全 文 ：表 3 　计算机设计的 10 个方剂小鼠含药血清抑菌效果
验证结果 ( x ±s , n = 10)
Table 3 　Inhibition of ten Chinese herbal compounds
designed by computer against S. aureus
in serum of mice ( x ±s , n = 10)
方剂
编号
含药血清培养基中的
细菌量/ (cfu ·mL - 1)
方剂
编号
含药血清培养基中的
细菌量/ (cfu ·mL - 1)
对照 (2176 + 01 13) ×107 6 号方 (81 61 + 0146) ×106 3 3
1 号方 (8167 + 01 59) ×106 3 3 7 号方 (11 15 + 0108) ×107 3 3
2 号方 (1127 + 01 07) ×107 3 3 8 号方 (11 22 + 0105) ×107 3 3
3 号方 (7167 + 01 42) ×106 3 3 9 号方 (11 33 + 0105) ×107 3 3
4 号方 (8181 + 01 40) ×106 3 3 10 号方 (21 19 + 0107) ×107 3 3
5 号方 (8149 + 01 52) ×106 3 3
　　与对照组比较 : 3 3 P < 0101
　　3 3 P < 01 01 vs cont rol group
天然药物来治疗这一类疾病的中医药疗法正日益引
起人们的重视 ,而以中医理论指导下由多味中药组
成的复方则是该疗法的基础 ,往往具有独到的疗效
优势 ,如注重机体的整体改善 ,不易形成耐药等。
本实验结果显示伤寒经方中部分方剂可以有效
提高机体抗金黄色葡萄球菌感染的能力 ,表现在给
药组小鼠含药血清抑菌能力相比、对照组有不同程
度的提高。综合这 80 个方剂的组方特点来看 ,大部
分具有高效抑菌作用的方剂都含有性味苦寒 ,祛热
除湿的中药。
在由计算机基于大批动物实验提取得到的伤寒
方组方规律基础上设计出的 10 个排名靠前的有效
组方中 ,也能看到上述规律。经过“训练”以后的计
算机在组方遣药时似乎也遵循了中医“寒病热治 ,热
病寒治”的治法。计算机设计出的方剂疗效相当显
著 ,小鼠含药血清中细菌数量与对照组比值平均在
30 %～40 % ,最差的也有 80 % ,总体抑菌水平超过
伤寒方。也发现 ,计算机设计的部分方剂在药物配
伍方面亦颇具特色 ,值得借鉴。例如 3 号方的组成 :
以祛除湿热药 (黄连、黄柏可分治上、下湿热) 为主 ,
辅之以利水药 (甘遂 ,可导水湿) ,宣肺散表药 (桂枝 ,
可导湿汽) ,保肝药 (白芍 ,中医认为肝藏血并主疏
泄 ,因此可以保持正常的气血运行和津液输布) ,可
能更有助于细菌毒素解毒和排出。
综上所述 ,通过研究可以认为方剂中组成药物
的药性特征与方剂的治疗效果之间有一定的对应关
系存在。利用计算机信息技术将作为中医药理论的
核心内容的中药药性特征与现代药理指标之间存在
的对应关系提取出来 ,在两者之间搭起桥梁 ,并指导
实践是可行的 ,当然这种对应关系可能非常复杂具
有非线性特点。计算机辅助设计中药复方的优势在
于 ,先用计算机进行模拟预试验。由于计算机具有
高速运算能力 ,可以在短时间内完成大批候选复方
的海量预筛选 ,减少后期药理实验验证工作的工作
量 ,从而为寻找更有效的中药复方提供了捷径 ,也可
为中医临床提供更多的基础方剂供化裁时参考 ,是
对传统中医组方方法的有益补充。
参考文献 :
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学教育 , 2006 , 20 (24) : 352401
龙葵碱调控 Bcl22 与 Bax 蛋白表达及 caspase23 活性诱导
HepG2 细胞凋亡的研究
高世勇1 ,2 ,徐丽丽1 ,2 ,季宇彬1 ,2 3
(11 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心 药物研究所博士后科研工作站 ,黑龙江 哈尔滨 　150076 ;
21 国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心 ,黑龙江 哈尔滨 　150076)
摘 　要 :目的 　探讨龙葵碱诱导 Hep G2 细胞凋亡的作用机制。方法 　透射电镜观察凋亡细胞形态变化 ,原位缺口
末端检测法 ( TUN EL 法) 检测 DNA 断裂情况 ,流式细胞术检测细胞凋亡率 ,间接免疫荧光法激光共聚焦扫描显
微术检测 Bcl22 与 Bax 蛋白表达 ,比色法检测 caspase23 活性的变化。结果 　在透射电镜下观察 ,龙葵碱组细胞出
·7061·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
3 收稿日期 :2009206205　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30400591) ; 黑龙江省博士后基金资助项目 ; 教育部博士点基金项目 (200802400001) ; 哈尔滨
