全 文 ：取法。本实验采用了蛋白沉淀法[ 2] , 考察了醋酸乙
酯、氯仿、乙醚 3种试剂处理血浆样品。计算用 3种
不同试剂处理血浆样品的瑞香素提取率大小为醋酸
乙酯> 乙醚> 氯仿, 而用乙醚处理的血浆杂峰较多,
故选用醋酸乙酯为萃取溶剂。
41 3 药动学结果的探讨: 瑞香素 iv 给药后在大鼠
体内符合一室开放模型, 而 ig 给药后在大鼠体内也
符合一室开放模型。
瑞香素 iv 后的 t1/ 2( e) 为 01 091和 ig 后的 t1/ 2( e)
为 01 106,说明瑞香素属于快速消除药物,且两种给
药途径使瑞香素在大鼠体内的保留时间不同, ig 给
药比 iv 给药在体内停留时间长些。iv 给药曲线下
面积 ( AU C) 为 01 252 mg # h/ mL, ig 给药为 01 204
mg # h/ mL, 两者差异不大, 但在给药剂量上, ig 给
药为 iv 给药剂量的数倍, 提示瑞香素 iv 给药的药
物利用率大于 ig 给药。
由此可知,瑞香素在临床用药上需要采取相应
的制剂手段增加其在体内的保留时间, 才可确保其
疗效。静注和口服给药各有优势。
参考文献:
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珍珠菜提取物对肝癌抑制作用的研究
唐丽华1 ,王祎茜1 , 梁中琴2 , 游本刚1 ,杨世林1¹
( 11 苏州大学医学部 药学院, 江苏 苏州 215123; 21 苏州大学医学部 基础医学与生物科学学院,江苏 苏州 215123)
摘 要:目的 观察珍珠菜提取物 ( ZE4) 对肝癌体内外的抑制作用。方法 体外采用 MT T 法、3H-T dR 掺入法、
集落形成实验观察 ZE4 对肝癌 SMMC-7721 细胞的杀伤作用; 采用划痕实验法与内皮细胞黏附实验观察 ZE4 对
SM MC-7721 细胞迁移的抑制作用。体内以抑瘤率和脏器指数为指标观察 ZE4 对小鼠肝癌 H22 的作用。结果
ZE4 可抑制 SMMC-7721 细胞的增殖和转移; 体内实验显示 ZE4 可显著抑制小鼠肝癌 H 22 的增殖, 抑瘤率均在
30% 以上,其中中剂量 ( 200 mg/ kg) 组的效果最好,可达到 571 8%。结论 ZE4 对肝癌有很好的抑制作用。
关键词:珍珠菜; 肝癌; 转移; 凋亡
中图分类号: R2861 91 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2009) 01-0108-04
肝癌在我国癌症发病率中高居第 2 位, 且在某
些地区呈逐年增高趋势。由于肝癌恶性程度高, 病
情发展快,治疗难度大,成为严重威胁人类健康和生
命的/癌症之王0。虽然手术治疗是首选, 但并不能
解决肿瘤的扩散与转移。所以药物治疗成为中、晚
期肝癌常用的治疗方法。中药因不良反应小, 且有
去邪扶正之功效,更易被患者接受,因此从中草药中
寻找抗肿瘤药物已成为人们关注的焦点。
珍珠菜为报春花科植物虎尾珍珠菜 L y sima-
chia clethroides Duby 的根或全草 [ 1] , 具有清热解
毒、活血调经、利水消肿等功效; 在民间广泛用于治
疗咽喉肿痛、虫蛇咬伤、跌打损伤、妇女月经不调等
症。珍珠菜的化学成分研究较多,而药理作用研究
却少见报道[ 2]。早在 1977年就有报道显示珍珠菜
总黄酮苷具有良好的抗肿瘤作用[ 3] , 但其后报道甚
少。本课题组通过对珍珠菜抗肿瘤有效部位的进一
步纯化,提高了提取物中总黄酮的量,观察了该提取
物 ( ZE4) 体外对人肝癌细胞 ( SMMC-7721) 的作
用和体内对荷瘤 H 22小鼠的抑瘤作用。
1 材料与仪器
11 1 药物: 珍珠菜采用醇提水沉法提取后,浓缩至
一定浓度,经大孔吸附树脂分离纯化,经体外筛选得
到活 性部 位 ( ZE4 ) , 其中 总黄 酮质 量 分数
为 331 35%。
11 2 试剂和仪器:培养基 RPMI 1640 培养基, Gib-
co 产品;超级新生小牛血清 ( FBS) ,杭州四季青生
物工程材料研究所生产;胰酶、四氮唑蓝 ( M TT ) 为
AMRESO 分装;氟尿嘧啶注射液 ( 5-FU, 南通精华
制药有限公司, 批号 051002) ; 注射用盐酸柔比星
( DSR,深圳万乐有限公司, 批号 0505E1) ; 3H-T dR
#108# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
¹ 收稿日期: 2008-05-10基金项目:江苏省苏州市社会发展基金资助项目 ( ZS0307) ; 苏州大学医学发展基金项目 ( EE132609)作者简介:唐丽华( 1952 ) ) ,女,副教授,硕士生导师,研究方向为中药药理、中药新制剂及新剂型研究。
T el : ( 0512) 65880029 E-mail: t an glihua@ suda. edu. cn.
