全 文 ：表 1　L 9 (34)正交试验结果
Table 1　Results of L 9 (34) orthogonal test
试验号 　多　糖 A 反应温度ö℃ B 氯磺酸与
吡啶的体积比
C 反应时间öh D (误差)　 D Sö% 糖质量分数ö%
　　1 sEPS1 　60 　　1∶ 6 　1 　1 01097 311843
　　2 sEPS2 60 1∶ 8 2 2 01484 621474
　　3 sEPS3 60 1∶10 3 3 11120 501949
　　4 sEPS4 80 1∶ 6 3 2 01772 491938
　　5 sEPS5 80 1∶ 8 1 3 01696 721380
　　6 sEPS6 80 1∶10 2 1 01834 281049
　　7 sEPS7 95 1∶ 6 2 3 01351 211027
　　8 sEPS8 95 1∶ 8 3 1 01074 271699
　　9 sEPS9 95 1∶10 1 2 01089 361190
　　D S K 1 01567 01407 01294 01335
K 2 01767 01418 01556 01448
K 3 01171 01681 01655 01722
R 01596 01274 01361 01387
糖质量分数 K 1 481222 341269 461804 291197
K 2 501122 541184 371183 491534
K 3 281305 381396 421729 471967
R 211817 191915 91621 201337
升高到95 ℃时, 硫酸基的取代度和糖质量分数明显
降低, 可能是淫羊藿多糖的结构被破坏, 因此反应温
度宜控制在80 ℃。也有认为, 提高氯磺酸的比例有
利于酯化反应, 但实际操作中氯磺酸比例高, 会出现
板结, 搅拌困难, 以致反应不均[6～ 8 ]。
参考文献:
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超滤和纳滤分离技术提取纯化地黄低聚糖的研究
董　艳1, 高瑞昶1Ξ , 潘　勤2, 阎晓楠2
(11 天津大学化工学院, 天津　300072; 21 天津中新药业集团股份有限公司技术中心, 天津　300457)
摘　要: 目的　通过不同截留相对分子质量的超滤膜对地黄多糖分离纯化, 再利用纳滤膜对超滤液进行浓缩纯化。
方法　采用不同截留相对分子质量超滤再纳滤的工艺流程。结果　两次超滤得到低聚糖, 最佳操作条件为: 料液质
量浓度为 13～ 132 m gömL , 操作压力为 0125～ 01275 M Pa, 温度 20～ 40 ℃。然后采用纳滤膜对超滤液进行浓缩纯
化, 适宜工艺条件为: 料温为20～ 40 ℃, 操作压力0159～ 0179M Pa, 浓缩倍数可达3 倍。应用超滤2纳滤技术, 低聚糖
得率为46163% , 质量分数达到9313% , 凝胶过滤法验证低聚糖制品的相对分子质量低于6 000。结论　该工艺能有
效分离纯化地黄低聚糖, 简单可行, 操作简便。
关键词: 地黄低聚糖; 超滤; 纳滤; 分离; 纯化
中图分类号: R 28611　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253- 2670 (2008) 03- 0359- 05
·953·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
Ξ 收稿日期: 2007209229
作者简介: 董　艳 (1981—) , 女, 河北沧州人, 硕士, 研究方向为膜分离技术与化学工程。E2m ail: yanyan2422@ 1261com3 通讯作者　高瑞昶　E2m ail: gao ru ichang@yahoo. com. cn
Ultraf iltra tion and nanof iltra tion m em brane separa tion technology in extracting
and pur ify ing ol igosacchar ides of R ehm ann ia g lu tinosa
DON G Yan1, GAO R u i2chang1, PAN Q in2, YAN X iao2nan2
(11 Schoo l of Chem ical Engineering and T echno logy, T ian jin U niversity, T ian jin 300072, Ch ina; 21 T echn ical Cen ter
of T ian jin Zhongxin Pharm aceu tical Group Co rpo ration L im ited, T ian jin 300457, Ch ina)