市青年基金资助项目 (2004AFQXJ035)
作者简介 :高世勇 (1975 —) ,男 ,博士 ,副研究员 ,研究方向为肿瘤药理学。Tel : (0451) 84800297 　E2mail : sygao2002 @163. com
现细胞固缩 ,染色质致密 ,核凝聚固缩 ,染色体断裂形成核碎块 ,凋亡小体形成等细胞凋亡特征形态。TUN EL 法发
现龙葵碱高、中、低剂量组 Hep G2 细胞均有绿色荧光 ,阴性对照组无荧光。流式细胞术分析表明 014、2、10μmol/ L 龙
葵碱作用 Hep G2 细胞 24 h 凋亡率分别为 410 %、815 %、2011 %。同时 ,龙葵碱升高 caspase23 活性 ,下调 Bcl22 蛋白表
达 ,上调 Bax 蛋白表达。结论　龙葵碱通过降低 Bcl22/ Bax 的值 ,激活 caspase23 酶活性诱导 Hep G2 细胞凋亡。
关键词 :龙葵碱 ; 细胞凋亡 ; caspase23 ; Bcl22 ; Bax
中图分类号 :R286191 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 1021607206
Induction of solanine on HepG2 cell apoptosis by regulation of Bcl22 / Bax expression
and caspase23 activity
GAO Shi2yong1 ,2 , XU Li2li1 ,2 , J I Yu2bin1 ,2
(11 Postdoctoral Program of Insititute of Materia Medica , Center for Life Sciences and Environmental Sciences ,
Harbin University of Commerce , Harbin 150076 , China ; 2. MO E Engineering Research Center
of Natural Anticancer Drugs , Harbin University of Commerce , Harbin 150076 , China)
Abstract : Objective 　To st udy t he mechanism of solanine on apoptosis in Hep G2 cell . Methods 　Mor2
p hology of apoptosis was observed by elect ron microscope ; TUN EL Assay was adopted to observe the
DNA cleavage of apoptotic cells , apoptosis rate was analyzed by flow cytomety. Indirect immunofluores2
cence assay was adopted to st udy t he Bcl22/ Bax protein by Laser Confocal Scan Microscope. Relative
caspase23 activity was determined by colorimet ric assay. Results 　Characteristic morp hology of apoptosis ,
such as shrinkage , chromatin dense , nuclear condensation pool , t he nuclear f ragment s , and apoptotic
bodies , etc. was found. By TUN EL assay , DNA fragmentation was found in solanine group s , but none in
cont rol group . The early apopto sis rates induced by 0. 4 , 2 , and 10 mol/ L solanine were 4. 0 % , 8. 5 % ,
and 20. 1 % , respectively. And solanine increased caspase23 activity of Hep G2 cells and decreased the Bcl22
protein expression , increased t he Bax protein expression. Conclusion 　Solanine could induce t he Hep G2
cell apopto sis by decreasing t he Bcl22 protein expression , increasing t he Bax protein expression to activate
the caspase23 activity.
