全 文 ：中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9,El·1347·
● 药理与临床
苦参碱诱导人肝癌细胞BEL-7402自吞噬性死亡
皇甫超中，刘 彬，马永超，邓锦波
(河南大学医学院神经生物学研究所，河南开封475004)
摘 要：目的 研究苦参碱诱导人肝癌BEL．7402细胞自吞噬和自吞噬性死亡作用。方法体外培养人肝癌BEL一
7402细胞，应用MTT法测定细胞增殖抑制率，流式细胞术测定细胞凋亡，自噬体标记物LC3免疫荧光定量检测
自吞噬，透射电镜分析细胞自吞噬死亡超微结构改变。结果 苦参碱抑制细胞增殖呈质量浓度依赖性，作用48h
的IC5。值为L1mg／mL；0．6～1．6mg／mL苦参碱作用12h可诱导BEL-7402细胞凋亡逐渐增多，1．2mg／mL作
用12h时细胞凋亡率达(44．88士0．78)％；1．2rng／mL苦参碱持续作用可以诱导自吞噬阳性细胞逐渐增多，作用
12h时自吞噬阳性细胞达(63．16士0．29)％；超微结构显示细胞凋亡呈现自噬性细胞死亡特点。结论苦参碱体
外能诱导BEL一7402细胞自吞噬和自噬性死亡。
关键词：苦参碱}自噬}自噬性死亡l肝癌细胞BEL一7402
中图分类号：R286．91 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)09—1347一04
AutophagicdeathnducedbymatrinenBEL-7402cells
HUANGFUChao—shen，LIUBin。MAYong—chao，DENGJin七o
(InstituteofNeurobiology，MedicalCollegeofHenanUniversity，Kaifeng475004，China)
Abstract：ObjectiveTostudytheffectsofmatrineo inducingautophagyandautophagicdeathin
BEL一7402cells．MethodsBEL一7402cellswereculturedinRPMll640aloneorexposedtOdifferent
concentrationofmatrine．Cellgrowthin ibitionwasassessedbyMTTassay．Apoptosiswasevaluatedby
flowcytometry．AutophagosomemarkerLC3wasexaminedbyimmunofluorescencemicros opy．The
ultrastructurechangeofceilswasanalyzedbytransmissionelectronmicroscope．ResultsThecell
proliferationw snhibitedbymatrinenadosedependentma ner．ItsIC50valuewas1．1mg／mLat48h．
Treatmentwith0．6—1．6mg／mLmatrinefor12hinducedapoptosisfBEL-7402cellsandtheapoptosis
ratereached(44．88士0．78)％atconcentrationof1．2mg／mL．Theautophagypositivecellsweregreatly
increasedfter1．2mg／mLmatrinetreatedinBEL一7402cellsandthenumberofcellsreached(63．16±
0．29)％．Morphologicalfeaturesoftypicalautophagicdeathwereapparentinthecytoplasmatthe
uitrastructurallevel．ConclusionMatri ecouldinduceautophagyandautophagicdeathofBEL一7402cells
invitro．
Keywords：matrine，autophagy；autophagicdeath；hepatomaeellBEL-7402
苦参碱是豆科槐属植物苦参Sophora
yTavescensAit．，苦豆子SophoraalopecuroidesL．
等中药的活性成分，是苦参类生物碱的代表，其诱导
肿瘤细胞凋亡和分化作用受到极大关注[1]，目前苦
参碱及多种苦参类生物碱已应用于临床肿瘤的治
