全 文 ：大黄酸和大黄素在体外对人肾小管上皮细胞的毒性作用研究
笪红远1 ,2 ,江振洲1 ,王翠芬1 ,张陆勇1 ,刘国卿1
①
(11 中国药科大学药学院 ,江苏 南京 　210009 ; 21 国家药品审评中心 ,北京 　100038)
摘 　要 :目的 　在体外比较大黄酸和大黄素作用于人肾小管上皮细胞 ( H K22) 的毒性表现和差异 ,并初步探讨其
肾毒性机制。方法 　采用 M TT 法观察细胞生长抑制作用 ;透射电镜观察细胞内超微结构变化 ;流式细胞仪观察
细胞凋亡情况 ;检测乳酸脱氢酶 (LD H) 和 N2乙酰2β2D2氨基葡萄糖苷酶 (NA G) 释放水平。结果 　大黄酸和大黄
素均可明显抑制 H K22 细胞增殖 ;电镜观察均可见细胞核不规则 ,出现了染色质的浓缩和边集 ;流式细胞仪观察大
黄素和大黄酸均能诱导细胞凋亡 ;大黄素组 LD H 和 NA G 释放水平均高于大黄酸组。结论 　大黄酸和大黄素均
能诱导 H K22 细胞凋亡 ,具有明显的细胞毒性作用 ,并且大黄素对 H K22 细胞的毒性作用强于大黄酸。
关键词 :大黄素 ; 大黄酸 ; 人肾小管上皮细胞 ( H K22) ; 凋亡
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0120102204
　　大黄酸 (rhein) 属单醌核类 1 ,82二羟基蒽醌衍
生物 ,是大黄、何首乌、虎杖等多种中药的有效成分
之一。大黄素 (emodin) 是从大黄属、蓼属、鼠李属
和番泻叶等中药中分离得到的活性成分。研究发
现 ,两种中药有效成分都具有广泛而相似的药理活
性[1 ,2 ] ,如抗肿瘤、抗炎、以及调节肾功能等作用。
已有研究表明 ,大黄酸可影响细胞增殖动力学和细
胞周期并对体外培养的细胞的增殖抑制作用随时间
延长而增大[3 ] 。大黄素是酪氨酸蛋白激酶抑制剂 ,
能够抑制与细胞增殖、转化和分化的信号通路有关
致癌基因的活性 ,影响细胞信号传导通路[4 ,5 ] 。同
时 ,大黄素具有诱导细胞凋亡的作用 ,此结论首先是
通过狼疮性肾炎病人肾纤维细胞实验而被证实[6 ] 。
对肾脏作用方面 ,研究发现大黄酸可以抑制糖尿病
大鼠肾脏高代谢 ,明显减少尿蛋白 ,控制肾脏的肥
大[7 ] 。大黄素可以抑制人肾成纤维细胞、肾小球系
膜细胞和肾小管上皮细胞的增殖[8 ] ,阻止肾间质纤
维化[ 9 ] 。又有研究表明 ,大黄总蒽醌 (游离苷元有大
黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等)
对 SD 大鼠毒性反应的靶器官可能主要在肾脏 ,特
别是肾近曲小管[10 ] 。高剂量大黄总蒽醌可致大鼠
肾功能不全 ,可能是由于产生促红细胞生成素的肾
小管上皮细胞或间质细胞被破坏所致[11 ] 。而关于
大黄酸和大黄酸对人的肾毒性研究目前尚未有详细
报道。本实验通过不同剂量大黄酸和大黄素对人肾
小管上皮细胞的作用对比 ,探讨它们体外肾毒性方
面的差别 ,并从细胞水平进行了初步研究。
1 　材料
111 　细胞、试剂与药品 :人肾小管上皮细胞 ( H K2
2 ,购自北京协和技术所细胞库) , 1 ∶1 DEM/ F12
( Gibco) , PBS ( KCl 0. 2 g、KH2 PO4 0. 2 g、NaCl
8. 0 g、Na2 H PO4 ·12 H2 O 2. 08 g ,p H 7. 4) ,胎牛血
清 ( FBS) ,胰蛋白酶 (南京生兴生物技术有限公
司) ,乳酸脱氢酶 (LD H) 试剂盒 (南京建成生物工
程研究所) , N2乙酰2β2D2氨基葡萄糖苷酶 ( NA G)
试剂盒 (南京建成生物工程研究所) ,BCA 蛋白浓
度测定试剂盒 (碧云天) 。大黄酸标准品 (质量分
数 > 98 % ,批号 07572200206) ,大黄素标准品 (质量
分数 > 98 % ,2 批号 07562200110) 均购自中国药品
生物制品检定所。M T T (南京生兴生物技术有限
公司) ;顺铂 (齐鲁制药有限公司) ;二甲基亚砜为国