Key words : solanine ; apopto sis ; caspase23 ; Bcl22 ; Bax
　　龙葵碱 ( solanine) ,别名茄碱 ,主要存在于茄科
植物马铃薯 S ol anum t uberosum L . 的块茎及龙葵
S ol anum ni g rum Linn. 的全草中 ,在马铃薯的绿色
果皮及芽中龙葵碱的量较高 ,毒性较大 ,是中毒的主
要成分。龙葵全草及未成熟的果实中含澳洲茄边
碱、β2澳洲茄边碱、澳洲茄碱、茄微碱及茄达碱等多
种生物碱[1 ] 。本课题组前期研究发现龙葵碱体内能
够延长 H22荷瘤小鼠的生存时间[2 ] ,体外研究发现
龙葵碱对人肝癌细胞 Hep G2 的细胞毒作用较
强[ 3 ,4 ] ,机制研究表明龙葵碱通过诱导肿瘤细胞凋
亡途径达到抗 Hep G2 人肝癌的作用[5 ] ,并且与细
胞内[ Ca2 + ]i 和膜电位有关[ 6 ] 。本研究主要是在前
期工作的基础上 ,通过龙葵碱对 caspase23 酶活性
和 Bcl22/ Bax 蛋白表达的影响进一步深入研究龙葵
碱诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制。
1 　材料与仪器
111 　药品及试剂 :龙葵碱 ,质量分数 99 % ,由黑龙
江省药品检验所提供 ; RPMI 1640 培养基 ,美国
Gibco 公司 ;胎牛血清 ,杭州四季青生物工程材料有
限公司 ; Triton X2100 ,香港 Farco 公司 ;小鼠抗人 Bcl22 一抗 ,小鼠抗人 Bax 一抗购自美国 SantaCruz 公司 ; FITC2山羊抗小鼠 Ig G ,北京中杉金桥生物技术有限公司 ; caspase23 活性检测试剂盒 , An2nexin V2FITC 细胞凋亡检测试剂盒 , 一步法TUN EL 细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。112 　肿瘤细胞株 :人肝癌细胞株 Hep G2 购自美国A TCC ( American Type Cult ure Collection) ,由黑龙江省肿瘤医院肿瘤研究所保种提供。113 　仪器 :CO —150 型二氧化碳培养箱 ,美国 NBS公司 ;SW —CJ —2F 型超净工作台 ,苏净集团苏州净化设备厂 ;SP2 型激光共聚焦扫描显微镜 ,德国 Lei2ca 公司 ;C KX —41 —32 型倒置显微镜 ,日本 Olym2p us 公司 ; H —600 型透射电镜 ,日本日立公司 ; EP2ICS XL —MCL 流式细胞仪 ,美国 Beckman —Coul2ter 公司 ; 6R 型台式冷冻离心机 ,美国 Beckman —Coulter 公司。2 　方法211 　细胞培养及给药 : Hep G2 人肝癌细胞以适量浓度接种于培养瓶中 ,加入含 10 % 胎牛血清 RPMI
·8061· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
1640 的培养液中 ,置于 37 ℃恒温 ,5 % CO2及饱和
湿度的培养箱中培养 ,细胞贴壁生长 ,每 2～3 天传
代 1 次 ,传代时首先倒出培养液 , PBS 洗 3 次 ,胰酶
消化后加入新鲜的培养液吹打均匀 ,调整细胞至适
当浓度移入新的培养瓶中 ,添加培养液至适量。
给药时取指数生长期的 Hep G2 人肝癌细胞 ,
0125 % 胰酶消化细胞后 ,用含 10 % 胎牛血清的培
养基调整为浓度 3 ×105 / mL 的细胞悬液 ,接种于 6
孔板中 ,每孔 1 mL 。将 6 孔板置于 37 ℃、5 % CO2
