全 文 ：中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年10,El· 483·
羟基红花黄色素A人工抗原的制备
侯世斌，李江伟。苏幼红，吕 芳．张富春
(新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐830046)
摘要：目的研究羟基红花黄色素A(HSYA)与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(0VA)的偶联方法，获得具有
免疫原性的羟基红花黄色素A人工抗原。方法 通过偶联物透析液的颜色变化、紫外图谱、红外扫描图谱及动物免
疫试验来鉴定制备的人工抗原。结果HSYA—BSA人工抗原在紫外扫描中表现出HSYA和BSA的特征吸收峰；
在红外扫描中HSYA—BSA具有HSYA特征官能团的吸收峰和氨基酸的特征吸收峰；间接ELISA检测结果显示产
生抗HSYA的特异性抗体，血清效价可达1t 3200；标准曲线方程计算得BSA和HSYA的结合率是1：50。结论
通过直接偶联法成功制备出具有免疫原性的羟基红花黄色素A人工抗原。
关键词：羟基红花黄色素A；人工抗原；直接偶联法；间接ELISA
中图分类号：R286．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)10—1483—04
PreparationofartificialantigenOfhydroxysafflOryellowA
HOUShi—bin，LIJiang—wei，SUYou—hong，LOFang，ZHANGFu—chun
(CollegeofLifeScienceandTechnology，XinjiangUniversity，Urumqi830046．China)
Abstract：ObjectiveTodevelopthepropermethodforconjugatinghydroxysaffloryel wA
(HSYA)withcarrierprotein，bovineserumalbumin(BSA)andovalbumin(OVA)，aswellaspreparation
ofartificialimmunogenfHSYA．MethodsImmunogenHSYA—BSAandcoatinga tigenHSYA—OVA
werepreparedbyimmediatecouplingmethod．andthecharacterizationsoftheartificialantigenw restud—
iedbycolorchange，ultraviolet，andinfraredradiationspectrashift，andmiceimmunizationoftheco ju—
gate．ResultsHSYA—BSAArtificialantigenexhibitedcharacteristicultravioletspectraofBSAandHSYA
andshowedobviousab orptionpeaki characteristicfunctionalgroupofHSYAandaminoacidininfrared
radiationspectra．TheimmunizedmiceantiserumspecificallyboundtheHSYA：Thespecificantibodyfor
HSYAwasdeterminedbyindirectELISA．Thedet rminationof ntiserumwas1：3200．Theconjugating
ratebetweenBSAandHSYAwas1：50calculatedbyr gressionequation．ConclusionTheart ficialim—
munogenofHSYAissynthesizedbyimmediatecouplingmethodsuccessfully．
Keywords：hydroxysaffloryellowA(HSYA)；artificialant gen；immediatecoupling；indirectELISA
红花黄色素是红花的主要水溶性组分，为多种
黄酮类混合物，具有活血通经、祛疲止痛等功效。其
中小分子有效成分羟基红花黄色素A(HSYA)是红
花的主要药效物质，是评价红花药材质量及相应中