购自上海原子能研究所; 注射用环磷酰胺 ( CT X, 江
苏恒瑞医药股份有限公司, 批号 05121621) ; Ho-
echst 试剂盒, 购自碧云天公司; 其余试剂均为国产
分析纯。HeraeusBB16U V 型 CO2孵箱, Heraeus
公司; XDS ) 1B 型倒置显微镜, 重庆光学仪器厂; e-
clipse TE2000 ) U 型倒置荧光显微镜, 日本 Nikon
公司; DG3002 型酶联免疫检测仪,国营华东电子管
厂; 766 ) 3型远红外干燥箱, 上海浦东跃欣科学仪
器厂生产; Wallac 1409 型液体闪烁测量仪, 瑞典法
码西亚公司生产。
11 3 细胞株与瘤株:人肝癌细胞株 SMMC-7721 由
本实验室保存, 小鼠移植肝癌 H 22瘤株由南京中医
药大学提供。
11 4 动物: 昆明种小鼠, 雌雄各半, 体质量 18 ~
22 g,由苏州大学实验动物中心提供,实验动物生产
许可证号: SCXK (苏) 2002-0008,实验动物使用许
可证号: SYXK (苏) 2002-0037。
2 实验方法
21 1 体外对人肝癌 SMMC-7721 细胞的作用
21 11 1 细胞培养: SMMC-7721 细胞用含 10% 灭
活 FBS 的 RPM I-1640 培养基 ( 另加葡萄糖
01 03%, Hepes 0. 06%, NaHCO3 0. 2% ) 于 37 e 、
5% CO2条件下培养, 3 d 传代,取对数生长期细胞
进行实验。
21 11 2 MT T 法 [ 4] : M TT 法检测 ZE4 对 SMMC-
7721 细胞存活的抑制作用。取对数生长期肿瘤细
胞,用完全培养基调整细胞浓度为 7 @ 104 / mL, 接
种于 96 孔培养板中, 100 LL/孔, 37 e 、5% CO 2条
件下培养过夜, 次日进行分组:给药组、阳性和阴性
对照组。给药组加入 ZE4 (终质量浓度分别为
100、50、25、121 5、61 25、31 125 Lg / mL) , 阳性对照组
加入 5-FU ( 25 Lg / mL) , 阴性对照组加入完全培养
基,每组均设 6复孔, 培养 24、48、72 h。终止培养
前 4 h 加入 MTT ( 5 mg/ mL) , 10 LL/孔,培养结束
后每孔加入酸化的 10% SDS 100 LL,放置过夜, 于
酶标仪检测 570 nm 时的吸光度 ( A ) 值。重复
3次。
21 11 3 3H-T dR 掺入法: 接种细胞到 24 孔培养板
中, 1 mL/孔分组同 MTT 法。培养 24 h 后给药组
给予不同浓度的 ZE4 (终质量浓度同 MTT 法) , 阳
性对照组加入 DSR ( 10 Lg/ mL) , 阴性对照组加入
等体积完全培养基, 同时加入稀释的 3H-TdR
( 21 4 @ 104 Bq) 10 LL, 继续培养 48 h。收获细胞:
在培养孔中加入蒸馏水, 吹打均匀, 将细胞转移至
49 型玻璃纤维滤膜上,依次用生理盐水、5%三氯醋
酸、无水乙醇洗涤。取下 49 型玻璃纤维滤膜, 置红
外干燥箱干燥, 80 e , 20~ 30 m in。将滤膜片置入
闪烁瓶底部,加入闪烁液 3 mL,在液体闪烁测量仪
上测量每个样品的 cmp 值。
21 11 4 集落形成试验[ 5] :取对数生长期细胞, 用含
10% 小牛血清的 RPM I-1640 培养基调整细胞浓度
为 21 5 @ 102 / mL 于 35 mm 培养皿, 2 mL/孔, 每组
均设 3复孔, 37 e 、5% CO 2条件下培养过夜, 次日
进行分组,分组及给药同 MTT 法, 在含 37 e 、5%
CO 2条件下静置 10 d, 弃去培养基, 用 Gimesa 染色
后镜下计数含 50 个细胞以上的集落, 并摄影。普
通光镜放大两倍拍照。
21 11 5 划痕试验: 细胞接种于六孔板, 培养过夜使
其完全贴壁, 用枪尖在孔中央部划一条直线, PBS
洗一遍, 加入 ZE4 ( 100 Lg / mL) 2 mL,同时以加入
等体积完全培养基为对照组, 分别培养 24、48、72
h, Gimesa 染色,显微镜下观察。
21 11 6 人肝癌细胞与内皮细胞黏附试验:取对数生
长期 ECV304 细胞,调整细胞浓度后接种于 96 孔
培养板中, 37 e 、5% CO 2条件下培养,次日待细胞
贴壁并长满单层后,加入不同质量浓度 ZE4 ( 121 5、
25、50、100、200、400 Lg / mL ) 孵育 60 m in 后的