的二氧化碳培养箱中。培养 24 h 后加入龙葵碱 ,终
浓度分别为 014、2、10μmol/ L ,阳性对照组加入喜
树碱 ,终浓度为 1115μmol/ L ,阴性对照组加相同体
积的培养液。
212 　透射电镜观察龙葵碱诱导 Hep G2 细胞凋亡 :药
物培养 24 h 后收集细胞 ,PBS 洗 3 遍 ,预冷的 2 % 戊
二醛 4 ℃固定 2 h ,1 % 锇酸后固定 115 h ,常规系列
丙酮脱水 ,环氧树脂 Epon 812 包埋 ,超薄切片 ,醋酸
双氧铀及柠檬酸铅双染 ,透射电镜观察 ,拍照。
213 　原位缺口末端标记技术 ( TUN EL) 检测龙葵
碱诱导 Hep G2 细胞凋亡 :培养 24 h 后收集细胞 ,
PBS 洗 3 次 ; 4 % 多聚甲醛固定细胞 30 min , PBS
洗 3 次 ;用含 0. 1 % Triton X2100 的 PBS ( TPBS)
重悬细胞 ,冰浴孵育 2 min。2 min 后 PBS 洗 3 次 ,
避光加入 50μL TUN EL 检测 (10μL Td T 酶 +
240μL 荧光标记液) ,37 ℃避光孵育 60 min。PBS
洗 3 次后 ,用 300μL PBS 悬浮细胞 ,激光共聚焦扫
描显微镜观察 ,激发波长 488 nm ,发射波长 513～
523 nm。
214 　流式细胞仪检测龙葵碱诱导 Hep G2 细胞早
期凋亡率 :培养 24 h 后收集 1 ×105个细胞 ,PBS 洗
3 次 ,加入 195μL Annexin V2FITC 结合液轻轻重
悬细胞 ,再加入 5μL Annexin V2FITC 轻轻混匀。
室温避光孵育 10 min。1 000 r/ min 离心 5 min ,弃
上清 ,加入 190μL Annexin V2FITC 结合液轻轻重
悬细胞 ,然后加入 10μL 磺化丙啶染色液 ,轻轻混
匀 ,冰浴避光放置 15 min。1 000 r/ min 离心 5 min ,
收集细胞 ,100μL Annexin V2FITC 结合液轻轻重
悬细胞 ,300 目尼龙网滤过后 ,在流式细胞仪上测定
细胞凋亡率。激发波长 488 nm ,检测细胞数为
10 000 个。
215 　龙葵碱对 Hep G2 细胞内 caspase23 活性的影
响 :按试剂盒方法进行 ,过程如下 ,培养 24 h 后收集
细胞 ,小心吸除上清 , PBS 洗 3 次。按照每 2 ×106
个细胞加入 100μL 裂解液的比例加入裂解液 ,冰
浴裂解 15 min。4 ℃、16 000 ×g 离心 15 min。把
上清转移到冰浴的离心管中。取少量样品采用考马
斯亮蓝法测定蛋白浓度。将样品加入 96 孔板中 ,
每孔 10μL ,每个样品设 4 个平行孔 ,取 10μL 检测
缓冲液做空白 ,随后每个孔再分别加入 80μL 检测
缓冲液和 10μL Ac2D EVD2pNA (2 mmol/ L) ,充分
混匀。37 ℃避光孵育 120 min 后酶标仪测定 405
nm 处吸光度 ( A 405 ) 值。同时将试剂盒提供的
pNA (10 mmol/ L) 标准品稀释液稀释为 0、10、20、
50、100、200μmol/ L ,作为标准品 ,每个浓度取 100
μL 用酶标仪测定 A 405 ,并绘制标准曲线。样品的
A405扣除空白对照的 A 405 ,即为样品中 caspase23 催
化产生的 pNA 产生的吸光度。通过标准曲线的对
比计算出样品中催化产生的 pNA 量计算 caspase23
活性。
216 　龙葵碱对 Hep G2 细胞内 Bcl22 及 Bax 蛋白
表达的影响 :收集细胞 , PBS 洗细胞 3 次 ,4 % 多聚
