全 文 ：组的 AUC 为 259151 min ·μg/ mL ,水溶液组的
AUC 为 130119 min ·μg/ mL ,微乳组较水溶液组
显著增加 ,说明微乳组可以显著提高川芎嗪在脑部
的分布 ,增加脑药量。
肝药浓度微乳组经时变化与脑药浓度类似 ,药
物浓度峰出现在 5 min ,水溶液组肝药浓度在 215
min ,水溶液达峰时间较微乳组快 ,说明微乳在肝中
有一定的缓释作用。比较肝药峰浓度 ,微乳组为
10166μg/ mL ,水溶液只有 6133μg/ mL ,并且微乳
组的 AUC 大于水溶液组 ,提示微乳亦改变了川芎
嗪药物在肝中的药动学 ,增加了肝中的分布。
3 　讨论
　　黄志力等[4 ]通过对川芎嗪静注后大鼠组织中药
物浓度经时变化的观察 ,川芎嗪的肝脏摄取率最高 ,
其他依次为心脏、脾、脑、睾丸、肺、肾、肌肉、血浆 ,其
主要分布于血流丰富的大循环和组织 ,脑内的分布
不高。而本实验川芎嗪微乳与水溶液的比较证明
了 :微乳可以改变川芎嗪在血、脑、肝的药动学行为 ,
分布均有所增加 ,并且脑药分布提高明显。微乳增
加了川芎嗪在血浆、脑、肝内浓集的倾向 ,血浆中药
物浓度增加说明周围组织中药物浓度会相对减少 ,
此时脑药浓度的显著提高可能是由于微乳中的油相
组分增强了药物与脑组织的亲和性 ,同时微乳属于
纳米微粒载药体系 ,可使微乳携带包裹于内相 (油
相)的药物迅速通过血脑屏障 ,提高药物在脑内的分
布[5 ] 。由以上结果预测 ,川芎嗪微乳具有脑靶向性。
川芎嗪常用于脑血管类疾病的治疗 ,但脑内的分布
并不高 ,所以今后对川芎嗪微乳脑靶向性研究具有
十分重要的意义。
实验过程中 ,由于小鼠的个体差异以及繁琐的
样品前处理过程 ,实验数据难免产生误差。而与传
统的样品采集和处理技术相比 ,微透析则较有优
势[6 ] : ①微透析对取样部位的伤害很小 ,几乎不影响
组织中的生理过程 ,得到的样品更能反映物质进入
人体后的实际变化 ; ②不改变组织细胞外液中的液体
平衡 ,既可以对同一组织进行长时间连续采样 ,也可
以对同一动物进行多个部位采样 ,用较少的实验动物
就可以得到足够的数据 ,避免了由于动物的个体差异
所造成的实验误差 ; ③其所得样品干净 ,可以直接进
行样品分析 ,省去了繁琐的样品前处理步骤。所以在
今后对川芎嗪微乳脑靶向的研究中可以利用微透析
采样技术 ,避免不必要的误差 ,使实验结果更加可靠。
参考文献 :
[ 1 ] 　舒　冰 , 周重建 , 马迎辉 , 等1 中药川芎中有效成分的药理
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用进展 [J ]1 药学实践杂志 , 2005 , 23 (3) : 13921421
丹参酮ⅡA对大鼠细胞色素 P450 酶的诱导作用
和 　凡1 ,2 ,钟国平2 ,赵立子2 ,毕惠嫦2 ,黄 　民2 3
(11 广州市妇女儿童医疗中心 ,广东 广州 　510120 ; 21 中山大学药学院 ,广东 广州 　510080)
摘 　要 :目的 　研究丹参酮 ⅡA 对大鼠细胞色素 P450 酶的诱导作用。方法 　丹参酮 ⅡA 7、20、60、180 mg/ (kg ·d)
4 个剂量组 ,雄性 SD 大鼠连续 ig 7 d ,取肝脏组织 ,应用体外“cocktail”方法 ,反转录2聚合酶链反应 ,免疫印迹杂交
方法分别检测 CYP450 酶活性、基因表达和蛋白表达的变化。结果 　丹参酮 ⅡA 能显著诱导 CYP1A2 及 CYP2 E1
的活性以及基因、蛋白表达 ,且呈剂量依赖性 ;高剂量组能增强 CYP2C19 的活性 ,但对基因、蛋白表达没有影响 ;对
包括 CYP3A1 在内的其他亚型没有影响。结论 　丹参酮 ⅡA 对大鼠多种 CYP450 亚型有诱导作用。
关键词 :丹参酮 ⅡA ; 细胞色素 P450 酶 ; 诱导
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0620938205
