全 文 ：越橘提取物抑制宫颈癌 HeLa 细胞增殖及诱导其凋亡的实验研究
唐丽萍1 ,2 ,杨艳梅3 ,李艳凤1 ,2 ,马英丽1 ,2 3
(11 黑龙江中医药大学药学院 ,黑龙江 哈尔滨 150040 ; 21 哈尔滨医科大学附属肿瘤医院 ,黑龙江 哈尔滨 150081 ;
31 哈尔滨医科大学肿瘤防治研究所 ,黑龙江 哈尔滨 150081)
摘 要 :目的 探讨越橘提取物抑制 HeLa 细胞增殖和诱导凋亡作用及其可能机制。方法 用浓度为 0、01025、
0125、215、25μg/ mL 的越橘提取物处理 HeLa 细胞 24 h 后 ,采用四甲基偶氮唑盐 (M TT) 方法检测越橘提取物对
HeLa 细胞增殖的抑制作用 ,采用 Hoechst 33342/ PI 染色和 DNA ladder 方法观察越橘提取物对 HeLa 细胞凋亡
的诱导作用 ,并采用 Western blotting 法检测 caspase23 和 caspase28 蛋白表达。结果 01025、0125、215 和 25μg/
L 的越橘提取物对 HeLa 细胞增殖的抑制率分别为 22181 %、36175 %、42162 % 和 45122 % ;0125～25μg/ L 的越橘
提取物处理组细胞呈现明显的凋亡改变 ; Western blotting 结果显示越橘提取物处理组细胞中 caspase28 和
caspase23 酶原蛋白激活 ,出现裂解片断。结论 越橘提取物可通过诱导 HeLa 细胞凋亡而抑制其增殖。
关键词 :越橘 ; 细胞凋亡 ; HeLa 细胞 ; caspase28 ; caspase23
中图分类号 :R28515 文献标识码 :A 文章编号 :025322670 (2009) 0721120203
越橘又名蓝莓 ,系杜鹃花科越橘属小浆果类果
树 ,俗称红豆、牙疙瘩等。越橘属植物种类繁多 ,全
世界有 400 多种 ,我国有 90 多种[1 ] 。目前我国主要
开发利用的是高丛越橘和野生资源笃斯越橘。笃斯
越橘广泛分布在黑龙江及内蒙古、大兴安岭地区。
近来研究表明 ,越橘提取物具有抑制肿瘤生长的作
用[2～5 ] ,但是其对宫颈癌生长的影响鲜有报道。为
此 ,本实验采用体外细胞培养技术 ,观察越橘提取物
对 HeLa 细胞增殖的抑制作用及其对肿瘤细胞凋亡
的诱导作用。
1 材料
越橘提取物购于大兴安岭华野生物工程有限公
司 ,含 2515 % 花青素。M T T、胰酶和荧光染料 Ho2
echst 33342 均购自美国 Sigma 公司 ;DM EM 培养
基购自美国 Gibco 公司 ,胎牛血清购自杭州四季青
公司。兔抗人 caspase23 和 caspase28 抗体购于美
国 Cell Signaling 公司。碱性磷酸酶标记羊抗兔二
抗和 BCIP/ NB T 显色系统购自美国 Promega 公
司。DNA ladder 购自立陶宛 MBI 公司。细胞凋亡
DNA ladder 抽提试剂盒 (离心柱式) 购自碧云天生
物技术研究所。
人宫颈癌细胞株 HeLa 细胞由哈尔滨医科大学
肿瘤防治研究所提供。细胞常规培养于含 10 % 胎
牛血清的 DM EM 培养液中 ,取对数生长期细胞用
于实验。越橘提取物溶于 PBS 中 ,配制成 10 g/ L
的储备液 ,滤器滤过除菌 ,分装于 - 20 ℃冷冻保
存。临用时 ,用培养液稀释至所需浓度。
2 方法
211 细胞生长抑制率测定 :采用 M T T 法 ,取对数
生长期 HeLa 细胞 4 ×104 个/ mL 接种于 96 孔板 ,
每孔 011 mL ,培养 24 h 后 ,加入不同剂量越橘提取
物 ,使其最终浓度分别为 01025、0125、215、25μg/
L ,每个浓度设 6 个平行孔 ,另设对照组。培养 24 h
后 ,每孔加入 015 g/ L M T T 20μL ,继续培养 4 h ,
弃去上清 ,每孔加入 DMSO 溶液 011 mL ,振荡 10
min ,待结晶物充分溶解后 ,在 490 nm 波长处读取
吸光度 ( A ) 值 ,计算细胞增殖抑制率 (inhibitory
rate , IR) 。实验重复 3 次。
IR = (1 - 给药组 A 值/ 对照组 A 值) ×100 %
212 荧光显微镜观察细胞凋亡形态 :将适量细胞接
种于 24 孔板 ,培养 24 h ,观察细胞贴壁以后 ,分别
加入不同浓度 0125、215、25μg/ L 的越橘提取物 ,
设对照组。继续培养 24 h ,取出 24 孔板 ,弃培养基 ,
PBS 洗涤 2 次 ,加入 Hoechst 33342 和 PI 染液 ,避光
4 ℃染色 20 min。吸出显色液 , PBS 洗涤 2 次 ,置
Nikon 荧光显微镜下观察并拍照。检测凋亡。
