟和花菱草的 N -甲基乌药碱 -3′-羟化酶的氨基酸序列同源性分别达 95% 、
82% 、 70% 、 68%。将得到的序列提交 Genbank,序列号为 EF492879。通过与日本黄连的氨基酸序列比对 ,具有相同
功能区域 ,因而可以参与N -甲基乌药碱的 3′位羟基化反应。结论　黄连N -甲基乌药碱 -3′-羟化酶基因的成功克隆为
黄连植物中原小檗碱型苄基异喹啉类生物碱的基因工程等研究打下了良好的基础。
关键词: 黄连 ; N -甲基乌药碱 -3′-羟化酶基因 ;克隆 ;序列分析
中图分类号: R282. 7　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253- 2670( 2008) 03- 0419- 05
Molecular cloning and sequence analysis of (S )-N-methylcoclaurine-3′-hydroxylase
gene inCopt is chinens is
ZHOU Jia-yu1, 2 , PENG Sh u-ming1 , LEI Ning-fei1 , L IAO Hai2 , CHEN Fang1*
( 1. Colleg e of Life Science, Sichuan Univ ersity, Chengdu 610064, China; 2. Co llege o f Pharmacy,
Southw est Jiao tong Univ er sity , Emei 614202, China )
Abstract: Objective　 To clone and sequence the cDN A encoding ( S) -N -methylco claurine-3′-hydroxy-
lase f rom Copt is chinensis. Methods　 The cDN A, encoding ( S ) -N -methy lcoclaurine-3′-hydroxylase, w as
amplified by RT-PCR with cDN A library of tender leaf as the templa te. Results　 The full-length cDN A of
( S ) -N -methylco claurine-3′-hydroxylase ( named as CYP80B3) had 1 680 bp wi th an open reading f rame
encoding 488 amino acids o f pro tein. Th e CYP80B3 had 95% , 82% , 70% , and 68% amino acid sequence
homology to the sequence o f ( S ) -N -methylcoclaurine-3′-hydroxylase f rom C. japonica , Thalictrum
f lavum , Eschscholz ia cal ifornica and Papaver somnif erum , respectiv ely. The sequence w as repo rted to the
GenBank and coded as EF492879. Comparison o f sequence wi th ( S ) -N -methy lcoclaurine-3′-hydroxylase
f rom C . japonica show ed CYP80B3 possessed the same functional regions involv ed wi th 3′-hydroxylation
o f ( S ) -N -methy lcoclaurine. Conclusion　 The cDN A encoding CYP80B3 from C . chinensis was cloned and
reported. This w o rk underlays the fi rst step fo r explo ring the pa thw ay of benzy lisoquinoline alkaloid
biosynthesis and for improv ing the content of benzy lisoquinoline alkaloid in C. chinensis.
Key words: Coptis chinensis Franch. ; ( S ) -N -methylco claurine-3′-hydroxy la se; cloning; sequence