产分析纯。
112 　仪器 :二氧化碳孵箱 ( Heraeus ,德国) ;微孔板
测读仪 ( Tecan ,瑞士) ;荧光倒置显微镜 (Olymp us ,
日本) ;电子分析天平 ( Sartorious ,德国) ; H H24 数
显恒温水浴锅 (国华电器有限公司) ;超净工作台
(吴县市实验动物器材厂 ) ; 透射电子显微镜
(J EM2000 ,日本) ;流式细胞仪 (BD ,美国) 。
2 　方法
211 　M T T 法检测大黄酸、大黄素对 H K22 细胞增
殖的影响 : H K22 细胞置于含 10 % FBS 的 DF12 培
养基 (含链霉素 0118 g/ L 、氨苄青霉素 011 g/ L ,
p H 7. 2～7. 4) 中 ,37 ℃、5 % CO2 、饱和湿度条件下
培养。细胞呈贴壁生长 ,每 1～2 天换液 1 次。取处
·201· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
①收稿日期 :2008206221
基金项目 :国家中医药管理局中医药科学技术研究专项资助项目 (国中医药科 2004ZX05) ; 科技部“十五”重大专项 (863 计划) 资助项目
(2002AA2Z3113)3 通讯作者　刘国卿　Tel : (025) 83271500 　E2mail : lyzhang @cpu. edu. cn
于对数生长期的 H K22 细胞 ,用胰蛋白酶消化制成
细胞悬液 ,细胞密度为 1 ×106 / mL ,接种于 96 孔板
中 ,每孔 180μL 。常规培养 24 h 后 ,弃去培养基 ,
加入新鲜培养基。对照组 :加入完全培养基。大黄
酸组 :每组加入大黄酸 ,使其终浓度分别为 10、20、
40、80、100μmol/ mL 。大黄素组 :每组加入大黄素 ,
使其终浓度分别为 10、20、40、80、100 μmol/ mL 。
阳性对照组 :加入顺铂终浓度为 50μmol/ mL 。溶
剂对照组 :加入 015 % DMSO。每组均为 8 个孔。
加药后分别培养 12、24、48 h ,采用 M T T 染色 ,在
微孔板测读仪于波长 510 nm 处测定各孔的吸光度
( A) 值 ,观察细胞的生长状况并计算细胞存活率。
细胞存活率 = 药物组 A 值/ 对照组 A 值 ×100 %
212 　形态学观察
21211 　相差显微镜下的形态学变化 : H K22 细胞经
40μmol/ L 的大黄酸或大黄素处理 24 h 后 ,相差显
微镜下观察并照相。
21212 　透射电子显微镜下的形态学变化 : H K22 细
胞经 40μmol/ L 的大黄酸或大黄素处理 24 h 后 ,
收集处理后的细胞于离心管中 ,1 000 r/ min 离心 5
min。用 PBS 洗两遍。弃去上清 ,加 215 % 戊二醛。
进行脱水 ,包埋 ,切片 ,染色处理后 ,上机观察。
213 　大黄酸、大黄素对 LD H 渗出和 NA G 酶活力
的影响 :取处于指数生长期 ,状态良好的 H K22 细
胞 ,调细胞密度为 1 ×106 / mL ,接种于 24 孔细胞培
养板中 ,每孔 1 mL ,37 ℃培养 24 h 后 ,分别加入不
同浓度的大黄素和大黄酸 , 对照组加入 015 %
DMSO ,分别再培养 12、24 h 后 ,吸出各组上清液备
用。按照试剂盒说明书操作 ,用分光光度法检测上
清液中 LD H、NA G 酶活力。
214 　大黄酸、大黄素对 H K22 细胞凋亡和坏死的
鉴别 (Annexin V/ PI 双染色法) :将正常培养和给
药培养 24 h 后的 H K22 细胞先用 0125 % 的胰酶消
化离心 ,将细胞密度调至约 1 ×106 / mL 的细胞悬
液 ,用 PBS 洗 2 次 ,加入 100 μL 结合缓冲液和
FITC 标记的 Annexin2V (20μg/ mL) 10μL ,室温
避光 30 min ,再加入 PI (50μg/ mL) 5μL ,避光反