·839· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
3 收稿日期 :2008208211　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :广东省高等学校中药有效性与安全性重点实验室开放基金 (kf07007)
作者简介 :和　凡 (1978 —) ,男 ,广东省广州市人 ,主管药师 ,博士研究生 ,至今已在国内外发表论文 10 余篇 ,主要从事药物代谢酶和临
床药理学研究。Tel : (020) 81330652 　E2mail : hefan_yh @tom. com3 通讯作者　黄　民　E2mail : huangmin @mail . sysu. edu. cn
　　丹参酮 ⅡA ( tanshinone ⅡA , TS ⅡA ) 是丹参
sal vi a mi l t iorrhi z a Bunge 根中的二萜醌类脂溶性
有效成分 ,具有多种药理作用 ,如心血管作用、抗肿
瘤、抗氧化、抗菌消炎作用等[1 ] ,有良好的新药开发
前景。在新药的研发中 ,代谢性相互作用非常重要 ,
其主要是由细胞色素 P450 酶 ( CYP450) 所介导
的。本 实 验 室 研 究 提 示 CYP2C19、C YP3A、
CYP2D6 主要参与了丹参酮 ⅡA 的代谢[2 ] ;体外肝
微粒体孵育实验亦表明丹参酮 ⅡA 能强烈抑制
CYP1A2 的活性[3 ] 。然而丹参酮 ⅡA 在体内对主要
CYP450 的活性、基因以及蛋白表达的影响 (尤其
是诱导) ,国内外尚未见报道。本实验旨在进一步研
究丹参酮 ⅡA 在大鼠体内对 C YP450 酶的作用并探
讨其机制 ,为完善该药的代谢性相互作用和指导临
床合理用药奠定基础。
1 　材料与方法
111 　药品、试剂与仪器 :丹参酮 ⅡA 由中山大学药
学院药物化学教研室提取 ,质量分数大于 9918 % ;
非那西丁 ( P H E) 、扑热息痛 ( PAR) 、甲苯磺丁脲
( TOL) 、42羟基甲苯磺丁脲 ( O H TOL ) 、奥美拉唑
(OM E) 、右美沙芬 (DEXM) 、氧去甲基右美沙芬品
(D EXP) 、氯唑沙宗 ( CHL ) 、62羟基氯唑沙宗
(O HCHL ) 、硝苯地平 ( N IF ) 、氧化硝苯地平
(DN IF) 购自美国 Sigma 公司 ; 52羟基奥美拉唑
(O HOM E) 瑞典 Ast ra Zeneca 公司惠赠 ;氯雷他定
(内标 ,LOR) 、苯巴比妥 ( PB) 、地塞米松 (DEX) 均
购自中国药品生物制品检定所 ; NADP H tet rasodi2
um salt 购自德国 Appli Chem 公司 ;总 RNA 提取
试剂 ( Trizol) 购自美国 Promega 公司 ;反转录2聚
合酶链反应 ( R T2PCR) 试剂购自日本 Ta KaRa 公
司 ;实验所用引物由上海生物工程技术服务有限公
司合成 ;抗体 :羊抗鼠 Ig G2HRP (C YP1A2) ,兔抗鼠
Ig G2HRP ( CYP2 E1 ) , 兔 抗 鼠 Ig G2HRP
(C YP3A1) ,小鼠抗大鼠 Ig G2HRP (β2actin) 购自
美国 Santa Cruz Biotechnology 公司 ;甲醇、醋酸乙
酯为色谱2质谱纯购自美国 Tedia 公司 ;水为超纯
水 ;其他试剂为分析纯。
　　Finnigan TSQQUAN TUM 型三重四极杆液相
色谱2质谱系统 ,配有电喷雾离子化源、Surveyor 输
液泵及自动进样器以及 Xcalibur 1. 3 数据采集软
件、L cquan 数据处理软件 ,美国 Finnigan 公司产
品 ;C18 XTerra MS 分析柱 (100 mm ×2. 1 mm ,