analysis
　　 N -甲基乌药碱 -3′-羟化酶属于细胞色素 P450
酶系 ,是苄基异喹啉类生物碱生物合成途径的关键
酶 ,它催化 N -甲基乌药碱转变为 3′-羟基 -N -甲基乌
药碱的羟基化反应 (图 1) [1 ]。 3′-羟基 -N -甲基乌药碱
是小檗碱、黄连碱和罂粟碱的合成前体 ,经甲基化与
环化反应后 ,形成原小檗碱苄基异喹啉类生物碱的
基本骨架——金黄紫堇碱 [1 ]。 目前已克隆了来自毛
茛科的日本黄连 Coptis japonica Makino ,唐松草
Thal ictrum flavum L. 和罂粟科的罂粟 Papaver
somniferum L. ,花菱草 Eschscholtz ia cal ifornica
Cham. 等多种植物的 N -甲基乌药碱 -3′-羟化酶基
因 ,长度在 1 500～ 1 800 bp,表达 5× 104范围的蛋白
·419·中草药　 Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 39卷第 3期 2008年 3月
收稿日期: 2007-05-20基金项目:教育部科学技术研究重点项目 ( 104151)作者简介:周嘉裕 ( 1976— ) ,女 ,在读博士 ,从事药用植物基因工程研究。
Tel: ( 028) 86372508　 E-mail: spin ezhou@ sohu. com
* 通讯作者　陈　放　 Tel: ( 028) 85412142　 E-mail: fang-ch en 807@ hotmail. com
质 ,其表达产物的氨基酸序列有不低于 60%的同源
性。
　　黄连Copt is chinensis Franch. 俗称味连 ,广泛种
植于中国西南部海拔 1 000～ 1 500 m区域 ,为我国
传统中药 ,属毛茛科黄连属植物 ,具有抑菌、消炎、健
胃和降压等作用 ,其主要活性成分为小檗碱和黄连
碱等原小檗碱型苄基异喹啉类生物碱 [2 ]。 笔者以黄
连为材料 ,采用 RT-PCR技术克隆 N -甲基乌药碱-
3′-羟化酶基因 ,并进行序列分析 ,从分子水平上探
讨原小檗碱型苄基异喹啉类生物碱的生物合成机
制 ,并为下一步利用转基因技术来提高小檗碱和黄
连碱产量的研究奠定基础。
图 1　苄基异喹啉类生物碱的生物合成途径的简要步骤
Fig. 1　 Biosynthetic pathway for benzylisoquinoline alkaloid
1　材料和方法
1. 1　材料: 黄连 C. chinensis Franch. 采用四川省
峨眉山市龙池镇 ,黄连 GAP生产基地 ,采集 3～ 5年
生的黄连。
用于引物设计与数据分析的已知细胞色素
P450酶见表 1。
表 1　部分细胞色素 P450酶的基本信息
Table 1　 Basic information of several cytochrome P450
编　号 Genbank登录号 物　种 长　度 (氨基酸 )
C YP80B2 AB025030 日本黄连 1 671 bp /488
TF AY610509 唐松草　 1 620 bp /491
PS AF191772 罂粟　　 1 583 bp /481
CYP80B1 AF014801 花菱草　 1 613 bp /488
CYP71A1 P24465 鳄梨　　 1 687 bp /502
CYP76A1 X71658 茄　　　 1 571 bp /467
CYP82A1 AF175278 豌豆　　 2 787 bp /540
CYP82B1 AF014802 花菱草　 1 915 bp /560
CYP77A1 X71656 茄　　　 1 683 bp /499
CYP719 AB026122 日本黄连 1 658 bp /491
CYP72 L10081 长春花　 1 854 bp /524
CYP86A1 NM125276 拟南芥　 1 779 bp /513
1. 2　试剂: Taq酶、限制性内切酶、相对分子质量
Marker为 Taka ra产品 ; DN A电泳凝胶回收试剂盒
购自 OMEGA公司 ;其余试剂均为上海生工生物工
程公司产品。
1. 3　方法
1. 3. 1　总 RNA的提取:剪取黄连幼嫩的叶片 ,加液
氮研磨成粉末 , RN A的提取使用华舜公司的小量
RNA提取试剂盒 ,具体步骤按说明书进行。
1. 3. 2　 cDN A的获得: 以纯化的 RNA为模板 ,以
oligo ( dT ) 18: 5′-GCTGTCAACGAT ACGCTA-
CGT AACGGCATGACAGTG( T) 18-3′为反转录引
物 ,采用 AMV反转录酶进行反转录获得 cDN A。