213 DNA ladder 法检测细胞凋亡 : 常规培养
HeLa 细胞 ,按 1 ×106 个/ 孔接种于 6 孔细胞培养
板。24 h 后 ,用含不同质量浓度 (0、01025、0125、
215、25μg/ L) 的越橘提取物的 2 % DM EM 培养基
·0211· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
3 收稿日期 :2008210222
基金项目 :黑龙江省人事厅博士后基金 (LB H2Z06252)
作者简介 :唐丽萍 (1973 —) ,女 ,哈尔滨人 ,副主任医师 ,博士学位 ,博士后在站 ,研究方向为妇科肿瘤的诊断和治疗。
Tel : (0451) 86298381 E2mail : hanzhigang @medmail . com. cn3 通讯作者 马英丽 Tel : (0451) 82196178 E2mail : mylt666 @sina. com
处理 24 h。PBS 洗涤 ,按试剂盒说明书提取 DNA。
取样品于 1 % 琼脂糖凝胶电泳 ,60 V 电泳 1 h ,凝胶
成像图像分析系统照相记录结果。
214 Western blotting 方法检测蛋白表达 :收集不同
浓度 (0、01025、0125、215、25μg/ L) 越橘提取物处理
24 h 的 HeLa 细胞 ,提取细胞总蛋白。用 Bradford 法
测定蛋白量后 ,取 50μg 总蛋白经 10 % 聚丙烯酰胺
凝胶电泳分离并转移至硝酸纤维素膜上。用含 10 %
BSA 的 TBST 室温封闭 2 h ;一抗孵育 (抗体稀释浓
度为 1 ∶500) 2 h ,用 TBST 漂洗 3 次 ,加 1 ∶7500 稀
释的碱性磷酸酶标记的二抗 ,室温孵育 1 h。用
TBST 漂洗 3 次 , TBS 漂洗 2 次 ,NBT/ BCIP 显色 ,去
离子水漂洗终止显色 ,凝胶成像仪照相。
215 统计学处理 :各实验均重复 3 次 ,数据以 x ±s
表示 ,应用统计学软件 SPSS 1310 进行单因素方差
分析 ,组间比较用 L SD 法。
3 结果
311 越橘提取物对 HeLa 细胞增殖的抑制作用 :在
01025～25μg/ L 质量浓度时 ,越橘提取物对 HeLa 细
胞的增殖有明显抑制作用 ,并且其抑制作用随着越橘
提取物质量浓度的提高而增强 ,当提取物质量浓度达
到 25μg/ L 时 ,抑制率达到最大 ,结果见表 1。
表 1 越橘提取物对 HeLa 细胞增殖的影响
Table 1 Effect of bilberry extracts on proliferation
of HeLa cells
组 别 剂量/ (μg ·L - 1) A 抑制率/ %
对照组 - 01122 ±01 012 0
越橘提取物 25 01067 ±01 004 3 △ 44170 ±61 75 3 △
215 01070 ±01 006 3 △ 42110 ±71 79 3 △
0125 01077 ±01 005 3 △ 36104 ±91 33 3 △
01025 01094 ±01 005 3 △ 22108 ±91 39 3
与对照组比较 : 3 P < 0105
与 01 025μg/ L 组比较 : △P < 0105
3 P < 01 05 vs cont rol group ; △P < 0105 vs 0. 025μg/ L group
312 荧光显微镜观察越橘提取物对 HeLa 细胞凋
亡的诱导作用 :在荧光显微镜下观察 ,正常细胞呈现
弥散均匀蓝色荧光 ,细胞边缘整齐 ;凋亡细胞变圆、
体积缩小、核染色质致密深染形成浓染致密的颗粒
块状蓝色荧光 ,核碎裂呈大小不等的圆形小体。对
照组和 01025μg/ L 越橘提取物处理组偶见凋亡细
胞 ,而 0125～25μg/ L 越橘提取物处理组则可见较
多的凋亡细胞 ,并且随着提取物浓度的提高 ,凋亡细
胞数明显增多 ,见图 1。
313 DNA ladder 法检测越橘提取物对 HeLa 细胞
图 1 越橘提取物诱导的 HeLa 细胞形态学改变
Fig. 1 Effect of bilberry extracts on morphological change of HeLa cells
凋亡的诱导作用 :琼脂糖凝胶电泳可见 ,对照组细胞
未发生凋亡 ,DNA 相对分子质量大 ,滞留在加样孔
附过 ,未形成 DNA ladder。经越橘提取物处理后 ,
HeLa 细胞核 DNA 断裂成 180～200 bp 及其倍数
的片段 ,电泳后在琼脂糖凝胶上呈梯形条带 ,25μg/
L 越橘提取物处理组梯形条带更为明显 ,见图 2。