5μm) ,美国 Waters 公司产品 ; P TC2100 型聚合酶
链反应 ( PCR) 扩增仪 ,Biomet ra 公司产品 ;Mini —
PRO TEAN3 电泳系统 , Mini Trans —Blot 转膜系
统 , GDS —8000 UV P 凝胶成像系统 (含 L AB
WO E K45 处理软件) ,美国 BIO2RAD 公司产品。
112 　动物及处理 : SD 大鼠 ,清洁级 ,雄性 , 250～
280 g ,购于中山大学医学院实验动物中心。随机分
为 7 组 ,每组 3 只。药物均溶解或混悬于 012 % 的
羧甲基纤维素钠溶液。阳性对照组 : 地塞米松
(C YP3A1 的对照) 100 mg/ (kg ·d) ,ip ,每天 1 次 ,
连续 4 d ;苯巴比妥 (其他亚型的对照) 80 mg/
(kg ·d) ,ip ,每天 1 次 ,连续 3 d。丹参酮 ⅡA 组 :4
个质量浓度分别为 7、20、60、180 mg/ ( kg ·d) ,ig ,
每天 1 次 ,连续 7 d。空白对照组 :等量的 012 % 羧
甲基纤维素钠溶液 ,ig ,每天 1 次 ,连续 7 d。大鼠处
死前 12 h 禁食 ,末次给药 24 h 后断头处死取肝脏。
113 　探针底物法检测 C YP 活性 :按照差速离心法
制备大鼠肝微粒体[3 ] 。不同的 CYP 亚型活性根据
本实验室建立的体外“cocktail”模型检测[3 ] :孵育体
系总体积 500 μL ,包含微粒体蛋白 ( 0125 mg/
mL) ,磷酸盐缓冲液 (011 mol/ L , p H 7. 4) ,探针混
合 物 10/ 100/ 5/ 2. 5/ 20/ 5 μmol/ L P H E/ TOL/
OM E/ DEXM/ CHL/ N IF ( 1A2/ 2C6/ 2C11/ 2D2/
2 E1/ 3A1) ,37 ℃水浴预孵育 5 min ,加入 NADP H
(1 mmol/ L ) 启动反应 ,20 min 后 ,加醋酸乙酯 2
mL 终止反应 ,同时加入内标工作液 (氯雷他定 10
μmol/ L ) 10 μL ,相应的 6 种代谢物 PA R/ O H2
TOL/ O HOM E/ DEXP/ O HCHL/ DN IF 用 L C/
MS/ MS 分析定量。
114 　反转录2聚合酶链反应 ( R T2PCR) 分析[4 ] :按
试剂盒说明方法 ,提取总 RAN。逆转录合成第 1 链
互补脱氧核糖核酸 (cDNA) ,然后通过特异性引物
PCR 扩增大鼠肝组织中的 CYP1A2 ,C YP3A1 基因
和内部参照物“管家”基因即亲环素 (cyclop hilin ,
CYC) 基因 (CYP1A2 的上下游引物分别为 5′2GT2
CACCTCA GGGAA T GCT GT G23′和 5′2GT T GA2
CAA TCT TCTCCT GA GG23′; CYP3A1 的上下引
物分别为 5′2A TCCGA TA T GGA GA TCAC23′和
5′2GAA GAA GTCCT T GTCT GC23′。CYC 的上下
游引物分别为 5′2CT TCGACA TCACGGCT GA T2
GG23′和 5′2CA GGACCTGTATGCTTCA G23′) ,反应
程序均为 :94 ℃预变性 4 min ,94 ℃变性 015 min ,
56 ℃退火 015 min ,72 ℃延伸 1 min ,循环 30 次 ,最
后再 72 ℃延伸 7 min。PCR 产物经 115 % 琼脂糖凝
胶电泳检查 , GDS28000 UVP 成像系统定量分析。
115 　免疫印迹杂交 ( Western blot ting) 分析[ 5 ] :大
·939·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
鼠肝微粒体中的 C YP1A2、3A1、2 E1 和β2actin 蛋