应 5 min 后 ,加入 400 μL 结合缓冲液 ,立即用
FACScan 进行流式细胞术定量检测 (一般不超过
1 h) ,同时以不加 AnnexinV2FITC 及 PI 的一管作
为阴性对照。
215 　统计分析 :数据资料用 SPSS 1310 软件进行
统计 ,结果用 x ±s 表示 ,组间比较采用 t 检验。
3 　结果
311 　大黄酸、大黄素对 H K22 细胞增殖的影响 :溶
剂对照在最高浓度时 (015 % DMSO) 对 H K22 细
胞无明显生长抑制效应 ,细胞存活率均在 98 % 以
上 ,无统计学差异 ( P > 0105) 。10μmol/ L 的大黄
酸、大黄素对 H K22 细胞生长抑制作用不太明显 ,
浓度高于 40μmol/ L 则表现出一定的抑制作用 ,在
100μmol/ L 条件下 ,均具有较为明显的抑制细胞增
殖的作用 ,并且随着孵育时间延长 ,抑制作用逐渐增
强。可见大黄酸、大黄素均对 H K22 细胞有生长抑
制效应 ,且具有一定的时间和浓度依赖性。结果见
表 1。在同等条件下 ,大黄素对 H K22 细胞的生长
抑制效应明显强于大黄酸。100μmol/ L 大黄素引
起 H K22 细胞死亡太多 ,所以随后所检测的指标均
采用 20、40、80μmol/ L 3 个浓度 ,同等条件下 ,若不
加特殊说明 ,均指大黄酸、大黄素作用 24 h。
表 1 　不同浓度大黄酸和大黄素对 HK22 细胞存活率的
影响 ( x ±s , n = 18)
Table 1 　Effects of emodin and Rhein at different
concentration on HK22 cell viability
( x ±s , n = 18)
组　别
C/
(μmol ·L - 1 )
存活率/ %
12 h 24 h 48 h
对照 - 100 100 100
015 % DMSO 溶剂 - 98174 ±1171 98131 ±2130 99108 ± 2134
大黄酸 10 97133 ±6133 94181 ±7111 99171 ± 6107
20 93111 ±7183 93107 ±3149 90116 ±12197
40 85126 ±8119 75131 ±5119 3 73109 ± 8187 3
80 72185 ±6145 3 65178 ±4169 3 3 61124 ± 7120 3 3
100 71191 ±3172 3 62123 ±6137 3 3 54115 ±11138 3 3
大黄素 10 98129 ±3118 97140 ±3129 96144 ± 3161
20 94176 ±5131 89199 ±4105 77163 ± 5180 3
40 77126 ±4167 3 59130 ±3158 3 3 47167 ± 6148 3 3
80 50131 ±3121 3 3 47174 ±4120 3 3 33163 ± 4115 3 3
100 40137 ±6114 3 3 30176 ±3197 3 3 28101 ± 1151 3 3
顺铂 20 34185 ±3113 3 3 30151 ±1105 3 3 23156 ± 3141 3 3
　　与对照组比较 : 3 P < 0105 　3 3 P < 0101
　　3 P < 01 05 　3 3 P < 01 01 vs cont rol group
312 　形态学观察结果
31211 　相差显微镜下的形态学变化 :正常的 H K22
细胞呈圆梭形 ,核与染色质比较均匀 ,核质比较大 ,
用 40μmol/ L 的大黄素处理 24 h , H K22 细胞生长
活性下降 ,大部分细胞表面皱缩 ,体积变小 ,变圆 ;部
分细胞固缩、分解 ,偶见细胞碎片 (图 1 中箭头所
示) ;40μmol/ L 的大黄酸作用于 H K22 细胞 ,其形
态学变化明显弱于大黄素。
31212 　透射电子显微镜下的形态学变化 :为进一步