药制剂质量的主要指标。目前对该类小分子的成分
分析主要采用高效液相色谱法测定，但是该方法的
最大缺陷是重复性差、检测步骤多和需要专用设
备[1叫]。根据抗原抗体特异性结合原理，采用免疫酶
标技术可以经济、简便、同步大量的测定红花样品中
的HSYA。实现本技术的关键是制备特异性高、亲
和性强的抗体，但是HSYA是一种小分子半抗原，
本身只具有免疫反应性而没有免疫原性，它只有结
合到蛋白质等大分子物质上才可以用于动物免
疫[5卅]。目前把小分子半抗原结合到大分子物质上
采用的方法有高碘酸钠法、戊二醛法、混合酸酐法、
碳二亚胺法等。因此本实验考察了羟基HSYA与牛
血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(0VA)的结合技术和
相应的鉴定方法，采用直接合成法制备了高质量的
人工抗原，为下一步获取高特异性的羟基HSYA抗
血清和研发相应的高灵敏度的检测试剂盒提供参考。
1材料
HSYA(新疆维吾尔自治区药品检验所赠，经
HPLC法鉴定其质量分数大于90％)，甲醇(分析
纯，西安化学试剂厂)，BSA(Mw67000)、OVA
(Mw45ooo)均为Sigma进口分装，弗氏完全佐剂
(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)和四甲基联苯胺
收稿日期：2007—12一07
基金项目：科技部省部共建新疆生物资源基因工程重点实验室开放基金资助(XJDX0201—2006—04)
作者简介：侯世斌(1970一)．男．新疆伊犁人，在读研究生．从事分子免疫学研究。E—mail：hsbl21@sohu．com
*通讯作者李江伟Tel：(0991)8583259E—mail：jiangwei．1ee@163．corn

万方数据
·1484· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年10月
(TMB)为Sigma产品，辣根过氧化物酶标记羊抗兔
IgG(北京博奥森生物技术有限公司)，BCA蛋白测
定试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)，其他试
剂均为国产分析纯。昆明种雌性小鼠，体质量18,-一
22g，购自新疆医科大学动物中心。
U一3010Spectrometer(日本Hitachi公司)；
ND一1000Uv／Vis超微量分光光度计(美国NRTL
公司)；傅里叶一拉曼红外光谱仪；真空冷冻干燥机
(德国CHIST)；BenchmarkPlus酶标仪(日本
BIO—RAD公司)。
2方法与结果
2．1人工抗原HSYA—BSA的制备：以80％甲醇为
溶剂，配制1mg／mLHSYA溶液，滤过，低温保存
备用。以水作溶剂，现用现配制1mg／mLBSA溶
液。分别取HSYA溶液和BSA溶液各10mL，将
BSA缓慢地滴加到HSYA溶液中，于4℃下轻微搅
拌过夜。将反应后的反应液移入透析袋中，置于50
倍以上的蒸馏水中于4℃下透析3d，每天换水3
次，以透析袋颜色不再发生变化为止。将透析产品用
蔗糖浓缩，并采用BCA法测定蛋白水平，结果近似
认为是HSYA—BSA的水平。然后将产品分装于一
70℃冰柜过夜，真空冷冻干燥，备用(避免反复冻融
样品)。
包被抗原选用OVA作为载体，合成方法同
HSYA—BSA。
2．2人工抗原的鉴定：从透析的颜色变化、紫外图
谱、红外扫描图谱以及特异性的抗血清的产生进行
鉴定。
2．2．1 反应溶液颜色变化：HSYA的甲醇溶液为
黄色，BSA的水溶液为无色，将二者过夜反应的混
合液置于透析袋透析，随着透析次数的增加，袋内黄
色会变淡。但经过3d透析后，袋内颜色最终不再发
生变化，保持淡黄色，说明溶液中不存在游离的
HSYA，保持的淡黄色是HSYA和BSA结合后的
颜色。透析液经蔗糖浓缩，黄色又见加深。
2．2．2人工抗原的紫外光谱：以最后一次的透析液
为空白对照，将HSYA、BSA和透析前后的反应产
物HSYA—BSA分别做紫外光谱鉴定，见图1。可见
HSYA在321、400rim处有最大吸收峰，BSA在
280nm处有最大吸收峰。透析前的混合物峰形不明
显，尤其是280、275nm处的吸收峰没有凸现，这主
要是过多的HSYA没有除去，掩盖了蛋白的特征吸
收峰。透析后的HSYA—BSA在275nm处有最大吸
收峰，同时保留有HSYA的321、400nm的特征峰。
O．7