甲醛 2 mL 固定 30 min ,弃上清。PBS 洗涤细胞 3
次 ,加入 TPBS 重悬细胞 ,放置 15 min。1 000 r/
min 离心 5 min ,弃上清 ,PBS 洗涤细胞 3 次。加入
小鼠抗人一抗 ( 1 ∶200 稀释) , 4 ℃孵育过夜。
1 000 r/ min 离心 5 min ,弃上清。PBS 洗涤细胞两
次。加入稀释的 FITC2山羊抗小鼠 Ig G (1 ∶100) ,
室温孵育 2 h。1 000 r/ min 离心 5 min ,弃上清。
PBS 洗细胞 3 次 ,并重悬细胞 ,激光共聚焦扫描显
微镜检测荧光强度 ,激发波长 488 nm ,发射波长
513～523 nm。
217 　数据处理 :数据以 x ±s 表示 ,用 SPSS 1310
统计软件对数据进行处理 ,样本比较采用 t 检验。
3 　结果
311 　龙葵碱对 Hep G2 细胞形态的影响 :透射电镜
观察结果见图 1。阴性对照组肿瘤细胞有小突起 ,
核仁明显 ,有粗面内质网 ,线粒体丰富且脊、膜清晰 ;
阳性对照组细胞呈凋亡的形态改变 ,细胞突起减少 ,
胞质浓缩 ,细胞核深染 ,染色质浓缩成块并边聚 ,线
粒体空泡变 ,出现凋亡小体 ;龙葵碱作用 Hep G2 细
胞 24 h 后 ,高、中、低剂量组均出现典型的凋亡细胞
形态改变 ,电镜下表现为细胞固缩 ,染色质致密、边
缘化 ;核凝聚固缩 ,染色体断裂形成核碎块 ,胞质气
泡产生 ,凋亡小体形成 ,线粒体脊消失且肿胀明显 ,
部分线粒体空泡变 ,随着龙葵碱浓度升高 ,凋亡细胞
数量增多。
312 　TUN EL 检测龙葵碱诱导 Hep G2 细胞凋亡 :
TUN EL 染色阳性物质为绿色荧光 ,位于细胞核内 ,
·9061·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
散在分布 ,即阳性着色的凋亡细胞表现为细胞核呈
绿色 ,部分细胞质也可因核 DNA 碎片的逸出而呈
阳性着色。固缩的绿色圆形小体为凋亡小体。正常
非凋亡细胞无荧光。
　　实验结果表明不同浓度龙葵碱及阳性药物作用
24 h 后 ,部分细胞的细胞核内均呈散在绿色 ,阳性
对照组也出现明显凋亡形态 ,阴性对照组无荧光。
见图 2。
313 　流式细胞仪检测龙葵碱诱导 Hep G2 细胞早 期凋亡率 :用 Annexin V2FITC 和 PI 染色后 ,正常的活细胞不被 Annexin V2FITC 和 PI 染色 (如图 3左下角) ;凋亡早期的细胞仅被 Annexin V2FITC 染色 ,PI 染色呈阴性 (如图 3 右下角) ;坏死细胞和凋亡晚期的细胞可以同时被 Annexin V2FITC 和 PI染色 (如图 3 右上角) 。01 4、2、10μmol/ L 龙葵碱分别作用 Hep G2 细胞 24 h 后早期凋亡率分别为410 %、815 %、2011 % ,即龙葵碱诱导 Hep G2 细胞凋亡呈一定的剂量依赖性 ,见图 3。
314 　龙葵碱对 Hep G2 细胞内 caspase23 活性的影
响 :在龙葵碱作用 Hep G2 细胞 24 h 后 ,细胞内的
caspase23 活性随龙葵碱剂量的增大而升高 ,并均显
著高于阴性对照组 ,且升高 caspase23 活性的强度
具一定的剂量依赖性。见表 1。
315 　龙葵碱对 Hep G2 细胞内 Bcl22 及 Bax 蛋白
表达的影响
31511 　龙葵碱作用肝癌细胞 Hep G2 24 h 后细胞内