Abstract: Objective　O ligo saccharides of R ehm ann ia g lu tinosa w ere separa ted and pu rif ied by differ2
en t mo lecu lar w eigh t cu t2off u lt raf ilt ra t ion (U F) m em b ranes, and then u lt raf ilt ra te w as concen tra ted and
pu rif ied by nanofilt ra t ion (N F) m em b rane1M ethods　D ifferen t mo lecu lar w eigh t cu t2off U F un it f irst and
then N F un it w ere u sed in p rocess1 Results　O ligo saccharides w ere separa ted by tw ice U F, the op t im um
separa t ion condit ion s: the concen tra t ion of feed so lu t ion w as 13—132 m gömL , the opera t ion p ressu re w as
0125—01275 M Pa, and the temperatu re w as 20—40 ℃1 T hen u lt raf ilt ra te w as concen tra ted and pu rif ied
by N F m em b rane, the op t im um separa t ion condit ion s: the opera t ion p ressu re w as 0159—0179 M Pa, the
temperatu re w as 20—40 ℃, and the concen tra t ion m u lt ip lego t to th ree1 U nder th is condit ion, the to ta l ex2
t ract ion ra te of o ligo saccharide p roducts w as 46163% and the pu rity w as above 9313% , the mo lecu lar
w eigh ts of o ligo saccharide p roducts determ ined by gel f ilt ra t ion w ere less than 6 0001 Conclusion　T he
techno logy is no t on ly simp le and feasib le bu t a lso easy to separa te and pu rify the o ligo saccharides of R 1
g lu tinosa effect ively1
Key words: the o ligo saccharides of R ehm ann ia g lu tinosa L ibo sch; u lt raf ilt ra t ion (U F) ; nanofilt ra t ion
(N F) ; separa t ion; pu rif ica t ion
　　地黄为玄参科植物地黄R ehm ann ia g lu tinosa
L ibo sch 的块根, 为补益中药中常用药物。始载于
《神农本草经》, 列于上品。具有滋明清热, 补血止血
等功效[1 ]。地黄多糖是地黄的重要活性成分, 其相对
分子质量仅为1 000～ 2 000 的多糖对小鼠L ew is 肿
瘤具有明显的生长抑制作用[2 ]。另外, 低聚糖, 相对
分子质量为666 的四聚糖对实验性糖尿病与高血糖
大鼠糖代谢有调节作用[3 ]。地黄粗多糖浸提液中含
有蛋白质、色素、无机盐等杂质, 影响多糖的生物活
性及外观品质。目前适合多糖工业化生产的方法较
少, 传统提取纯化多糖的方法为水提醇沉工艺, 但该
法有机溶剂用量大, 生产周期长, 分离成本高。膜法
作为一种新型的分离技术, 利用不同的膜孔径, 从而
截留不同相对分子质量的组分实现对物质分子的分
级, 目前用于多糖和酶等活性物质的分离与纯化上
具有收率高且极少破坏的优点, 是当前天然多糖分
离研究中十分活跃的领域[4 ]。本实验采用超滤结合
纳滤, 对地黄低聚糖进行分离纯化研究, 确定实验操
作条件, 检验纯化结果, 以考察膜分离法用于地黄多
糖提取液分离纯化工艺的可行性, 为地黄多糖在医
药领域和保健品行业的工业化开发提供了参考。
1　材料与仪器
　　地黄饮片 (天津市中药饮片厂提供, 经中新药业
技术中心王德军高级工程师鉴定为怀庆地黄) ; 无水
葡萄糖 (分析纯, 上海天莲精细化工有限公司) ; 牛血
清白蛋白 (天津市川页生化制品有限公司) ; 考马斯
