全 文 ：华细辛 AFLP 反应体系的建立和优化
耿盼盼1 ,2 ,杨冬之2 3 ,王勇波1 ,刘 　忠1 3
(11 上海交通大学药学院 ,上海 　200240 ; 21 郑州大学 生物工程系 ,河南 郑州 　450001)
摘 　要 :目的 　建立优化的华细辛 A sarum siebol dii A FL P 反应体系 ,为华细辛遗传多样性的研究提供技术支持。
方法 　以华细辛叶片为材料 ,对基因组 DNA 提取、酶切连接、PCR 扩增等操作过程中各关键因素进行分析 ,筛选
最适条件 ,建立完善的 A FL P 反应体系。结果 　建立了优化的华细辛 AFL P 分析体系 :在基因组 DNA 提取时 ,提
取液中添加巯基乙醇、样品温浴时间为 30 min ; T ru1 Ⅰ和 Pst Ⅰ的酶切时间分别为 3 h ;在扩增反应中 ,Mg2 + 终浓
度为 115 mmol/ L 、Taq DNA 聚合酶用量为 012μL 。结论 　本反应体系可获得良好的 AFL P 分析结果 ,可用于华
细辛遗传多样性研究。
关键词 :华细辛 ; A FL P 反应体系 ; 分子标记
中图分类号 :R282121 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0420625205
Establishment and optimization of AFLP reaction system in Asa rum siebol dii
GEN G Pan2pan1 ,2 , YAN G Dong2zhi2 , WAN G Yong2bo1 , L IU Zhong2
(11 School of Pharmacy , Shanghai J iao Tong University , Shanghai 200240 , China ; 2. Department of Bioengineering ,
Zhengzhou University , Zhengzhou 450001 , China)
Abstract : Objective 　To establish and optimize A FL P reaction system used in providing necessary
technique basis for genetic diversity analysis in A sarum siebol dii . Methods 　Leaves of A . siebol di i were
used as experimental materials to analyze various essential element s of t he whole p rocess , such as quality
of ext racted DNA , time of rest riction digest and ligation , concent ration of Mg2 + , p rimers and T aq DNA
polymerase during PCR amplification etc. , so t hat the most optimal A FL P reaction system could be built
up . Results 　The optimal A FL P reaction system of A . siebol dii has been const ructed : in t he genomic
DNA ext raction , mercaptoet hanol being utilized and samples being incubated about 30 min at 65 ℃; t he
genomic DNA being digested by T rul Ⅰand Pst Ⅰfor 3 h respectively ; in PCR amplification , t he final
concent ration of Mg2 + being 1. 5 mmol/ L and t he volume of T aq DNA polymerase being 0. 2μL . Conclu2
sion 　The present reaction system for A . siebol di i is able to gain the favorable result s of A FL P analysis
and can be used in t he genetic diversity research of t he species.
Key words : A sarum siebol di i Miq. ; A FL P reaction system ; molecular marker
　　细辛始载于《神农本草经》,正品细辛的基源有
3 个 ,分别为华细辛 A sarum siebol di i Miq. 、汉城细
辛 A . siebol dii Miq. f . seoulense ( Nakai) C. Y.
Cheng et C. S. Yang 和北细辛 A . heterot ropoi des
Fr. Schmidet var . m an dshuricum ( Maxim.