疗，但苦参碱诱导肿瘤细胞凋亡的形式尚未明了，特
别是对肿瘤细胞自吞噬的影响尚未见报道，开展苦
参碱对肿瘤细胞死亡形成的研究，有助于深入了解
其药理作用。
细胞死亡形式除细胞坏死外，还有程序性细胞
死亡。根据形态学可以把程序性细胞死亡分为凋亡
和自吞噬死亡两类，凋亡清除单个细胞，而后由巨噬
细胞通过胞吞作用清理细胞残骸。自吞噬则是一种
胞质降解过程，负责清除包括细胞器在内的胞质组
分，其标志性步骤是内质网来源的“分离膜”包裹住
待降解部分形成自噬小体，最后通过非caspase依
赖途径凋亡[2]，关于苦参碱诱导肝脏肿瘤细胞凋亡
已有相关报道[3]，本研究进一步研究苦参碱诱导肝
收稿日期：2008—01—09
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30670688)}国家环保公益性行业科研专项经费项目(2008467115)
作者简介：皇甫超申(1964一)。男，河南周口市人．副教授·医学硕士．硕士生导师，长期从事肝癌肿瘤生物学研究，负责国家环保公益性
行业科研专项l项，在该领域发表论文12篇．出版专著2部，获省部级奖3项。
Tel(0378)3880585E—mail：chaoshen6403@henu．edu．ca
万方数据
．1348· 中草蒋 ChineseTraditionaIandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月。
癌细胞自吞噬性死亡及其与凋亡的关系，深入探讨
其诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制。
1材料
1．1细胞株：肝癌细胞株BEL一7402购自中国科学
院医学科学研究所。生长在含Io％热灭活胎牛血
清的RPMI一1640培养基中，置5％C02、37℃恒温
密闭式孵箱内培养传代。
1．2 药物及试剂：苦参碱注射液(商品名：斯巴德
康)10g／L，5mL／只，批号980304，购自广州明兴
制药厂；RPMI一1640购自Gibeo公司；MTT购自
Promego公司，100mg溶于20mLPBS滤过后避
光保存。DMSO购自Solarbi公司，Hoechst33258、
兔抗人MAPl一LC3一I多克隆抗体、FITC标记的羊
抗兔IgG、3一甲基腺嘌呤(3-MA)购自Sigma公
司。AnnexinV—FITC／PI试剂盒购自北京生物技术
有限公司。
2方法
2．1 苦参碱对细胞增殖的影响：细胞用0．25％胰
酶消化成细胞悬液，计数调整细胞数为1×104／
mL，接种于96孔细胞培养板，每孔100弘L，重复5
孔，于37℃、5％CO。中培养24h后换液，分别用不
同质量浓度的苦参碱处理细胞，MTT比色法测定
分组：对照组，只加完全培养液；药物组，按照实验分
组加入培养细胞悬液和终质量浓度分别为0．6、
0．8、1．2、1．6mg／mL苦参碱。设5个平行孔，继续
培养细胞48h。每孔加入5mg／mLMTT20肛L，
37℃、5％CO：培养箱中培养4h后，吸去培养液，
每孔加入DMSO100pL，于振荡器上振摇，待蓝色
晶体完全溶解后，在酶标仪上测定570nm处的吸
光度(A)值，实验重复3次。计算细胞生长抑制率
[抑制率=1一A药物／A对照)×100％]。根据药物效应
中效方程式[．]计算药物半数抑制浓度(IC。。)。
2．2实验分组：根据MTT结果得出的IC。。值，实
验分为对照组、苦参碱组、苦参碱+3一MA组。对照
组仅加入RMPI一1640细胞培养液；苦参碱组给予
终质量浓度1．2mg／mL的苦参碱；苦参碱+3-MA
组，3一MA于苦参碱(终质量浓度为1．2mg／mL)
处理前1h加入，使3-MA终质量浓度为4．5pg／
mL，再与苦参碱共同作用不同时间。
2．3细胞凋亡检测：采用FITC—annexinV／PI双
染法。各组药物分别作用6、9、12h收集细胞至10
mL的离心管中，每样本细胞数为1×106／mL，
1 000r／rain离心5min，弃去培养液。用孵育缓冲
液洗涤1次，1000r／min离心5min，用200弘L的
结合液重悬细胞，加入AnnexinV—FITC／PI溶液
5弘L4℃下孵育20rain，最后补PBS400pL，以流
式细胞仪(FACSalibur，BD公司)检测细胞凋亡
情况。每个样品检测1×104个细胞，实验重复3次，
用CellQuest软件进行细胞凋亡分析。
2．4细胞自噬体免疫荧光检测：各组细胞接种于经
多聚赖氨酸预处理的盖玻片于6孔板中，24h后加