亮蓝G2250 (联星生物) ; 超滤平板膜 (截留相对分子
质量分别为 115×105 和 6 000 的聚砜膜, 厦门三达
膜科技有限公司) ; 纳滤卷式膜 (截留相对分子质量
为 200 的复合膜, 厦门三达膜科技有限公司) ;
Sephadex G225, Pharm acia 公司; 右旋糖苷标准品
及蓝色葡聚糖2000 (生化试剂, 其平均相对分子质量
分别为 180、342、1 000、5 000、10 000、2 000 000,
Sigm a 公司生产) ; 其他均为分析纯级。
　　PE L anm bda 25 型紫外分光光度计 (Perk in
E lm er) ; 锯齿平板、管卷并用小试设备(厦门三达膜科技
有限公司) ; A 200S 电子天平(Sarto riu s analyt ic)。
2　方法与结果
211　地黄低聚糖纯度的测定方法
21111　低聚糖质量浓度的测定采用苯酚2硫酸法[5 ]:
精密称取 105 ℃干燥至恒重的葡萄糖 2013 m g, 置
100 mL 量瓶中, 加水适量使溶解并稀释至刻度, 摇
匀。吸取110、210、310、410、510、610、710 mL 于25
mL 量瓶中, 用水分别稀释至刻度。然后再精密吸
取各 210 mL , 分别置于 10 mL 具塞试管中, 各加苯
酚试液 110 mL , 振摇, 迅速滴加浓硫酸 510 mL , 充
分振摇, 于 40 ℃水浴中保温 30 ℃, 取出, 迅速插入
至冰水混合物中, 30 m in 后在 490 nm 处测定吸光
度值。另取2 mL 蒸馏水, 同法操作, 作为空白对照。
绘制标准曲线, 得回归方程: Y = 01015 X + 01006
·063· 中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
4, r= 01999 0。
　　蛋白质量浓度的测定采用考马斯亮蓝G2250
法[6 ] , ; 色值的测定是在单色光430 nm 波长下, 用10
mm 比色皿测定溶液的吸光度, 以蒸馏水作空白[7 ];
盐浓度的测定用硝酸银滴定法[8 ]; 灰分的测定用《中
国药典》法[9 ]。
21112　低聚糖制品相对分子质量的测定: 采用凝胶
滤过法。取实验所得的低聚糖制品 5 m g, 溶于 011
mo lömL N aC l 溶液2 mL 中, 加到预先用011 mo lömL
N aC l 溶液平衡好的 SephadexG225 柱 (40 cm ×110
cm )上, 再用011 mo lömL N aC l 溶液以015 mL öm in
洗脱, 收集洗脱液, 苯酚2硫酸法检测多糖分布, 与葡
聚糖标准品的标准曲线比对, 计算主要洗脱峰处相
对分子质量。
21113　膜通量[10 ]、脱色率、脱盐率、灰分去除率、多
糖制品质量分数的计算:
膜通量= 透过液体积ö(膜的有效面积×操作时间)
蛋白去除率= (超滤前蛋白的量- 超滤后蛋白的量) ö超
滤前蛋白的量×100%
脱色率= (脱色前吸光度值- 脱色后吸光度值) ö脱色前
吸光度值×100%
脱盐率= (1- 浓缩液含盐量ö原料液含盐量) ×100% =
透过液含盐量ö原料液含盐量×100%
灰分去除率= (1- 炽灼后样品灰分质量ö炽灼前样品灰
分质量)×100%
多糖制品质量分数= 浓缩液体积×浓缩液中多糖的质
量浓度ö多糖制品的质量×100%
212　制备工艺流程: 取地黄饮片300 g, 以10 倍和8
倍量水回流提取 2 次, 滤过, 合并得含生药量为 93
m gömL 的提取液。提取液先经截留相对分子质量
为150 000 的聚砜超滤膜, 其透过液再经截留相对分
子质量为6 000 的聚砜超滤膜。以截留相对分子质量
为200 的复合纳滤膜浓缩除盐。纳滤浓缩液真空冷
冻干燥。超滤及纳滤过程操作条件的优化是制备中
的关键工艺。
213　超滤工艺影响因素的考察: 在超滤分离过程
中, 料液中溶质由于受到膜的截留而在膜面上积累,
使得膜表面溶质浓度逐步高于料液主体浓度, 经过
一定时间后膜表面形成浓差极化和凝胶层, 使得膜
的渗透通量减小, 滤过时间增长, 造成膜的污染。因
此, 为了满足实际生产的需要, 又不会引起膜的不可
逆污染, 就要对原料液的质量浓度、操作压力、温度
进行考察[10 ]。
21311　原料液质量浓度的影响: 分别取含生药量
13、52、132 m gömL 料液, 在 01275 M Pa 压力和
26 ℃条件下进行超滤, 1 h 内每隔10 m in 测定膜通
量, 结果见图1。可见膜通量从运行开始迅速衰减, 提
示料液在膜表面迅速形成浓差极化; 30 m in 后膜通
量趋于稳定。料液质量浓度不可过大, 过大膜通量越
低; 但不可过低, 过低会增加超滤时间[11 ]。因此, 从
节约操作时间和延长膜寿命考虑, 地黄药液质量浓
度控制在13～ 132 m gömL。