314 越橘提取物对蛋白表达的影响 : HeLa 细胞经
越橘提取物作用后 ,p rocaspase23 和 procaspase28
表达水平下降 ,其裂解片段明显增加 ,见图 3。
4 讨论
越橘的应用已有多年的历史 ,但随着近年来对
越橘研究的不断增多 ,其广泛的抗肿瘤作用逐渐引
起关注[6 ] 。越橘中含有维生素 A、E、C 及 Ca、P、
Fe、Zn 等微量元素以及大量的原花青素等特殊成
分。研究表明 ,原花青素是一种天然有效的自由基
清除剂 ,具有抑制乳腺癌细胞、前列腺癌细胞等多种
图 2 越橘提取物诱导 HeLa 细胞的琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of HeLa cells
induced by bilberry extracts
肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡的作用[7～9 ] 。因
此 ,一般认为越橘具有抗癌的作用主要与其含有原
花青素有关。但是 ,最近的一项研究结果提示 ,越橘
·1211·中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
A2对照组 B～E201025、0125、215、25μg ·L - 1越橘提取物
A2cont rol group B —E20. 025 , 0. 25 , 2. 5 , and 25μg ·L - 1
bilberry ext ract s
图 3 Caspase23 和 caspase28 蛋白表达情况
Fig. 3 Protein expression of caspase23 and caspase28
的抗癌作用还与其他酚类或非酚类成分有关[10 ] 。
因此 ,本实验观察越橘水提物对宫颈癌 HeLa 细胞
生长的影响。采用 M T T 法检测不同浓度越橘提取
物对宫颈癌 HeLa 细胞增殖的影响 , 发现在
01025～25μg/ L 内 ,随着越橘提取物浓度的增加 ,
细胞增殖抑制率逐渐升高 ,表明越橘提取物可以使
HeLa 细胞的增殖受到明显的抑制 ,并且这种抑制
作用具有剂量依赖性。
凋亡是有机体细胞在基因调控下完成的有序的
主动死亡过程 ,与肿瘤的发生、发展、转归有密切的
关系。多项研究结果表明 ,越橘中的原花青素等成
分具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。为了探讨越橘提
取物对 HeLa 细胞生长的抑制作用与细胞凋亡的关
系 ,本研究采用 Hoechst 33342/ PI 荧光染色和
DNA ladder 两种实验方法观察越橘提取物能否诱
导肿瘤细胞凋亡 ,结果均可观察到明显的细胞凋亡
特征性变化 ,证明越橘提取物能诱导 HeLa 肿瘤细
胞发生凋亡。
目前 ,认为细胞凋亡是受细胞内源性基因、酶类
和信号传导途径调控的一个“瀑布式”激活过程 ,
caspase 蛋白酶家族在整个过程中起着至关重要的
作用。Caspases 家族的成员都是以酶原形式存在 ,
经水解激活后 ,可对多种蛋白底物进行降解 ,被认为
是细胞凋亡的中心环节和执行者。参与细胞凋亡的
caspase 被分为启动型 (initiator) 和效应型 (execu2
tioner 或 effector ) 两类 , 启动型 caspase 包括
caspase22、8、9、10 ,通过自身活化启动凋亡并调节效
应型 caspase ;效应型 caspase 包括 caspase23、6、7 ,
能分解细胞蛋白 ,执行凋亡。在死亡受体 Fas 等介
导的细胞凋亡途径中 ,caspase28 是关键的启动型
caspase[11 ] 。当细胞膜表面的 Fas 与其配体 ( FasL)
结合后 ,FADD 作为平台供 p rocaspase28 聚和并相
互剪切 ,p rocaspase28 的 ICE 同源区暴露后表现出
蛋白酶活性并通过自身催化形成有活性的 caspase2
8。活化后的 caspase28 随后活化其下游的其他
caspase。Caspase23 是 caspase 家族的重要成员 ,是
细胞凋亡调控的重要因子 ,以无活性前体存在于细
胞质中 ,当细胞进入凋亡时被激活 ,并可促进家族其
他成员一起促进细胞凋亡[12 ] 。在本研究中 ,越橘提
取物处理 HeLa 细胞后出现 caspase23 和 caspase28
的活化 ,并随提取物浓度增大而增加 ,提示 caspase2
3 和 caspase28 参与了越橘提取物对 HeLa 细胞凋
亡的诱导作用。
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