Kitag. ) ,其中 ,华细辛以秦岭2大巴山为中心 ,广泛
分布于黄河和长江两水系的中下游流域 ,包括甘肃
南部、陕西南部、四川北部、重庆北部、河南西部、湖
北西部、湖南西北部、江西西北部、安徽西部和南部、
浙江西北部等地区。历代本草均记载产于现今陕西
华山及其周围地区的华细辛质优效佳 ,是细辛的传
统道地药材。自 20 世纪 90 年代以来 ,由于临床和
医药工业需求量增大 ,细辛药材的市场价格逐年上
扬 ,从而引起过度采挖 ,导致华细辛野生资源急剧减
少 ,现已被列为国家三级保护植物[1 ] 。然而 ,迄今为
止 ,有关华细辛遗传背景的研究十分缺乏 ,仅有零星
报道[2 ,3 ] 。因此 ,非常有必要对华细辛的遗传分化
和种群遗传结构进行深入系统的研究 ,为华细辛资
源的合理开发、可持续利用和保护策略的制定提供
理论依据。
　　扩增片段长度多态性 ( amplified f ragment
lengt h polymorp his , A FL P) 技术由 Vos 等[4 ] 发
·526·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
3 收稿日期 :2008206223　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30772725)
作者简介 :耿盼盼 (1983 —) ,女 ,河南省郑州市人 ,郑州大学生物工程系硕士 ,主要从事植物资源学研究。3 通讯作者　杨冬之　E2mail : ydongzhi @sohu. com
刘　忠　Tel : (021) 34206098 　E2mail : liuzhong @sjtu. edu. cn
明 ,是建立在对 DNA 限制性酶切片段进行选择性
扩增基础上的分子标记技术。在设计原理上 ,该技
术结合了 RFL P 和 RA PD 各自的优点 ,既有 RFL P
的准确性 ,又有 RA PD 的易操作性。同时 ,一次
A FL P 反应的产物在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中可
检测到的条带数目在 50～150 ,其检测效率之高是
其他分子标记方法无可比拟的 ,因此 ,该技术一经发
明 ,便迅速成为了遗传多样性、种质鉴定、目的基因
定位等研究中广泛运用的分析技术。
本研究在 Vos 等 A FL P 分析技术的基础上 ,通
过优化反应条件 ,建立了适合华细辛 A FL P 分析的
反应体系 ,并在此基础上 ,开展了对华细辛遗传多样
性的研究 ,分析了不同产地华细辛的遗传差异 ,为华
细辛药材品质评价、质量控制、优良遗传资源的利用
积累了基本资料。
1 　材料与方法
111 　实验材料 :实验材料为硅胶干燥保存的华细辛
花期叶片 ,样品来源见表 1。每个种群的采样量为
20～30 个个体。
表 1 　华细辛实验材料
Table 1 　Materials used in study
采集地点 采集号 采集地点 采集号
江西庐山 20042021 安徽黄山 3 20042039
浙江天目山 1 20042028 重庆城口 1 20042049
浙江天目山 2 20042029 重庆城口 2 20042053
安徽黄山 1 20042037 陕西华山 20042056
安徽黄山 2 20042038
　　主要试剂 :限制性内切酶 T rul Ⅰ和 Pst Ⅰ,
T aq DNA 聚合酶 (MBI Fermentas 公司) , T4 连接
酶 ( Takara 公司) ,引物由上海英骏公司合成 ,接头
由 Takara 公司合成。
主要仪器设备 : Eppendorf Cent rif uge 5415D 离
心机 , Eppendorf Mastercycler PCR 仪 , Eppendorf
Bio Photometer 紫外/ 可见分光光度计 ,L KB 垂直电
泳槽 ,北京六一 D YY—10C 高压电泳仪 ,天能科技
紫外成像系统。
112 　基因组 DNA 的提取 :每个种群抽取 20 个个
体 ,每个个体称取 20 mg 干燥叶片混合成基因池 ,
以 Bekesiova 等的 CTAB 法[ 5 ] 为基础 ,进行基因组
DNA 的提取。根据实验材料 , 提取过程中 , 对