töm in
图 1　料液浓度对超滤膜的渗透通量的影响
F ig11　Effect of solution concen tration
on osmotic f lux of UF membrane
21312　膜操作压力对膜通量的影响: 采用含生药52
m gömL 料液, 温度为26 ℃, 分别考察01225、0125 、
01275、013 M Pa 不同操作压力对膜通量的影响, 结
果见图2。可见, 当超滤压力为01225M Pa 时膜通量
较小, 且随时间而衰减, 10 m in 后就达到稳定, 膜通
量衰减变化不明显; 当压力为013M Pa 时, 膜初始通
量是52 L öm 2·h, 约是01225 M Pa 初始通量的2 倍,
但随时间降低幅度大, 60 m in 后趋于稳定; 当压力
为 01275、0125 M Pa 时, 膜通量也较大, 且随时间变
化幅度降低较小, 30 m in 后稳定。结果表明, 压力越
高, 膜通量衰减越大, 这是由于过高的压力会造成动
力消耗增加; 而压力越低, 虽然膜通量衰减较小, 但
较低的膜通量不能满足生产需要。因此, 选取的压力
范围为0125～ 01275 M Pa 为宜。
töm in
图 2　压力对超滤膜的渗透通量的影响
F ig12　Effect of pressure on osmotic
f lux of UF membrane
21313　温度的影响: 应综合考虑膜的性能、保养、预期
截留率等多种因素。由于聚砜膜的正常适用范围为10～
50 ℃, 因此考察了料液在质量浓度为01052 gömL , 膜
·163·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
操作压力为0125 M Pa, 温度分别为16、26、36、46 ℃
对膜通量的影响, 结果见图3。可见随着温度的升高,
膜通量增加, 而且温度升高 30～ 45 ℃时, 渗透通量
将加倍。这是由于在一定范围内, 温度升高, 料液黏
度下降, 扩散系数、传质系数及多糖溶解度增大, 与
水的亲和力也增大, 相应会减少浓差极化。但温度提
高导致了截留率的降低, 这是由于温度升高致使截
留膜性能和溶液理化性质的改变。综合考虑温度对
溶液性质和膜性能的影响及预期截留率、工业生产
成本等因素, 药液温度应控制在 20～ 40 ℃, 一般取
常温下操作。
温度ö℃
图 3　温度对超滤渗透通量的影响
F ig13　Effect of temperature on osmotic
f lux of UF membrane
214　纳滤除盐浓缩工艺的考察: 超滤后的地黄低
聚糖提取液含低聚糖量低和含盐分高, 因此需进行
除盐和低聚糖富集。传统的热蒸发浓缩手段不仅无
脱盐能力, 而且易破坏成分的生物活性。纳滤是介于
反渗透和超滤之间的一种新型膜分离手段, 操作温
度低, 运行成本低。本实验采用不加水循环浓缩除盐
的方式, 考察了操作压力、温度、浓缩倍数对纳滤膜
通量的影响, 并考察该纳滤膜对低聚糖的保留效果。
21411　操作压力对纳滤的影响: 取 20 ℃的超滤透
过液, 分别考察0149、0159、0169、0179、0189 M Pa 不
同操作压力对膜通量的影响, 结果见图4。可以看出,
操作压强从 0149 M Pa 增加到 0179 M Pa, 膜的通量
也随之增加, 但是逐渐增加的幅度变缓, 最后操作压
强在增加, 膜通量几乎不变。当操作压强增大到0179
M Pa, 单纯提高压强已没有意义。因此纳滤适宜的压
力范围为0159～ 0179 M Pa。
P öM Pa
图 4　压力对纳滤渗透通量的影响
F ig14　Effect of pressure on osmotic
f lux of NF membrane
21412　操作温度对纳滤的影响: 在 016 M Pa 下, 对
温度分别为 20、30、40 ℃的超滤液进行纳滤, 测定纳
滤的渗透通量, 其渗透通量与温度的关系见图5。可以
看出, 提高操作温度可使渗透通量显著增大。因此, 在
不影响料液物化性质的前提下, 在膜耐受温度范围内,
应尽量提高料液的温度。由于纳滤膜正常操作温度是
10～ 40 ℃, 因此纳滤操作温度范围取20～ 40 ℃。
温度ö℃
图 5　操作温度与渗透通量的关系
F ig15　Relation sh ip between processing
temperature and osmotic f lux
21413　浓缩倍数与膜性能的关系: 在 016 M Pa、20
℃下, 对超滤透过液进行纳滤浓缩, 考察浓缩倍数与
膜的渗透通量的关系, 结果见表1。
表 1　浓缩倍数与渗透通量的关系
Table 1　Relation sh ip between concen tration
multiple and osmotic f lux
浓缩倍数 渗透通量ö(L ·m - 2·h- 1)