白表达用 Western blot ting 检测。肝微粒体用
10 % 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 ,电转移至硝酸纤维
膜。该膜经过封闭 ,预孵一抗、二抗 ,浸入增强发光
化学液中 60 s ,曝光后用 GDS —8000 UV P 成像系
统定量分析。
116 　统计分析 :数据均以 x ±s 表示 ,处理组与空
白对照组的比较采用 t 检验。
2 　结果
211 　丹参酮 ⅡA 对大鼠 6 种 CYP 酶活性的影响 :
丹参酮 ⅡA 能明显的诱导大鼠肝脏 C YP1A2 和
CYP2 E1 的活性 ,且呈剂量依赖性 : 7、20、60、180
mg/ (kg ·d) 4 个剂量组使 CYP1A2 的活性分别增
加 了 2214 %、9619 %、14413 %、24911 % ; 使
CYP2 E1 的活 性 分 别 增加 了 4211 %、5114 %、
6313 %、11113 %。60、180 mg/ (kg ·d) 组也能诱导
CYP2C19 的活性 ,分别增加了 2618 %、3216 %。丹
参酮 ⅡA 对其他亚型没有影响。结果见表 1。
表 1 　丹参酮 ⅡA对大鼠 CYP 酶活性的影响 ( x ±s , n = 3)
Table 1 　Effect of TSⅡA on CYP450 activity of rats ( x ±s , n = 3)
组别
剂量/
(mg ·kg - 1)
CYPs 酶活性/ (pmol ·mg - 1 ·min - 1)
1A2 2C9 2C19 2D6 2E1 3A4
空白对照 - 22816 ±441 9 1441 0 ±141 8 2391 6 ±2310 2291 9 ±5119 6031 4 ±15114 78212 ±15818
阳性对照 - 51819 ±261 8 3 3 1901 0 ±651 1 2521 3 ±4512 2021 7 ±2313 9351 2 ± 2319 3 31 11617 ± 351 4 3
丹参酮ⅡA 　7 27919 ±171 6 1541 5 ±151 3 2361 3 ±2112 2631 2 ± 613 8571 3 ± 717 3 80913 ± 5819
20 44916 ±591 3 3 3 1471 0 ±421 5 2711 3 ±2216 2671 7 ±1611 9131 9 ± 1619 3 3 83214 ± 4013
60 55712 ±561 8 3 3 1411 2 ±471 7 3031 2 ± 819 3 3 2581 0 ±4018 9851 5 ±12210 3 3 79414 ±10619
180 79615 ±701 9 3 3 1431 6 ±141 7 3171 7 ±1212 3 3 2391 5 ±3417 1 2741 4 ± 8618 3 3 79815 ± 2419
　　与空白对照组比较 : 3 P < 0105 　3 3 P < 0101
　　阳性对照组 :地塞米松 (100 mg/ kg) 为 CYP3A1 的对照 ,苯巴比妥 (80 mg/ kg) 为其他亚型的对照
　　3 P < 01 05 　3 3 P < 01 01 vs blank cont rol group ; positive cont rol group : DEX (100 mg/ kg) for CYP3A1 ; PB (80 mg/ kg) for ot her CYPs
212 　丹参酮 ⅡA 对大鼠 CYP1A2 和 CYP3A1 基因
表达的影响 :总 RNA 提取后电泳 ,紫外灯下观察 ,
可见 28 S、18 S、5 S 3 条带 ,表明所提取的 RNA
结构完整 ,RNA 样本的 A 260 nm / A 280 nm值为 11 78 ,表
明所提取的 RNA 纯度较高。丹参酮 ⅡA 能诱