Bekesiova 等的提取方法进行适当调整 :添加了抗氧
化剂巯基乙醇 ;将 65 ℃水浴时间控制在半小时以
内。具体操作步骤如下 :在 2 mL 离心管中依次加
入 300 μL 提取缓冲液 Ⅰ[ 0135 mol/ L Sorbitol ,
0. 1 mol/ L Tris HCl (p H 7. 5) , 0. 5 mmol/ L ED2
TA ]、300μL 提取缓冲液 Ⅱ[ 012 mol/ L Tris HCl
(p H 7. 5) , 0. 5 mmol/ L ED TA (p H 7. 5) , 2 mol/
L NaCl , 2 % CTAB ] 和 30μL 巯基乙醇 ,置于 65
℃水浴中预热。从混合好的基因池中取出 30 mg
放入已灭菌的研钵中 ,加入液氮后将其研磨成粉末
并迅速转入已预热的 2 mL 离心管中。加 120μL
十二烷基肌氨酸钠 ,将离心管用力振荡数次。65 ℃
温浴 30 min 后室温静置 10 min。加 700μL 苯酚2
氯仿2异戊醇 (25 ∶24 ∶1) ,混匀 ,12 000 r/ min 离心
10 min ,取上清。加入 700μL 氯仿2异戊醇 (24 ∶
1) ,混匀 ,12 000 r/ min 离心 10 min ,取上清。加入
800μL - 20 ℃预冷的异丙醇 ,经缓颠倒混匀 ,4 ℃
过夜后 12 000 r/ min 离心 10 min , 弃上清。用
70 % 乙醇洗沉淀 2 次 ,在超净工作台上室温晾干 ,
加 100μL 灭菌双蒸水溶解 DNA。提取所得 DNA
的浓度与质量用紫外分光光度法和 018 % 琼脂糖
凝胶电泳进行检测。
113 　A FL P 反应体系的建立和优化 :华细辛 A FL P
反应体系的建立参照 Vos 等[4 ] 的方法 ,并对各关键
因素进行优化处理。
11311 　酶切与连接 :本研究选用了具高频切点的
T rul Ⅰ( Mse Ⅰ的同裂酶) 和低频切点的 Pst Ⅰ作为
限制性内切酶组合对样品的基因组 DNA 进行酶切
消化。参照 Fermentas 公司内切酶产品说明 , TrulⅠ
在 65 ℃、Pst Ⅰ在 37 ℃分步酶切。为了确定酶切最
适时间 ,将酶切时间均设定为 2、3、4 h 3 个梯度 (表
2) 。基因组 DNA 酶切消化后 ,于 80 ℃灭活酶活性
20 min 以终止反应。双酶切结果用 018 % 琼脂糖凝
胶电泳检测。
酶切产物中加入接头和 T4 连接酶 ,连接反应在
16 ℃过夜的条件下进行 (表 2) 。
11312 　预扩增 :先将连接产物于 70 ℃灭活 10
min ,再用带一个选择性碱基的预扩增引物以连接
产物为模板进行 PCR 扩增。扩增程序为 :94 ℃、30
s ,56 ℃、30 s ,72 ℃、1 min ,30 个循环。PCR 反应
受 Mg2 + 、dN TPs、引物、模板等的浓度以及循环数
等多种因素影响 ,因此针对不同的材料应予以调整 ,
以建立最优的反应条件。本实验中 ,考察了 Mg2 +
终浓度和引物用量对 PCR 反应的影响。Mg2 + 终浓
度设定为 110、115、210 mmol/ L 3 个梯度 ,引物用
量设定为 110μL 和 115μL 两个梯度。各反应体
系标记为 a～f (表 3) 。预扩增产物用 1 % 琼脂糖
凝胶电泳检测 ,其余的稀释 40 倍后于 4 ℃保存 ,作
为下一步选择性扩增的模板。
·626· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 4 期 2009 年 4 月
表 2 　酶切和连接反应体系
Table 2 　Reaction systems of restriction digest and ligation
T ru1 Ⅰ酶切
成分 体积/μL
Pst Ⅰ酶切
成分 体积/μL
连接
成分 体积/μL
10 ×buffer 110 10 ×buffer 　　　21 0 10 ×buffer 　　215
T ru1 Ⅰ(10 U/μL) 015 Pst Ⅰ(10 U/μL) 01 5 T4连接酶 110
DNA 500 ng x DNA 51 0 T ru1 ⅠAdaptor (50 pmol) 015
dd H2O 815 - x dd H2O 121 5 Pst ⅠAdaptor (5 pmol) 015