药处理，于不同时间点取出盖玻片，4％多聚甲醛固
定细胞15min，固定的细胞用PBS洗两次后，加入
0．25％Triton--X100冰上放置5rain，然后加入
1％牛血清白蛋白(BSA)处理30rain，加入BSA
稀释的兔抗人MAPl一LC3一I(1：100)4℃孵育
过夜，次日细胞用PBS洗3次后，加入FITC标记的
羊抗兔IgG(1％BSA以1：20比例稀释)室温下
避光孵育30min，PBS再次洗涤细胞后，双蒸水洗2
次，阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤相同，
Olympus--BX51荧光显微镜观察，实验重复3次，
参考Tamai等方法[5]，细胞内出现两个以上亮染点
为LC3阳性细胞，用阳性细胞占总细胞的百分比定
量自噬细胞。
2．5透射电镜标本的制备：各组经处理后12h收
获细胞，用2．5％戊二醛及1％锇酸双重固定，乙
醇丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，德国LEICA
ULTRACUTU T超薄切片机切片，醋酸双氧铀
和枸橼酸铅双重染色后，JEM100CX—I透射电镜
观察，拍照，记录。
2．6 统计学分析：数据均采用；±s表示，应用
SPSSl2．0软件包处理，进行单因素方差分析及两
两比较t检验。
3结果
3．1苦参碱对BEL一7402细胞生长抑制作用：不同
质量浓度苦参碱作用48h对肝癌细胞BEL一7402
生长具有抑制作用，抑制率与药物质量浓度正相关，
呈剂量依赖关系，IC。。为1．1mg／mL。结果见表1。
表1苦参碱对肝癌细胞BEL一7402生长的抑制作用
(；士s，开=5)
Table1 Inhibitionofmatrineo growth
ofBEL一7402cellsG+s，n=5)
与对照组比较：。P
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3．2 苦参碱对BEL一7402细胞凋亡的影响：1．2
mg／mL苦参碱作用6、9、12h，流式细胞术分析，与
对照组相比，苦参碱组细胞凋亡率明显增加。苦参
碱+3一MA组细胞凋亡率与苦参碱组相比明显下降。
各组12h时间点流式细胞术AnnexinV—FITC／PI
双染细胞分布见图1，各时间点定量结果见表2。
A一对照组B苦参碱组c一苦参碱+3一MA组
A—-controlgroupB-matrinegroupC··matrine+3·-MAgroup
图l苦参碱处理12h对BEL一7402细胞凋亡的影响
Fig．1Effectofmatrineo apoptosisofBEL一7402cellstreatedfor12h
表2苦参碱处理不同时间对BEL一7402细胞凋亡的影响
Q士s，n=3)
Table2 Effectofmatrinetr atmentfordifferenttimes
onapoptosisofBEL-7402cellso士j，n=3)
e／ 凋t辛／％组尉——
(f．g·mL一1) 6h 9h 12h
对照 一 2．35±0·37 Z·97±O·22 3·11i0·04
苦参碱 1 200 37．29+0．16。’39．27士0．98。。44．88i0．78。。
董苎苎±!：坚皇．!!!!±!：!!：!!圭!：!!竺兰：丝圭!：!!竺 !!：!!圭!：!!兰
与对照组比较：一P<0．01，与苦参碱组比较：aP<0．05
。。P<0．01口jcontrolgroup，△P<0．05V5matrinegroup
3．3免疫荧光观察苦参碱对BEL一7402细胞自吞
噬的影响：对照组细胞未加任何影响，只有极少量的
LC3阳性颗粒位于个别细胞质内，呈亮绿色点状荧
光，自吞噬阳性细胞数非常少。苦参碱组可见大部分
细胞质内出现LC3阳性颗粒，亮绿色点状荧光密
集，表明白吞噬体增多，自吞噬阳性细胞与对照组相
比明显增多。自噬特异性抑制剂3一MA可明显抑制
苦参碱诱导的BEL一7402细胞自吞噬，见表3。
3．4透射电镜观察苦参碱诱导的BEL一7402细胞
自吞噬超微结构变化：正常BEL一7402细胞胞质丰
富，核仁明显，自吞噬现象少见。苦参碱组可见许多
表3苦参碱对BEL．7402细胞自吞噬的影响。士$，n=3)
Table3 Effectofmatrineo autophagy
ofBEL一7402cells(；士j，n=3)
组翻p／
(flg·ⅢL-1)
自噬阳性细胞／％