Bcl22的变化 :实验结果表明 ,龙葵碱作用于 Hep G2 表 1 　龙葵碱对 HepG2 细胞 caspase23 活性的影响 ( x±s , n = 4)Table 1 　Effect of solanine on caspase23 activityin HepG2 cell ( x ±s , n = 4)组　别 C/ (μmol ·L - 1) caspase23 酶活性/ (U ·mg - 1)对照 　　　- 11 37 ± 9196喜树碱 　　　11 15 51 23 ±12137 3 3龙葵碱 01 4 31 47 ±17128 3 32 41 72 ±13155 3 310 51 45 ±14125 3 3　　与对照组比较 : 3 3 P < 0101　　3 3 P < 01 01 vs cont rol group
·0161· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
24 h 后 ,细胞内的 Bcl22 显著低于阴性对照组 ,014、
2、10μmol/ L 龙葵碱组与阴性对照组比较均具有统
计学差异 ( P < 0101) ,且龙葵碱 3 个剂量组降低
Bcl22 的强度具一定的剂量依赖性 ,见表 2。
31512 　龙葵碱作用肝癌细胞 Hep G2 24 h 后细胞
内 Bax 的变化 : 实验结果表明 , 龙葵碱作用于
Hep G2 24 h 后 ,细胞内的 Bax 显著高于阴性对照
组 ,2、10μmol/ L 龙葵碱组与阴性对照组比较均具
有显著统计学差异 ( P < 0101) ,014μmol/ L 龙葵碱
组与阴性对照组比较具有统计学差异 ( P < 0105) 。
且 3 个剂量组升高 Bax 的强度具一定的剂量依赖
性。见表 2。
表 2 　龙葵碱对 HepG2 细胞 Bcl22 及 Bax 蛋白表达的影响
Table 2 　Effect of solanine on Bcl22 and Bax
protein expression in HepG2 cell
组 　别 C/ (μmol ·L - 1 ) 细胞数 Bcl22 ( FI) Bax ( FI)
对照 　- 20 361 84 ±101 17 71 28 ± 91 56
喜树碱 　11 15 20 61 94 ±131 47 3 3 361 31 ± 61 57 3 3
龙葵碱 01 4 20 271 40 ±111 45 3 3 151 55 ±141 28 3
2 20 121 25 ±151 16 3 3 251 27 ±101 96 3 3
10 20 51 78 ±121 28 3 3 451 47 ± 91 34 3 3
　　与对照组比较 : 3 P < 01 05 　3 3 P < 01 01
　　3 P < 0105 　3 3 P < 01 01 vs cont rol group
4 　讨论
　　龙葵碱对 Hep G2 人肝癌细胞具有很好的细胞
毒作用 ,本课题组前期对其进行了广泛的研究 ,发现
龙葵碱诱导 Hep G2 细胞凋亡与调控细胞内第二信
使 —Ca2 + 浓度 ,细胞膜电位[ 6 ] ,钙泵等因素有关。
但这些均为细胞凋亡启动及执行过程中的信号系
统 ,龙葵碱诱导 Hep G2 细胞凋亡的直接靶点或者
是诱导 Hep G2 细胞凋亡的始动部位是哪里 ,是本
研究的主要内容。
Bcl22 属于一类癌基因家族 ,其结构主要由两大
结构域组成 ,即位于羧基端的跨膜结构域和数量不
等的 Bcl22 同源结构域 (Bcl22 homology , B H) ,根
据其所具有的 B H 结构域以及在凋亡中发挥的生
物学效应的不同可被大致分为抗凋亡类蛋白、促凋
亡类蛋白和只具有 B H3 结构域的凋亡蛋白 3 大类 ,
分别以 Bcl22 ,Bax 和 Bid 为代表[7 ] 。细胞凋亡的发
生取决于促凋亡与抑凋亡成员间的相对浓度[8 ] 。