酶切产物 1215
dd H2O 810
总体积为 10μL 总体积为 20μL 总体积为 25μL
　　x 表示含有 500 ng DNA 的样本体积是一个不确定的数 ,而用于补足总体积的 dd H2O 的用量需据此进行相应调整
　　Because volume of each sample containing 500 ng DNA is various (expressed by xμL) , volume of dd H2O which is used as complement
for reaction system should be adjusted accordingly
表 3 　预扩增反应体系
Table 3 　Reaction systems of pre2amplif ication
体系 a/μL 体系 b/μL 体系 c/μL 体系 d/μL 体系 e/μL 体系 f/μL
连接产物 2 2 2 2 2 2
T ru1 Ⅰ预扩增引物 (50 ng/μL) 110 11 0 110 11 5 115 115
Pst Ⅰ预扩增引物 (50 ng/μL) 110 11 0 110 11 5 115 115
dN TPs (2. 0 mmol/ L) 215 21 5 215 21 5 215 215
Mg2 + (25 mmol/ L) 110 11 5 210 11 0 115 210
10 ×buffer 215 21 5 215 21 5 215 215
Taq 聚合酶 (5 U/μL) 012 01 2 012 01 2 012 012
　　补足 dd H2O 到总体积为 25μL
　　25μL showld be used as complement for total volumn of dd H2O
11313 　选择性扩增 :在进行选择性扩增时 ,考察了
Mg2 + 终浓度和 T aq DNA 聚合酶用量对扩增反应
的影响。将 Mg2 + 终浓度设为 115 和 210 mmol/ L
两个梯度、T aq DNA 聚合酶用量设为 011 和 012
μL 两个梯度进行反应 (表 4) 。PCR 反应的循环参
数为 :第 1 环节 ,先以 94 ℃、30 s ,65 ℃、30 s ,72 ℃、
1 min 进行一个循环 ,此后 13 个循环 ,每个循环的
复性温度下降 017 ℃;第 2 环节 ,94 ℃、30 s ,56 ℃、
30 s ,72 ℃、1 min ,运行 23 个循环。反应结束后 ,扩
增产物用 115 % 琼脂糖凝胶进行预检测 ,余皆置于
4 ℃保存。
表 4 　选择性扩增反应体系
Table 4 　Reaction systems of selective amplif ication
体系 a/μL 体系 b/μL 体系 c/μL 体系 d/μL
预扩增产物 2 2 2 2
Tru1 Ⅰ选择性预扩增引物 (50 ng/μL) 110 110 110 110
PstⅠ选择性预扩增引物 (50 ng/μL) 110 110 110 110
dN TPs (2. 0 mmol/ L) 210 210 210 210
Mg2 + (25 mmol/ L) 115 210 115 210
10 ×buffer 210 210 210 210
Taq聚合酶 (5 U/μL) 012 012 011 011
　　补足 dd H2O 到总体积为 20μL
　　20μL should be used as complement for total volumn of dd H2O
114 　变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 :依次量取 6 % 聚
丙烯酰胺 60 mL 、10 % 过硫酸胺 300μL 、TEM ED
30μL ,于烧杯中快速混匀 (注意不产生气泡) 后 ,
注入已安置妥当的玻璃板之间 ,插好梳子 ,胶充分凝
结后待用。40 W 恒功率预电泳 015 h。在选择性
扩增产物中加入等体积 loading buffer (98 % 甲酰
胺 ,10 mmol/ L ED TA , 0. 125 % 溴酚蓝 , 01125 %
二甲苯氰) ,95 ℃变性 5 min ,取出后立即置于冰浴
中以防复性。60 W 恒功率电泳约 215 h。