1. 3. 3　引物设计与合成: 根据 Genbank所报道的
已知植物的 N -甲基乌药碱-3′-羟化酶基因的 cDN A
序列 ,使用 Primer Premier 5. 0引物设计软件 ,由北
京赛百盛生物技术服务有限公司合成所有引物 ,序
列为: 中间片段引物 ,正向引物 ( P1): 5′-GAACTC
( A /G) ACAAATCCAGCTGAT-3′( 742 bp) ;反向
引物 ( P2 ): 5′-CT A ( A /T ) T TCCAT ( G /A ) AG-
CAAGGCAT-3′( 947 bp)。 3′RACE引物 , 3P1: 5′-
TGGACAAAGAAGAGCAG TGGC-AG- 3′( 795
bp) ; 3P2: 5′-TGTGGATG TCTT GC-TCAATGCT
G-3′( 903 bp)。 5′RACE引物 ,反转录引物: 5′-GT
TGGAGGGTGT AATCTG AGTG T-3′( 1 144 bp) ;
5P1: 5′-GT TGAAGAACCTCTGCC-ACTGCT-3′
( 933 bp) ; 5P2: 5′-GCAAGGCAT-TGATCT TCTG
GTCT-3′( 807 bp)。
1. 3. 4　 PCR: PCR扩增 采用 Bio RAD公 司的
MG96G梯度 PCR仪 ,反应条件按引物的碱基组成
·420· 中草药　 Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 39卷第 3期 2008年 3月
进行设置 ,具体反应条件见表 2,各步 PCR在循环 35
次后 , 72℃再延伸 7 min。 最后 PCR产物于 4℃保
存。
1. 3. 5　克隆与测序: PCR产物在 1%琼脂糖凝胶上
电泳后 ,利用 OMEGA公司的凝胶回收试剂盒回收
产物 ,连接到 pMD18-T载体 ,构建重组质粒。转化大
肠杆菌感受态细胞 ,筛选重组子并用菌落 PCR检
测 ,送由北京赛百盛生物技术服务有限公司测序。
1. 3. 6　序列分析:利用 N CBI(美国国家生物技术信
息中心 )的 Blast进行分析。同时采用 DNAman软件
进行序列分析与进化树绘制。
表 2　各个步骤 PCR的反应条件
Table 2　Reaction parameters of PCR at various st eps
步　骤 预变性 /℃ , min
热变性 /
℃ , s
退火 /
℃ , s
延伸 /
℃ , s 循环次数
中间片段 PCR 95, 4 94, 30 55, 30 72, 900 35
3′RACE第 1轮 95, 4 94, 30 57, 30 72, 120 35
3′RACE第 2轮 95, 4 94, 30 54, 30 72, 120 35
5′RACE第 1轮 95, 4 94, 30 55, 30 72, 120 35
5′RACE第 2轮 95, 4 94, 30 55, 30 72, 120 35
2　结果与讨论
2. 1　黄连的 N -甲基乌药碱-3′-羟化酶基因的中间片
段 PCR、 3′RACE和 5′RACE的扩增结果见图 2,中间
片段引物进行 PCR扩增后得到约 240 bp的片段 (图
2-A) , 3′RACE扩增出约 780 bp的片段 (图 2-B) , 5′
RACE扩增出约 830 bp的片段 (图 2-C)。
2. 2　 PCR产物的测序:分别将 PCR产物进行测序 ,
克隆的中间片段、 3′和 5′片段分别测得为 236、 780、
830 bp。
2. 3　黄连 N -甲基乌药碱 -3′-羟化酶基因的全序
列 : 根据 3个片段的测序结果 ,利用 V ecto r N TI
M-Maker
图 2　N-甲基乌药碱-3′-羟化酶基因的中间片段 PCR
( A)、 3′RACE (B)、 5′RACE(C)琼脂糖凝胶电泳
Fig. 2　 Agarose gel electrophoretogram of (S )
N-methylcoclaurine-3′-hydroxylase
fragment amplif ied by PCR ( A) ,
3′RACE ( B) , and 5′RACE (C)
Suite 7软件拼接得到黄连N -甲基乌药碱-3′-羟化酶
基因 (命名为 CYP80B3)的全长序列。该基因全长为
1 680 bp,翻译起始位点为 110 bp处 , po lyA信号位
于 1 663 bp,开放阅读框共 1 467 bp,编码 488氨基酸
长度的多肽 ,相对分子质量为 5. 5× 104 (图 3)。
图 3　N-甲基乌药碱-3′-羟化酶 cDNA序列及推测的氨
基酸序列