0．6
O．5
t
O．4
O．3
0．2
O．1
O．0
Z20275)2537542， 4巧
X／nm
1-O．5mg／mLHSYA2-透析后0．85mg／mLHSYA—BSA
3-未经透析的0．75mg／mLHSYA—BSA4-1mg／mLBSA
I-0．5mg／mLHSYA2-0．85mg／mLHSYA—BSAafterdialysis
3-0．75mg／mLHSYA—BSAbeforedialysis4-1mg／mLBSA
图I HSYA、BSA、HSYA—BSA的紫外光谱
Fig．1UVAbsorptionspectraofHSYA，BSA，
andHSYA—BSA
表明合成的人工抗原保留了280nm的特征吸收
峰，只是受HSYA基团的影响使蛋白特征峰蓝移至
275nm处，同时又保留HSYA的321、400nm的特
征峰。由此可以初步推断HSYA已经结合到BSA上。
2．2．3人工抗原的红外光谱：见图2。比较BSA和
HSYA—BSA的红外光谱发现，在3600～3200
cm-1(0一H的伸缩振动)具有相似的吸收峰，在
1 700～I600cm-1(酰胺键1680cm．1)，(蛋白质中
氨基酸的特征峰)亦具有相似的吸收，只是合成后的
C=0键的吸收强度变弱，说明合成的HSYA—BSA
具有BSA的特征官能团。比较HSYA与HSYA—
BSA在1100士50cm-1有较强吸收峰，这是C—O—C
的吸收峰，说明HSYA—BSA具有HSYA的特征官
能团。由此证明合成的人工抗原HSYA—BSA偶联
成功，可以作为免疫抗原。
4000 3000 2000 1000
波数／cm—l
图2 HSYA、HSYA—BSA和BSA的红外光谱
Fig．2IRSpectraofHSYA．HSYA—BSAt and
2．2．4抗血清的鉴定：小鼠第1次免疫剂量按每只
50～100jug注射，同时加入等体积的FCA，用注射
器来回抽拉制成乳剂，背部选2--3点皮下注射。问
趴B～
姒

万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第lo期2008年10月·1485·
隔10d加强免疫，免疫剂量按50pg注射，与FIA
制成乳剂，如此共加强5次。每次免疫前小鼠眼部采
血制备抗血清，采用间接ELISA法测定抗HSYA
的抗体水平。检测三免第5天的血清。包被抗原
(HSYA—OVA)质量浓度为2ptg／mL，用3％0VA
作为封闭液，1％OVA作为稀释液，辣根过氧化物
酶标记羊抗兔IgG按照1：2000稀释，用TMB显
色。在450nm／655rim波长处测定吸光度(A)值，以
大于阴性血清A值2．1倍计(P／N≥2．1)阳性，检
测抗HSYA的特异性抗体，血清效价可达1：
3200。见图3。
HSY^-BSA
1．6
器I．2
口
气
昌0．8
气
O．4
O
l：100 l：200 l：4()0l：800h16001：3200
稀释倍数
圈3 HSYA—BSA免疫小鼠血清ELISA分析
Fig．3ELISAAnalysisofserumfrommice
immunizedbyHSYA—BSA
2．3半抗原与蛋白结合比的测定
2．3．1 HSYA的标准曲线和线性方程的建立：
HSYA溶液按照1000、500、250、125／生g／mL稀释，
以最后一次的透析液为对照，分别进行紫外扫描，得
HSYA标准曲线方程A=0．0006C一0． 064，，．=
0．9998，测定范围O～1mg／mL。
2．3．2BSA的标准曲线和线性方程的建立：BSA
溶液按照2、1、0．5、0．25mg／mL稀释，以最后一次
的透析液为对照，分别进行紫外扫描，得BSA标准
曲线方程A=0．0669C+0．0108，，．=0．9996，测
定范围0．25～2mg／mL。
2．3．3测定：由于BSA在400nm处的A值几乎
为零，在BSA质量浓度低的情况下可以忽略不计，
所以可以认为HSYA—BSA在400llm的A是由结
合上的HSYA引起的。根据建立的线性方程计算免
疫抗原和包被抗原上结合的HSYA数目。测定
HSYA—BSA结合物在400nm的A，将其代入
HSYA的标准曲线方程得到HSYA的质量浓度为
0．277mg／mL。根据HSYA和BSA的质量浓度，可
以得出HSYA—BSA中二者的结合比为50：l。同样
的方法得到HSYA—OVA的结合比为112．8：1。
3讨论
日本九州大学药学府正山征洋教授针对中药有