115 　银染检测 :电泳后的银染检测程序参照 Bas2
sam 等[ 6 ]方法。将有凝胶的短玻璃板放在 2 L 10 %
冰醋酸中 ,轻摇约 30 min ,至二甲苯氰颜色褪去。
用超纯水冲洗 3 次 ,每次 2 min。放入 2 L 银染液
中轻摇 ,注意避光 ,以免硝酸银见光分解。染色
30～40 min。用超纯水迅速冲洗玻璃板 ,然后放入
2 L 预冷的显色液中 ,轻摇大约 5 min ,条带即显现。
在背景尚未变深时用 10 % 冰醋酸终止显色 ,漂洗 ,
室温干燥。用数码相机拍摄银染结果 ,统计条带并
分析数据。
2 　结果与分析
211 　基因组 DNA 的提取 :应用 Bekesiova CTAB
法提取的华细辛基因组 DNA ,质量基本符合 A FL P
分析的要求 ,然而得率尚不十分理想 (图 1) 。分析
其原因 ,可能与华细辛植株中酚类物质较多有关 ,因
为酚类氧化后与DNA 共价结合并引起DNA 降
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图 1 　Bekesiova CTAB 法提取的华细辛基因组 DNA
Fig. 1 　Genomic DNA of A. sieboldii extracted
with Bekesiova CTAB method
解。此外 ,还有研究者认为 ,酚类以及多糖、色素等
会影响 DNA 聚合酶的活性 ,干扰引物与模板的结
合 ,导致扩增失败。所以 ,针对材料本身特点 ,实验
中对 Bekesiova CTAB 法作了适当的改进 ,抽提时
使用了巯基乙醇 ,其 —SH 可打断多酚氧化酶的二
硫键而使之失活 ,从而有效地防止酚类被氧化[7 ] 。
对 65 ℃温浴时间也有所控制。经实验 ,65 ℃温浴
时间在 30 min 左右比较合适 ,时间过短不能充分释
放 DNA ,时间过长则会降解 DNA ,减少得率。
用优化后的 Bekesiova CTAB 法提取的基因组
DNA 在 018 % 琼脂糖凝胶上电泳能呈现清晰、无
弥散的整齐条带。同时 ,经紫外分光光度计检测 ,吸
光度比值在 117～119 ,表明基因组 DNA 完整性较
好 ,纯度高 ,适于 A FL P 分析 (图 2) 。
图 2 　优化的 Bekesiova CTAB 法提取的华细辛基因组 DNA
Fig. 2 　Genomic DNA of A. sieboldii extracted
with modif ied Bekesiova CTAB method
212 　A FL P 反应体系的建立与优化
21211 　酶切与连接 :基因组 DNA 是否酶切消化完
全是 A FL P 分析成功与否的关键之一。酶切时间
不够 ,导致酶切不完全 ,扩增产物将不能反映真实酶
切位点的分布情况 ,实验结果不稳定。酶切时间过
长 ,会产生星活性 ,降低 PCR 反应的特异性。根据
实验结果 (图 3 ,其中 A、B、C 分别表示双酶切 2、3、
4 h) ,酶切 2 h ,基因组 DNA 没有被消化完全 ,表明
酶切时间不够 ;酶切 4 h ,几乎看不到大片段 ,说明
酶切的时间过长 ;酶切 3 h ,酶切产物为连续的大小
不同的 DNA 片段 ,在凝胶上呈涂抹状 ,表现为合适
的酶切时间。
21212 　预扩增 :预扩增起着承上启下的作用 ,既反
映酶切和连接效果 ,又直接影响下一步选择性扩增
的成功。理想的预扩增产物相对分子质量应在
50～1 000 bp ,扩增信号较强 ,各样品间相对一致。
结果显示 ,Mg2 + 终浓度为 115 mmol/ L ,引物用量为
115μL 时预扩增产物的分布范围及产量都比较合
适 (图 4) 。
21213 　选择性扩增 : 实验结果显示 (图 5 ) , 当
Mg2 + 终浓度为 115 mmol/ L 、T aq DNA 聚合酶用
量为 012μL 时选择性扩增的效果最好 , PCR 产物
的分布范围以及特异性条带都比较合适。
213 　变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测 :电泳时
温度不可过高 ,可通过使用循环水装置 ,将玻璃板温
度控制在 40 ℃左右。温度过高会使 DNA 带纹发
虚、发散。银染液要充分摇匀后再将玻璃板放入 ,否