观察大黄素诱导的 H K22 细胞死亡的形态特征 ,
H K22 细胞经不同处理后 ,在透射电镜下观察超微
·301·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
结构的变化。正常的 H K22 细胞核呈圆形 ,较大 ,
染色质均匀地分布其中 ,核仁明显。H K22 经大黄
素处理后 ,细胞核体积缩小 ,染色质固缩 ,浓聚于核
膜附近 ,形成月芽形结构。H K22 经大黄酸处理后 , 细胞核变的不规则 ,出现了染色质的浓缩和边集 ,但是大黄素诱导 H K22 细胞产生上述现象的细胞数和程度明显高于大黄酸。该结果初步说明大黄酸对H K22 细胞的毒性弱于大黄素。结果见图 2。
313 　LD H、NA G 酶活性检测结果 :不同浓度的大
黄素、大黄酸分别作用于 H K22 细胞 12 和 24 h 后 ,
通过检测细胞上清液中 LD H 和 NA G 的酶活力显
示对细胞的损伤程度 ,结果可见大黄素明显增加细
胞释放 LD H 和 NA G ,并与药物的浓度和药物的作
用时间呈正相关 ,经大黄酸处理后的细胞释放的
LD H 与对照组比较无显著性差异 ,NA G 的释放只
是在浓度高于 40μmol/ L ,作用时间长于 24 h 才可
见显著增加 ,并且其程度明显弱于大黄素组。上述
结果表明大黄素对 H K22 有一定的毒性 ,而大黄酸
对 H K22 的毒性较为轻微。结果见表 2。
314 　大黄酸、大黄素对 H K22 细胞凋亡和坏死的
影响 :细胞周期的紊乱与凋亡的诱导关系密切[12 ] ,
为进一步探讨大黄素、大黄酸引起的 H K22 细胞生
长抑制是否与细胞凋亡有关 ,本研究用 Annex2in
V/ PI 染色区分早期凋亡[13 ] 与中晚期凋亡 (坏死) 。
结果见表 3。H K22 细胞在大黄素 (40μmol/ L) 的
作用下主要表现为早期凋亡 ,早期凋亡细胞的比例
在 24 h 达到约 33 % ,因此大黄素诱导 H K22 细胞 表 2 　大黄酸和大黄素对 HK22 细胞漏出 LD H及NAG的影响 ( x ±s , n = 18)Table 2 　Effects of emodin on leakage of LD H andNAGfrom HK22 cells ( x ±s , n = 18)组　别 C/(μmol ·L - 1 ) LDH/ (U ·L - 1 )12 h 24 h NA G/ (U ·L - 1 )12 h 24 h对照 - 101125 ±24114 117113 ±20139 3176 ±0150 3191 ±0157大黄素 20 121114 ±30106 142151 ±11179 5110 ±0160 3 5182 ±0159 340 208151 ±27115 3 230151 ±10136 3 6191 ±0121 3 7184 ±0173 3 380 282188 ±38187 3 3 306113 ±16155 3 3 9129 ±0134 3 3 9198 ±0189 3 3大黄酸 20 117190 ±23172 115111 ±21112 4101 ±0134 5113 ±015040 123161 ±26151 126113 ±32107 4110 ±0177 5142 ±0151 380 145152 ±23172 131171 ±24198 4168 ±0139 7107 ±0158 3 3　　与对照组比较 : 3 P < 0105 　3 3 P < 0101　　3 P < 01 05 　3 3 P < 01 01 vs cont rol group主要产生早期凋亡 ,高浓度时 ,中晚期凋亡细胞的比例也有一定增加 ;同样条件下 ,大黄酸诱导 H K22细胞主要产生早期凋亡的作用较弱。4 　讨论　　大黄为常用中药 ,具有泄下、抗菌、抗肿瘤、调血脂等作用[14 ,15 ] 。大黄素的化学名称是 32甲基21 ,3 ,82三羟基蒽醌 ,是大黄总蒽醌中的一个主要活性成