导大鼠肝脏 CYP1A2 的基因表达 , 20、60、180
mg/ (kg ·d) 组 分 别 比 对 照 组 提 高 4612 %、
13215 %、18711 % ,7 mg/ (kg ·d) 组则没有影响。4
个剂量组对 C YP3A1 的基因表达无影响。结果
见图 1。
213 　丹 参 酮 ⅡA 对 大 鼠 C YP1A2、CYP2 E1、
CYP3A1 蛋白表达的影响 :丹参酮 ⅡA 能诱导大鼠
CYP1A2 的蛋白表达 ,20、60、180 mg/ ( kg ·d) 组
分别比对照组提高 5217 %、20512 %、24215 % , 7
mg/ (kg ·d) 组则没有影响。4 个剂量组也能诱导
CYP2 E1 蛋白表达 ,分别提高了 3216 %、7612 %、
·049· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
11318 %、16414 %。对 C YP3A1 的蛋白表达则没有 影响。结果见图 2。
图 2 　丹参酮 ⅡA 对大鼠 CYP1A2、CYP2E1 及 CYP3A1 蛋白表达的影响 ( x ±s , n = 3)
Fig. 2 　Effect of TSⅡA on rat CYP1A2 , CYP2E1 , and CYP3A1 protein expression ( x ±s , n = 3)
3 　讨论
　　丹参酮 ⅡA 作为有开发前景的新药 ,需要研究
其代谢途径以及对 CYP450 酶的影响 (抑制、诱
导) ,这是明确药物相互作用的基础。本实验室前期
研究表明 CYP2C19、C YP3A、CYP2D6 主要参与了
丹参酮ⅡA 的代谢 ,丹参酮 ⅡA 在体外能强烈抑制
CYP1A2 的活性。在此基础上 ,本实验进一步研究
了丹参酮 ⅡA 在大鼠体内对 CYP450 酶的诱导作
用。结果显示 ,丹参酮 ⅡA 能显著诱导 CYP1A2 的
基因、蛋白表达以及活性 ,并且呈剂量依赖性 ,这和
其能与芳香烃受体 (AhR) 结合 ,而 AhR 作为一种
配基激活转录因子 ,继而上调 C YP1A2 的表达有
关。丹参酮 ⅡA 对于 C YP2 E1 的基因、蛋白表达和
活性的影响也是一致的。临床上大约 60 % 的药物
经 C YP3A 代谢 ,而丹参酮 ⅡA 对 C YP3A1 没有影
响 ,这对于避免药物相互作用也许是个利好的现象。
高剂量丹参酮 ⅡA 也能提高 C YP2C19 的活性。由
于实验条件所限 ,本研究没有考察更多的 C YP 酶
亚型的基因和蛋白表达的影响 ,需要进一步的研究。
丹参酮 ⅡA 能与多种 CYP 亚型发生相互作用 ,这增
加了临床上合并用药发生相互作用的可能性。在中
药活性成分的研究中 ,人们发现药物相互作用的类
型和给药剂量、频率、途径均有关系 ,也和种属差异
有关。所以必须进一步的深入研究 ,才能明确丹参
酮 ⅡA 的药物相互作用 ,指导其临床合理用药。
参考文献 :
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·149·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
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广藿香挥发油对肠屏障功能的保护作用
谢肄聪 ,唐 　方 3
(天津医科大学总医院 中医科 ,天津 　300052)
摘 　要 :目的 　研究广藿香挥发油对缺血2再灌注大鼠肠屏障功能的保护作用。方法 　采用肢体缺血2再灌注模型 ,
观察肠上皮组织形态、肠黏液分泌量及肠黏膜肥大细胞数目 ,检测血浆二胺氧化酶 (DAO) 活性。结果 　与对照组
比较 ,模型组小鼠肠黏膜结构损伤明显 ,肠黏液分泌量明显减少 ( P < 0101) ,肥大细胞数目明显增多 ( P < 0101) ,