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则银颗粒会潜入胶中 ,使背景杂乱。实验时 ,如果环
境温度低 ,要适量延长染色时间 ,使着色充分 ,条带
清晰。显影时要把握时间 ,既要使条带充分显现 ,又
不能显色时间过长导致背景加深 ,影响观察。图 6
是引物对 PM65 的扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电
泳分离后的银染检测结果。
图 6 　引物对 PM65 的扩增产物银染检测结果
Fig. 6 　Silver staining prof iling of products amplif ied
with primers combination of PM65
3 　讨论
　　目前对华细辛的研究多集中在本草学、驯化栽
培、成分分析、药理毒理、临床应用等方面 ,而遗传背
景的研究比较少。进行植物遗传多样性研究的分子
标记方法很多 , 其中 A FL P 技术尤为突出。但
A FL P 操作过程繁琐 ,每一环节都与结果密切相关 ,
而不同的研究材料有着不同的特性 ,所以在进行华
细辛遗传多样性的 A FL P 标记分析时 ,建立最佳的
反应体系是必不可少的基础性工作。
获得高质量的基因组 DNA 是整个分析工作得
以顺利进行的基本前提 ,影响植物总 DNA 提取质
量的干扰因素常常是植物体内高含量的多糖类、蛋
白质和酚类等物质。因此 ,适宜的提取方法就是能
有效地去除这些干扰因素 ,从而获得高纯度的
DNA。有关植物基因组 DNA 的提取在一些重要
的经济作物中已有许多成熟的方案 ,如 An Michiels
等[8 ]用 CTAB 法从多乳汁的植物中获得了高质量
的基因组 DNA ,王文江等[9 ] 采用改进的 CTAB 法
从柿树叶片中提取得到了纯度较高的 DNA ,可用
于 A FL P 分析。茅膏菜是一类可捕食昆虫的植物 ,
其体内富含黏液 ,多糖类和蛋白质类的量较高。根据
茅膏菜的特性 ,Bekesiova 建立了适宜的提取方法 ,获
得了高质量的总 DNA[5 ] 。因此 ,Bekesiova 的 DNA
提取方法在去除多糖类和蛋白质类方面具有比较强
的能力。本研究在 Bekesiova 方法的基础上 ,进一步
考虑到华细辛酚类成分的量较高的特点 ,对其方法进
行了适当的修正 ,最终获得了满意的结果。
在 PCR 扩增反应中 , Mg2 + 终浓度不仅影响
T aq DNA 聚合酶的活性 ,Mg2 + 还能与 dN TP、模板
及引物结合 ,从而影响模板的解链温度、引物与模板
的结合效率以及产物的特异性[10 ] 。所以本研究重
点对 Mg2 + 终浓度、引物及 T aq DNA 聚合酶用量进
行了梯度对照 ,筛选到了最佳用量配比。dN TP 是
A FL P 反应的原料 ,dN TP 浓度过高 ,导致扩增反应
中模板与引物的错配 ,使扩增出现非特异性 ,浓度过
低又会影响扩增效率。因此 ,对于 dN TP 的最适用
量也是需要经过对比分析才能确定的。
扩增产物必须与完善的凝胶检测手段结合 ,才
会产生理想的 A FL P 指纹。首先 ,有必要用浓度较
大的 (通常用 115 %) 琼脂糖凝胶电泳对选择性扩
增产物进行预检测 ,观察扩增产物的多态性高低 ,验
证扩增反应的成败 ,为下一步聚丙烯酰胺凝胶检测
做准备。目前有多种方法检测 A FL P 产物的多态
性 ,其中 ,A FL P 同位素或荧光标记试剂盒比较方便
简单 ,但是试剂盒价格昂贵 ,并不适合于大批量样品
的分析 ,所以在保证试验结果理想的前提下选用变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染检测的方法更具实
用性 ,是一般实验室可以考虑的方案。
通过对 A FL P 分析过程各环节反应体系的优
化 ,确定了适宜华细辛基因组 DNA 提取、酶切连
接、PCR 扩增以及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳2银染
检测分析的最佳反应条件 ,获得了理想的指纹图谱 ,
为研究华细辛遗传多样性及其种质资源保护等提供
了良好的技术保障。
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