对照 一 2．17士0．16 2．74+0．132．61士O．23
苦参碱 1200 57．Z8士0．37。。61．12i0．43。’63．16i0．29。。
董垄苎±!：坐!!!!±!：!!：翌圭!：丝!!：!!圭!：!!竺型!圭!：!竺．
与对照组比较l—P
自噬体，自噬溶酶体和凋亡小体，自噬体由囊泡包裹
线粒体、内质网等细胞器；自噬溶酶体较自噬体电子
密度高，隐约可见遗留的线粒体嵴的痕迹；碎块的核
被包裹形成凋亡小体，细胞退变表现为内质网核糖
体脱颗粒，细胞器高尔基体解体，线粒体嵴扩张，粗
面内质网扭曲，细胞浆空泡化，核染色质浓缩边集，
附在核膜周边，以后细胞核固缩成均一的致密物，进
而核碎裂，胞膜完整，微绒毛减少，可见细胞膜出泡
的凋亡改变。在苦参碱3一MA组，细胞中自噬体明
显减少，个别细胞胞浆空泡化，但仍可诱导细胞凋
亡，凋亡细胞核皱缩变小，异染色质边集，可见凋亡
小体，见图2。
A一对照组p苦参碱C一苦参碱+3一MA组标尺=1pm
A—controlgroupB-matrinegroupC—matrine+3一MAgroupBar一---1Ⅱm
图2 BEL一7402细胞自吞噬和凋亡超微结构变化
Fig．2AltrastructuralchangesofautopbagyandapoptosisinBEL一7402cells
万方数据
·1350· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月
4讨论
研究发现，肿瘤细胞系中自吞噬的水平总比正
常细胞中的低“]，在哺乳动物癌症发生实验中，可以
观察到自吞噬能力的下降口]。同时，自吞噬体基因
Beclin一1异质性的断裂也可以增加小鼠肿瘤的发
生[81。这意味着自吞噬能力的下降打破了细胞蛋白
质合成与自噬降解长寿命蛋白的平衡，促进了肿瘤
的发生，反之，自噬能力的增加可防止肿瘤的发生。
从流式细胞术结果分析，苦参碱可以明显诱导
BEL一7402人肝癌细胞凋亡，自噬特异性抑制剂3一
MA可以抑制部分细胞凋亡，说明自吞噬参与了细
胞凋亡。用早期自吞噬体特异性标志物微管结合蛋
白轻链LC3一I[91免疫荧光检测发现，苦参碱在早期
即可诱导细胞发生自吞噬，在作用9h达到高峰，用
3-MA与苦参碱共同作用可以明显抑制自吞噬的发
生，透射电镜结果也证实了这一点。
从超微结构分析凋亡和自吞噬是目前公认的客
观指标，结果表明，苦参碱可以诱导典型的细胞凋
亡，即I型凋亡，同时还可见到形态学表现为既有自
噬又有凋亡的程序性细胞死亡特征，根据文献报道，
这种死亡形式可以认为是自吞噬性死亡，即I型凋
亡[1州，本实验发现3-MA可明显抑制自噬，与此同
时，凋亡也明显减少，提示自吞噬和凋亡之间有密切
联系。有实验显示，在特定条件下，自吞噬体可以转
化为凋亡小体，当细胞通过自吞噬无法清除损伤的
细胞器就会转为凋亡，因为他们有共同的膜包裹机
制，有共同的包含物[1¨，从两种细胞死亡的膜包裹
行为可以看出，主动的细胞死亡是一种保护性机制，
防止了内容物溢出而产生有害作用，有利于凋亡小
体以散离的形式解体，因此较出泡的形式更能节省
能量。
实验中发现，应用3-MA虽可明显抑制自吞
噬，但不能完全抑制凋亡发生，仍可以见到部分细胞
发生凋亡。关于这种现象，有报道3-MA可以延迟
凋亡但并不能阻断凋亡，不管诱导或抑制自吞噬，对
凋亡的发生未产生明显的影响，相反也有报道一旦
自吞噬启动，即使应用凋亡抑制剂仍然发生自噬性
的细胞死亡[1引，认为自吞噬与凋亡没有因果关系，
自吞噬与凋亡是两条不同的程序性细胞死亡路径。
本研究表明苦参碱既能够诱导自吞噬也可以诱导凋
亡，结果一样都可以表现凋亡的形态改变。
综上所述，苦参碱通过唤起原本很低水平的自
吞噬，诱导自吞噬性死亡是抑制肝癌细胞增殖的机
制之一。这种自吞噬性死亡的信号传导途径尚需进
一步研究。
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万方数据
苦参碱诱导人肝癌细胞BEL-7402自吞噬性死亡
作者： 皇甫超申， 刘彬， 马永超， 邓锦波， HUANGFU Chao-shen， LIU Bin， MA Yong-chao
， DENG Jin-bo
作者单位： 河南大学医学院神经生物学研究所,河南,开封,475004
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(9)
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