效成分专门进行单克隆抗体的制备，并对其在中药
领域的应用进行了广泛的探讨，取得了可喜的成就。
正山征洋教授实验室许多中药有效成分的人工抗原
获取是采用高碘酸钠法制备的，于是笔者也曾采用
过碘酸钠法制备HSYA—BSA免疫抗原和HSYA—
OVA包被抗原。虽然合成的人工抗原保留了
321nmHSYA的特征峰，进行SDS—PAGE电泳分
析也出现一条相对分子质量大于6．7×104的条带，
但经过五免小鼠始终没有检测到抗HSYA的抗体。
相反，采用直接合成法反应条件温和，HSYA上两
个大的亲水基团几乎不被破坏，合成的HSYA—BSA
人工抗原经过二免就检测到针对HSYA的特异性
抗体。初步推断认为经过高碘酸钠处理后，HSYA
芳环1、2位原子活化的同时可能会破坏HSYA上
的两个大的亲水基团，结果导致HSYA的400nm
特征峰也消失。事实上恰好是这些被破坏的亲水基
团非常利于小鼠产生相应抗体。因为HSYA上大的
亲水基团遭到破坏，它结合到蛋白质上后就会变成
蛋白质的一个疏水性的基团，这样它就会因为疏水
相互性作用被蛋白包裹到内部而不能够直接和B
细胞的表面接触，从而也就不会有机会刺激B细胞
产生针对HSYA的抗体[8]。这应该就是用过碘酸钠
法的免疫原经过五免始终不能激发机体产生抗
HSYA抗体的根本原因。直接法合成不会破坏
HSYA上的两大亲水基团，所以结合到BSA上就会
成为蛋白质的一个外露的人工抗原决定簇，这样外
露的人工抗原决定簇就有可能直接与B细胞表面
接触，最终会刺激机体产生相应抗体。
采用直接合成法合成HSYA人工抗原是一种
新方法。从化学结构上分析，HSYA上的羰基比其
他基团活泼，在弱酸性(一般在醋酸的催化下)反应
体系中，酸的作用是增强羰基的亲电性，使其有利于
亲核试剂的进攻，它容易同氨基酸残基上的氨基加
成缩合形成一个不稳定的中间体，此中间体一经形
成，氢离子立即由氮移至氧上，形成醇胺。最后由醇
胺中失去一分子水，形成碳一氧双键。另外，在弱酸性
反应体系中，可以控制酚羟基参与反应，避免酚负离
子(C。H。O一)作为亲核试剂参与反应，结果会使反应
产物更加单一稳定。所以将BSA缓慢滴加到HSYA
溶液中并于4℃下轻微搅拌过夜的整个过程，保持
反应体系处于偏酸性有利于得到目的产物。但是确
切的反应机制需要进一步的实验验证。
致谢：新疆大学理化测试中心唐健老师、化工学
院谢正峰博士、王尉及王儒祥硕士给予帮助。
参考文献：
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万方数据
·1486· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年10月
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Box—Behnken中心组合设计优化甘草酸二铵缓释片的处方
马伟，尹莉芳。，周建平，赵存婕
(中国药科大学药学院，江苏南京 210009)
摘要：目的考察甘草酸二铵缓释片的制备工艺，并对其体外释药机制进行研究。方法采用羟丙基甲基纤维素
(HPMCk4m)、山箭酸甘油酯为骨架材料，制备甘草酸二铵缓释片I使用Box—Behnken中心组合设计试验方案，借助
试验设计软件DesignExpert绘制响应面曲线图．筛选适合的处方；并通过方程拟合探讨释药机制。结果按预测
处方制备的缓释片，在2、4、8、12h的体外累积释放率均值分别为32．55％、49．94％、73．88％、97．89％。对其体外释
药曲线进行模型拟合．结果表明药物的释放机制为扩散和骨架溶蚀二者的协同作用。结论 验证试验证实了预测
处方与实际处方之间具有较好的拟合度，Box—Behnken中心组合设计可以应用于甘草酸二铵缓释片处方的筛选。
关键词：甘草酸二铵I缓释片；Box—Behnken中心组合设计
中图分类号：R286．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)10—1486—05
Optimizedformulationofdiammoniumglycyrrhizinatesust ined—releasetablet
byBOX—Behnkendesign
MAWei，YINLi—fang，ZHOUJian—ping，ZHAOCun—jie