血浆 DAO 活性降低 ( P < 0101) 。广藿香挥发油能显著提高肠黏液分泌量 ( P < 0101) ,能显著减少肥大细胞数目
( P < 0105、0101) ,并能降低血浆 DAO 活性 ( P < 0105、0101) ,减轻肠黏膜上皮结构的损伤。结论 　广藿香挥发油
对缺血2再灌注损伤的肠屏障功能的保护作用机制与增加肠黏液分泌量 ,减少肠黏膜肥大细胞数目 ,降低 DAO 活
性并维持正常的肠黏膜上皮结构有关。
关键词 :广藿香挥发油 ; 肠屏障 ; 肥大细胞 ; 二胺氧化酶
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0620942203
　　广藿香 Pogostemon cabl i n (Blanco) Bent h. 为
芳香运脾法的常用、主要药物。广藿香为唇形科刺
蕊草属植物。其味辛 ,微温 ,归脾、胃、肺经 ,具有芳
香化浊 ,开胃止呕 ,发表解暑的功能 ,临床用以芳香
除秽 ,疏通中州 ,恢复脾胃受纳运化。广藿香含挥发
油约 115 % , 广藿香醇为挥发油主要成分 , 占
52 %～57 %。本实验以肢体缺血2再灌注大鼠为模
型 ,通过对肠组织形态学观察 ,肠黏液分泌量、血浆
二胺氧化酶 (DAO) 活性及肠黏膜肥大细胞数目的
测定来阐述广藿香挥发油成分对肠屏障功能的保护
作用。
1 　材料与方法
111 　动物 :一级 Wistar 大鼠 50 只 ,雌雄不限 ;平均
体质量 (250 ±20) g ,购自军事医学科学院四所 ,实
验大鼠适应性平衡饲养 1 周后用于实验。
112 　药品与试剂 :广藿香挥发油 (主要含广藿香醇)
采用蒸馏法提取 ,生药产地广东 ,制成含生药 50
mg/ g 原液 ,由天津达仁堂制药厂提供。投药前用
011 % 羧甲基纤维素钠溶液稀释。磷酸缓冲液 ,012
mol/ L ,p H 7. 2 ,购自北京鼎国生物技术发展中心。
辣根过氧化物酶溶液 ,40μg/ mL ,购自北京鼎国生
物技术发展中心。邻联 (二) 茴香胺 ,5 mg/ mL ,购
自 Sigma 公司。尸胺二氢氯化物溶液 , 1175 mg/
mL ,购自 Sigma 公司。二胺氧化酶 (DAO) 标准
品 ,购自 Sigma 公司。
113 　模型制备 :肢体缺血2再灌注模型制备采用改
良 Yassin 法[ 1 ] 。于造模前 24 h 禁食 ,以 10 % 水合
氯醛 (013 mL/ 100 g) ip 行术前麻醉。约 5 min
后 ,使用统一拉力强度橡皮筋 ,结扎实验大鼠双侧大
腿根部 ,环绕 2 周 ,持续 3 h ,造成双下肢缺血。迅
速解除结扎 ,形成肢体再灌注 , 18 h 后结束实验。
对照组在行腹腔麻醉后 ,不做结扎处理。
114 　分组及给药 :造模前将实验动物随机分为对照
组、模型组各 10 只 ,中药组 30 只。中药组用量按
200 mg/ (kg ·d) 的 10 倍、15 倍、20 倍计算 ,分别为
2、3、4 g/ ( kg ·d) ,每投药组各 10 只。每次 ig
2 mL ,对照组及模型组给予等量 011 % 羧甲基纤维
素钠溶液 ,各组连续 ig 5 d。于实验开始第 6 天 ,模
型组及中药组进行肢体缺血2再灌注造模。对照组
不作任何处理。
·249· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 6 期 2009 年 6 月
3 收稿日期 :2008210206　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :谢肄聪 (1969 —) ,女 ,天津市人 ,副主任医师 ,主要从事中医药消化系统疾病防治及研究工作。
E2mail : xieyicong2006 @126. com3 通讯作者　唐　方　Tel : (022) 60363599 　E2mail : zhongyi3599 @sina. com