Bcl22 和 Bax 是两类典型的抑凋亡和促凋亡蛋白 ,
有研究表明 ,在促凋亡因素的刺激下 ,Bcl22/ Bax 的
值决定了细胞凋亡或存活。大量研究表明 ,Bcl22/
Bax 值是决定细胞是否凋亡的重要因素。在正常情
况下 ,Bcl22/ Bax 保持一定值 ,并以 Bcl22、Bax 异源
二聚体形式存在。当 Bcl22 增加时 ,Bcl22/ Bax 值增
加 ,Bcl22 同源二聚体增多 ,细胞则趋于存活 ;而 Bax
增加 ,Bcl22/ Bax 值下降 ,Bax 同源二聚体增多 ,细胞
则趋于凋亡。
Bcl22 蛋白是一个线粒体内膜蛋白 ,线粒体上的
Bcl22 多位于线粒体通透性改变孔道 (permeability
t ransition , P T) 处 ,具有抑制线粒体通透性变化的
能力 ,进而影响细胞内 Ca2 + 浓度和膜电位的变化。
鉴于本课题组前期对 Hep G2 细胞内 Ca2 + 浓度和膜
电位变化的考察 ,为了深入研究龙葵碱诱导 Hep G2
细胞凋亡的作用靶点或者始动部位 ,在本研究中进
一步观察龙葵碱对 Hep G2 细胞 Bcl22/ Bax 值的影
响。另外 ,有文献报道 ,Bcl22 是 caspase23 的上游基
因 ,调控 caspase23 的活化[9 ] 。而 Caspase 家族又是
诱导细胞凋亡的最终执行者 ,因此 ,本实验在前期研
究基础上 ,重点观察了龙葵碱对 Hep G2 细胞 Bcl22
蛋白、Bax 蛋白表达量和 caspase23 活性的影响 ,在原
来研究的基础上更深入一层揭示龙葵碱作用机制。
首先通过电子显微镜和 TUN EL 法从形态学
上和生化特征上验证龙葵碱诱导 Hep G2 细胞凋亡
作用。电子显微镜发现相对于阴性对照组肿瘤细胞
有小突起 ,核仁明显 ,有粗面内质网 ,线粒体丰富且
脊、膜清晰[ 10 ]的特征 ,龙葵碱各剂量组均出现典型
的凋亡细胞形态改变 ,电镜下表现为细胞固缩 ,染色
质致密 ,边缘化 ,核凝聚固缩 ,染色体断裂形成核碎
块 ,胞质气泡产生 ,凋亡小体形成 ,随着龙葵碱浓度
增高 ,凋亡细胞数量增多。细胞凋亡的一个显著特
征是细胞染色体的 DNA 降解 ,这种断裂是个渐进
的分阶段的过程。原位缺口末端检测法 ( TUN EL
法) 是一种快速和便捷的检测凋亡细胞 DNA 断裂
的手段之一。本实验采用 TUN EL 法检测龙葵碱
作用 Hep G2 细胞 24 h 后 ,发现细胞染色体 DNA
的断裂。本实验结果再次验证了龙葵碱诱导
Hep G2 细胞凋亡的事实。
采用激光共聚焦扫描显微术检测龙葵碱作用
Hep G2 细胞 24 h 后 ,对细胞内 Bcl22 及 Bax 蛋白
表达的影响。发现龙葵碱能下调 Hep G2 细胞内
Bcl22 蛋白表达 ,上调 Bax 的表达 ,使 Bcl22/ Bax 的
值下降。结合前期结果发现龙葵碱对 Hep G2 细胞
内 Ca2 + 和膜电位的影响 ,推断出 Bcl22/ Bax 值的下
降 ,是其上游影响因素。
同时 Bcl22/ Bax 值又直接调控着 caspase 家族
的激活 ,因此观察了不同浓度龙葵碱作用 Hep G2
细胞 24 h 后对细胞内 caspase23 相对活性的影响 ,
·1161·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
发现龙葵碱能够升高 Hep G2 细胞内 caspase23 相
对活性。提示龙葵碱对 Bcl22 蛋白和 Bax 蛋白的调
控是龙葵碱诱导 Hep G2 凋亡的相对于细胞内 Ca2 +
和 caspase 家族的上游因素。
参考文献 :