·401· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
表 3 　大黄酸和大黄素对 HK22 细胞凋亡的影响
( x ±s , n = 3)
Table 3 　Effects of emodin and rhein on apoptosis
of HK22 cells ( x ±s , n = 3)
组　别
C/
(μmol ·L - 1 )
早期凋亡
细胞/ %
晚期凋亡和
坏死细胞/ %
存活细胞/
%
对照 - 6121 ±1146 6145 ±1167 87133 ±4110
大黄素 20 8179 ±2153 10133 ±2174 3 76160 ±8167
40 33116 ±3183 3 3 17125 ±3153 3 45142 ±5192 3 3
80 86122 ±7109 3 3 11172 ±1187 3 1102 ±0104 3 3
大黄酸 20 8189 ±2151 12130 ±2163 3 72102 ±9176
40 10132 ±2171 3 14189 ±5191 3 66151 ±7162 3
80 10183 ±2110 3 15146 ±6127 3 66139 ±8163 3
　　与对照组比较 : 3 P < 0105 　3 3 P < 0101
　　3 P < 01 05 　3 3 P < 01 01 vs cont rol group
分。据报道 ,动物亚急性毒性实验和长期毒性实验
结果显示 ,大黄素可导致大鼠肾小管出现病理性改
变。但大黄素引起肾毒性的机制还不清楚。因而本
研究以人肾小管上皮细胞 ( H K22) 为对象 ,评价大
黄素的细胞毒作用 ,并与大黄酸进行比较。本实验
用 M T T 法、形态学方法、PI 和 Annexin V/ PI 染色
等多种检测手段评价了大黄素和大黄酸对 H K22
细胞毒作用 ,结果表明大黄素可抑制 H K22 细胞生
长 ,出现核浓缩、染色体边集等现象 ,同时早期凋亡
细胞比率明显升高 ,而大黄酸的毒性作用强度明显
弱于大黄素。
本实验观察到大黄素诱导 H K22 细胞凋亡的
现象。在凋亡的发展过程中 ,最明显的实验证据是
细胞形态学的变化。与细胞坏死时染色质和细胞器
肿胀、胞膜破裂和胞质溶酶体释放等引起炎症反应
的细胞学特征不同 ,凋亡的共同特征是细胞皱缩变
小 ,细胞核的形态改变尤为突出 ,染色质致密聚集成
斑状及聚集在核膜周边 ,但不引起炎症反应。在另
外的研究中选用 Hoechst 33258 作为荧光探针 ,在
荧光显微镜下观察到大黄素作用下 H K22 细胞核
出现不均匀亮度的蓝色荧光 ,核染色质呈现凝集、边
缘化等凋亡的典型变化。在本研究中 ,透射电镜下
更清楚地看到了这一最具特征性的形态学变化。
本研究进一步用 Annexin V/ PI 双染细胞流式
定量检测了大黄素、大黄酸作用后活细胞、早期凋亡
和中晚期凋亡细胞比例的动态变化。H K22 的活细
胞数在大黄素作用 24 h 内逐渐下降 ,这一时期内细
胞死亡的主要形式是早期凋亡。随着大黄素作用时
间的延长 ,活细胞数进一步下降 ,此时细胞死亡的形
式除早期凋亡外还有中晚期凋亡 (坏死) ,LD H 渗
出率实验结果也与这一结果相一致。LD H 是一种
糖酵解酶 ,存在于机体所有组织细胞的胞质内 ,其中
以肾脏中的量较高。LD H 释放率升高是细胞膜损
伤的标志。细胞在发生坏死或中晚期凋亡时 ,LD H
渗出率均升高 ,因此 ,在大黄素的作用下部分 H K22
细胞是出现了原发性的细胞坏死还是继发于早期凋
亡的中晚期凋亡 ,本实验很难鉴别。但该研究结果
明确表明大黄素主要诱导 H K22 细胞发生了凋亡。
综上所述 , 本实验结果充分说明大黄素对
H K22 细胞具有毒性作用 ,大黄酸也有较轻的毒性
作用 ,大黄素比大黄酸具有更强的体外肾毒性。大
黄素的细胞毒作用可能主要通过其诱导凋亡所
介导。
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