Fig. 3　Nucleotide and deduced amino acid sequence
of cDNA encoding (S )-N-methylcoclaur ine-
3′-hydroxylase
　　 利用 ExPASy 网 站的蛋 白质 组学工 具
( www . expasy. org /tools /pro tparam. h tm l ) 预 测
CYP80B3蛋白质的等电点为 6. 38。使用 NCBI Blast
查询 ,发现黄连 CY P80B3的氨基酸序列与日本黄
连、唐松草、罂粟和花菱草的 N -甲基乌药碱 -3′-羟
化酶的氨基酸序列的同源性分别为 95%、 82% 、
70% 、 68% 。核苷酸序列同源性分别为 85% 、 74% 、
64% 、 62% ,同时在 Genbank中未查询到黄连的 N -
甲基乌药碱 -3′-羟化酶基因。 该序列已提交 Gen-
bank,序列号为 EF492879。将上述几种植物的N -甲
基乌药碱 -3′-羟化酶和其他植物的细胞色素
P450酶用 DN Aman软件构建系统进化树 ,见图 4。
·421·中草药　 Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 39卷第 3期 2008年 3月
图 4　植物细胞色素 P450酶氨基酸序列进化树
(各编号见表 1)
Fig. 4　 Dendrogram of amino acid sequence of plant cyto-
chrome P450 families (No. seen in Table 1)
进化树分析表明 , CYP80B3与日本黄连 CY P80B2
的亲缘关系最近 ,唐松草次之 , 而与拟南芥
CYP86A1亲缘关系最远。
　　细胞色素 P450酶是植物中的一个家族酶系 ,
参与植物多个代谢途径 ,具有高度的底物专一性 ,
包括羟基化酶、去甲基化酶和亚甲基双氧桥环化酶
等多种酶 [1 ]。真核细胞的细胞色素 P450羟基化酶
的分子结构中都具有系列保守域 ,分别分为跨膜
区、 K螺旋区、芳香残基区与血红素结合区。 N -甲
基乌药碱 -3′-羟化酶也具有类似的结构 (图 5)。 如
N -甲基乌药碱 -3′-羟化酶的 N端含疏水氨基酸 ,这
一区域能形成较强的α螺旋结构 ,并锚定于内质网
膜上形成跨膜区 [1 ] ,推测其合成产物 3′-羟基 -N -甲
基乌药碱可能位于内质网膜附近 ,这也与小檗碱的
生物合成路径基本吻合 [ 3]。在 N -甲基乌药碱 -3′-羟
化酶氨基酸序列的中段 ,有一个由 4个氨基酸残基
( E-X-X-R)组成的 K螺旋区。 其中 , E和 R残基参
与盐键的形成 [4 ] ,从而起到稳定 N -甲基乌药碱 -3′-
羟化酶高级结构的作用。 K螺旋区的下游是芳香族
氨基酸残基群 ,其功能尚不明确。 N -甲基乌药碱-
3′-羟化酶的 C末端是血红素辅基结合区 ,该区域负
责与血红素辅基结合 ,参与酶促反应过程中电子的
传递 [1 ]。更为重要的是在 N -甲基乌药碱 -3′-羟化酶
分子中都含有一个保守的 Thr残基 (用* 号表示 ) ,
其侧链上的羟基参与了氧分子的激活 ,是 N -甲基
乌药碱 -3′-羟化酶的必需氨基酸 [5, 6 ]。
3　讨论
随着对中药活性成分的应用研究的深入 ,对天
然活性成分的实际需求不断增加。植物基因工程开
辟了一条十分广阔的新途径。通过克隆与活性成分
形成关系最密切的生物合成相关基因入手 ,阐明中
图 5　黄连、日本黄连、花菱草、罂粟和唐松草的 N-甲基乌药碱-3′-羟化酶氨基酸序列比较
Fig. 5　 Amino acid sequence alignment of (S )-N-methylcoclaurine-3′-hydroxylase f romC. chinensis,
C . japonica , Eschscholzia calif ornica, Papaver somniferum , and Thalictrum f lavum
·422· 中草药　 Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 39卷第 3期 2008年 3月
药活性成分的生物合成及其调控机制 ,有可能会给
制药工业带来巨大变革 ,同时也可以解决一些药用
植物资源的问题。本研究通过酶的保守域来设计引
物 ,采用 RACE技术克隆其基因 ,这对进一步研究
黄连 N -甲基乌药碱 -3′-羟化酶的功能、表达特征以
及利用基因工程技术促进黄连生物碱合成具有重
要意义。
参考文献:
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真菌诱导子对铁皮石斛原球茎生长的影响