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藏药多舌飞蓬不同提取物抗炎镇痛活性及急性毒性研究
张志锋1 ,吴春蕾1 ,刘 　圆1 ,张 　浩2 3
(11 西南民族大学少数民族药物研究所 ,四川 成都 　610041 ; 21 四川大学华西药学院 ,四川 成都 　610041)
摘 　要 :目的 　比较藏药多舌飞蓬不同提取物的抗炎镇痛活性及急性毒性的差异。方法 　样品经水提取 ,采用大
孔吸附树脂纯化工艺 ,制备多舌飞蓬不同提取物 ( EM1、EM2 和 EM3) ;运用角叉菜胶致小鼠足肿胀和二甲苯致耳
肿胀复制炎症模型 ,冰醋酸和甲醛致疼痛小鼠模型 ,观察 EM1、EM2、EM3 的抗炎镇痛活性 ,并比较各提取物的急
性毒性。结果 　多舌飞蓬不同提取物均能减轻二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀度以及角叉菜胶诱导的小鼠足肿胀程
度 ,均具有抑制冰醋酸所致小鼠扭体反应和甲醛所致小鼠足痛反应 ,表明多舌飞蓬不同提取物均有抗炎镇痛作用 ;
小鼠 ig 给药 EM1 的 LD50为原生药 137124 g/ kg ,给予 EM2 的 LD50为原生药 287160 g/ kg ,给予 EM3 最大剂量
(原生药 1 960 g/ kg) 后无动物死亡。结论 　大孔吸附树脂能够有效富集多舌飞蓬中具有抗炎镇痛作用的黄酮类
成分 ,并去除其毒性成分。
关键词 :多舌飞蓬 ; 抗炎作用 ; 镇痛作用 ; 急性毒性
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 1021612203
　　多舌飞蓬 Eri geron m ult i radi at us ( Wall . )
Bent h. 为菊科飞蓬属多年生草本植物 ,主要分布于
我国西藏、四川西部和云南西北部高原地区[1 ] 。在
藏医药中以全草入药 ,其藏药名为“美多罗米”,《晶
珠本草》记载 :“美多罗米 ,味苦 ,清热解毒 ,治瘟病时
疫”[2 ] ;《藏药志》云 :“美多罗米 ,苦、寒、无毒 ;清热解
毒 ;治瘟病时疫、头痛、眼病等”[3 ] 。本课题组先前研
究主要集中在多舌飞蓬的资源分布、化学成分方
面[ 4 ,5 ] ,为了进一步筛选多舌飞蓬中的活性物质 ,对
多舌飞蓬总黄酮部位进行了初步的药效学和急性毒
性试验 ,发现多舌飞蓬具有一定的抗炎镇痛活性 ,但
具有较强的急性毒性 ,因此 ,本课题组采用大孔树脂
纯化得到不同的多舌飞蓬提取物 ,运用化学法诱导
小鼠炎症及疼痛等模型和急性毒性的研究方法[6 ] ,
比较多舌飞蓬不同提取物的抗炎镇痛作用及急性毒
性的差异 ,为多舌飞蓬的进一步开发利用提供科学
依据。
1 　材料
111 　药材及受试药品 :多舌飞蓬药材于 2006 年 7
月采自四川省甘孜藏族自治州炉霍县罗锅梁子 ,经
笔者鉴定为多舌飞蓬 Eri geron m ul t i radi at us
( Wall . ) Bent h. 的干燥全草 ,标本保存于四川大学
·2161· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
3 收稿日期 :2009201219　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :西南民族大学青年重点项目 (26701601)
作者简介 :张志锋 (1973 —) ,男 ,四川成都人 ,博士 ,从事药用植物的资源研究及品质评价。
Tel : (028) 85522322 　Fax : (028) 85522315 　E2mail : zhangzhf99 @gmail . com