(CollegeofPharmacy，ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing210009，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatethepreparationtech iqueandoptimalformulationofdiammoni—
amglycyrrhizinatesust ined—releasetabl tandstudythereleasemechanismofdiammoniumglycyrrhizi—
natereleasefromthetablet．MethodsUsingHPMCk4m．Compritol888asskeletonmaterialtoprepare
thediammoniumglycyrrhizinatesustained—releasetablet．TooptimizetheformulationsbyB x—Behnken
design，anduseDesignExpertprogramforstatisticalanalysisofexperimentalresults．Releasemechanism
ofdiammoniumglycyrrhizinatefromsustainedreleasetabletsWaSestablishedbyequationfitting．Results
Theaverageccumulatereleaseratesofdiammoniumglycyrrhizinatesust ined—releasetabletsin2，4，8．
and12hwere32．55％，49．94％，73．88％，and97．89％．Andthereleaseofdiammoniumglycyrrhizinate
couldbecontrolledbydiffusionassociatedwitherosion．ConclusionBox—BehnkendesigncouldbeSUC—
cessfullysedtooptimizethesustained—releasetabletofdiammoniumglycyrrhizinate．
Keywords：diammoniumglycyrrhizinate；sustained—releasetablets；Box—B hnkendesign
甘草酸二铵(diammoniumglycyrrhizinate)是
在甘草的有效成分及其衍生物的基础上研究的第三
代产品，lI缶床应用多年，除在治疗病毒性肝炎方面取
得显著疗效外，还被广泛应用于临床各个领域，治疗
多种疾病和理化因素引起的肝脏损伤。由于肝炎需
要长期治疗，而目前市场上的甘草酸二铵注射剂和
胶囊剂用药次数频繁，患者用药不便，且血药浓度波
动较大，因此将甘草酸二铵制备成为持续24h释药
的缓释制剂可以提高患者的顺应性，降低药物不良
反应。响应曲面优化设计法(responsesurface
收稿日期：2007—12-07
作者简介：马伟(1981一)，男，内蒙古包头市人．中国药科大学药剂学专业硕士研究生，从事药物新剂型与新技术的研究。
L。realI：Xmgmwe163．corn
-通讯作者尹莉芳Tel：(025)85391080E—mail：lifangyin@hotmail．corn

万方数据
羟基红花黄色素A人工抗原的制备
作者： 侯世斌， 李江伟， 苏幼红， 吕芳， 张富春， HOU Shi-bin， LI Jiang-wei， SU You-
hong， L(U) Fang， ZHANG Fu-chun
作者单位： 新疆大学生命科学与技术学院,新疆,乌鲁木齐,830046
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(10)
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隆抗体的制备[期刊论文]-解放军预防医学杂志2006,24(6)
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3.赵玉男 中药有效成分半抗原抗体应用研究进展[期刊论文]-中国中药杂志 2013(5)
4.赵宁毅.张婷 中药小分子化合物人工抗原的制备及鉴定[期刊论文]-时珍国医国药 2012(7)
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