陈晓梅 ,郭顺星 ,孟志霞
(中国医学科学院 中国协和医科大学药用植物研究所 生物技术中心 ,北京　 100094)
摘　要: 目的　研究固体培养条件下 2种真菌诱导子对铁皮石斛原球茎生长的影响。方法　筛选获得铁皮石斛原球
茎的继代培养基及其生长曲线。根据生长曲线 ,在原球茎生长的不同时期加入真菌诱导子 ,考察诱导子对原球茎鲜
质量和干质量的影响。 结果　铁皮石斛原球茎继代培养基: 1 /2MS+ 20%土豆+ 3%蔗糖+ 0. 8%琼脂。 与对照相
比 ,第 11周和第 13周加入 M F23诱导子使原球茎鲜质量分别提高了 16. 4% (P < 0. 01)和 23. 4% (P < 0. 01) ,干质量
分别提高了 6. 7% (P < 0. 05)和 17. 9% (P < 0. 01) ,继代培养基中加入 M F23诱导子使原球茎干质量降低了 9. 9% (P
< 0. 01)。与对照相比 ,第 11周和第 13周加入 M F24诱导子使原球茎鲜质量分别提高了 17. 7% (P < 0. 01)和 12. 0%
(P < 0. 05) ,第 11周加入 M F24诱导子使原球茎干质量提高了 9. 2% (P < 0. 05) ,继代培养基中加入 M F24诱导子使
原球茎干质量降低了 13. 9% (P < 0. 01)。结论　在原球茎培养的早期加入真菌诱导子 ,对原球茎的生长有一定抑制
作用 ;在原球茎培养的后期加入真菌诱导子 ,对原球茎的生长有促进作用。
关键词: 铁皮石斛 ;原球茎 ;真菌诱导子
中图分类号: R282. 2　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253- 2670( 2008) 03- 0423- 04
Effects of fungal elicitors on growth of Dendrobium candidum protocorms
CHEN Xiao-mei, GUO Shun-xing , M eng Zhi-xia
( Bio techno log y Center , Institute o f Medicinal Plants Development, Chinese Academy o f Medical Sciences
and Peking Union Medical Colleg e, Beijing 100094, China )
Abstract: Objective　 To study the effects of two fungal elici to rs on the g row th o f Dendrobium can-
didum pro tocorms cul tured on the solid medium. Methods　 The medium for propagation of pro to co rms
w as selected and the g row th curve on that medium was obtained. Acco rding to the curv e, the two fungal
elici to rs w ere added a t the dif ferent g row th stag es o f pro to co rms. The f resh w eight ( FW) and dry w eight
( DW) of protocorms w ere measured. Results　 The medium fo r propaga tion o f protoco rms was 1 /2M S+
20% pota to ex t ract+ 3% sucrose+ 0. 8% aga r. Compa red w ith the control M F23 elicitor added at w eeks
·423·中草药　 Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 39卷第 3期 2008年 3月
收稿日期: 2007-05-07基金项目:国家杰出青年科学基金专项资助项目 ( 30325047)作者简介:陈晓梅 ( 1970— ) ,女 ,北京市人 ,副研究员 ,博士 ,从事药用植物菌根生物学和药用真菌化学研究。
Tel: ( 010) 62819871　 E-mail: x mch en@ implad. ac. cn
* 通讯作者　郭顺星　 Tel: ( 010) 62829619　 E-mail: sx guo2006@ yah oo. com. cn