0 31
1 26
3 20
6 17
　　可以看出, 在纳滤刚开始时, 渗透通量较大。而
随着浓缩倍数的增加, 料液质量浓度增大, 黏度上
升, 浓差极化加剧, 使得渗透通量迅速衰减。当浓缩
倍数大于3 后, 由于膜表面逐渐形成溶质凝胶层, 浓
差极化和溶质反向扩散速度趋于平衡, 凝胶二次阻
力基本不变, 渗透通量也逐渐稳定。为了保持较大的
渗透通量, 料液浓缩倍数一般为3 倍。实际生产中若
使低聚糖浓缩液的盐分进一步降低, 可加入去离子
水继续除盐浓缩, 直至低聚糖浓缩液的含盐量符合
要求为止[12 ]。
21414　纳滤对二糖的分离效果: 用截留相对分子质
量为 200 的纳滤膜目的是除去葡萄糖、果糖等单糖
而保留多糖。为了考察该纳滤膜对二糖以上的多糖
的保留效果, 实验针对不同操作压强、操作温度和料
液质量浓度的蔗糖水溶液, 研究纳滤膜对蔗糖的分
离效果。
　　对20 ℃、质量浓度为015 gömL 蔗糖水溶液, 分别
在0149、0159、0169 M Pa 下进行纳滤实验。在 0159
M Pa, 温度分别为 20、30、40 ℃时, 对质量浓度为
015 gömL 蔗糖水溶液进行纳滤实验。在0159 M Pa、
·263· 中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月
20 ℃下, 对质量浓度分别为013、015、018 gömL 蔗糖
水溶液进行纳滤实验。所有的透过液中多糖量为0,
即未检出蔗糖存在。说明此纳滤膜对二糖以上的截
留率为 100% , 并且不受操作压力、温度和质量浓度
的影响, 能够确保低聚糖的全部截留。
215　地黄低聚糖的制备工艺优化结果: 地黄饮片以
10 倍和8 倍量水回流提取2 次, 滤过, 滤过液分别经
过截留相对分子质量为150 000 和6 000 的聚砜超滤
膜, 其中料液质量浓度在01013～ 01132 gömL , 操作
压力: 0125～ 01275 M Pa , 常温下操作; 超滤透过液
再用纳滤进行浓缩3 倍, 料温为20～ 40 ℃, 操作压力
0159～ 0179 M Pa; 最后对纳滤截留液进行真空冷冻
干燥, 得到的地黄低聚糖得率为 46163% , 蛋白去除
率达到 94115% , 脱色率达到 92131% , 脱盐率达
7218% , 灰分脱除率在8817% 左右, 低聚糖制品的质
量分数为9313%。
216　低聚糖的相对分子质量分析: 为了评估制备的
低聚糖制品的相对分子质量的情况, 对所得多糖制
品进行凝胶滤过。多糖在Sephadex G225 凝胶柱上
用011 mo lömL N aC l 溶液洗脱, 每管收集 3 mL , 硫
酸2苯酚法逐管检测, 结果发现所得制品有两个洗脱
峰, 洗脱曲线见图 6, 说明经获得的多糖相对分子质
量集中在两个成分上。用蓝色葡聚糖测得凝胶柱的
外水体积 (V 0)为29 mL , 5 种标准相对分子质量的葡
聚糖的洗脱体积分别为56、53、44、32、29 mL , 按V eö
V o2lgM r 得相对分子质量测定标准工作曲线, 标准曲线
方程为Y = - 01561 3 X + 31214 9, r= 01996 9。由此
得出两个洗脱峰平均相对分子质量是692 (图中以15
号管为峰最高点)和 5 777 (图中以 10 号管为峰最高
点) , 这与文献报道的地黄低分子多糖集中在相对分
子质量为 1 000 左右的低聚糖和相对分子质量为 5
800 的低分子多糖相一致[3 ]。由测得的平均相对分
子量来看, 低聚糖制品的相对分子质量分级较为理
想。
管号
图 6　Sephadex G-25 柱洗脱曲线
F ig16　Elution curve of Sephadex G-25 column
3　讨论
　　本实验表明采用截留相对分子质量为 150 000
和6 000 的超滤膜不仅提取了地黄低聚糖溶液, 还可
以有效的降低无效多糖和蛋白的量及其他杂质; 截
留相对分子质量为200 的纳滤膜可对分离蛋白后的
低聚糖提取液进行脱水除盐浓缩, 达到富集低聚糖
的目的。结果表明, 采用两次超滤结合纳滤的工艺对
地黄多糖进行分离浓缩, 工艺简单可行, 节约能耗,
有效多糖纯度好, 为工业生产上分离分析打下了良
好的基础。
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《中草药》重要启事
　　从2008 年第1 期开始本刊所刊用文章文后的参考文献使用原语种撰写, 按照国家标准《文后参考文献著
录规则》(GB öT 771422005) 书写。具体参考文献书写示范例见本刊 2008 年第 39 卷第 1 期上刊登的“《中草
药》杂志2008 年投稿须知”。
·363·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 3 期 2008 年 3 月