SMMC-7721 细胞,以加入未经药物孵育的 SMMC-
7721 细胞为对照,继续培养 60 min,用 Dulbeccocs
PBS 清洗细胞 4次, 除去未黏附的细胞, 黏附细胞
用 20% 甲醇稀释的 01 5% 结晶紫染色固定,漂洗,
空气晾干。用比例 1 B1的乙醇和 01 1 mmol/ L 枸
橼酸钠溶液溶解染色细胞, 酶标仪在 540 nm 处测
吸光度值。
21 2 体内抑瘤作用的药效学研究:抽取小鼠移植肿
瘤 H 22腹水细胞 ( 4 @ 107 / mL) ,按每只小鼠 01 1 mL
接种于小鼠右侧腋下, 接种后随机分组, 阴性对照
组, ZE4 高、中、低剂量 ( 400、200、100 mg / kg ) 组,
CTX ( 25 mg/ kg) 组。第 2 天起 ig 给药, 每天 1
次,共 10 d。各组给药容积均为 01 02 mL/ g, 对照
组给予相同体积的蒸馏水。末次给药 24 h 后处死
小鼠, 分别称取瘤质量、肝质量、脾质量、胸腺质量。
计算抑瘤率和脏器指数。
抑瘤率= (阴性对照组平均瘤质量- 给药组平均瘤质
量) /阴性对照组平均瘤质量@ 100%
21 3 数据统计:采用 SPSS 统计程序进行单因素方
差分析处理,组间比较采用 Studentct 检验。
3 实验结果
#109#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
31 1 体外对人肝癌 SMMC-7721 细胞的作用
31 11 1 MT T 法: 与对照组相比不同质量浓度的
ZE4对 SMMC-7721 细胞增殖均有明显的抑制作
用,且呈时间、浓度依赖性。24、48、72 h 的 IC50分
别为 461 19、241 0、141 6 Lg/ mL,结果见表 1。
表 1 ZE4 对 SMMC-7721 细胞存活的抑制作用
( x ? s, n= 6 )
Table 1 Inhibition of ZE4 on viability of SMMC-7721
cells (x ? s, n= 6 )
组 别
剂量/
( Lg # mL- 1 )
A
24 h 48 h 72 h
阴性对照 - 01 175 ? 01 024 01 205 ? 01 035 01 654 ? 01 034
ZE4 31 125 01 168 ? 01 020 01 274 ? 01 044 01 556 ? 01 031
61 25 01 160 ? 01 018 01 263 ? 01 036 01 476 ? 01 033
121 5 01 148 ? 01 032 01 217 ? 01 023* 01 440 ? 01 034* *
25 01 126 ? 01 005* 01 164 ? 01 027* * 01 352 ? 01 017* *
50 01 081 ? 01 019* * 01 113 ? 01 015* * 01 178 ? 01 032* *
100 01 046 ? 01 001* * 01 024 ? 01 004* * 01 008 ? 01 003* *
5-FU 25 01 108 ? 01 009* * 01 302 ? 01 039* * 01 080 ? 01 011* *
与阴性对照组比较: * P< 01 05 * * P< 01 01
* P< 01 05 * * P < 01 01 vs negat ive cont rol group
31 11 2 3H-T dR 掺入法: 观察 ZE4 对 SMMC-7721
细胞增殖的抑制作用, 结果表明, ZE4 作用 48 h 可
有效抑制细胞增殖, 其中 25、50、100 Lg/ mL 剂量组
的抑制率分别为 431 5%、741 2%、831 9% ,且与阴性
对照组相比具有极显著性差异 ( P< 01 01) ,见表 2。
表 2 ZE4 对 SMMC-7721 细胞增殖的抑制作用
( x ? s, n= 6 )
Table 2 Inhibition of ZE4 on prolif eration
of SMMC-7721 cells ( x ? s, n= 6 )
组 别 剂量/ ( Lg # mL- 1 ) 3H-cpm
阴性对照 - 11061 0 ? 1541 0
ZE4 31125 10231 9 ? 1001 1
6125 11971 7 ? 651 2
1215 8041 0 ? 871 9*
25 6241 7 ? 471 5* *
50 2851 5 ? 251 0* *
100 1771 6 ? 171 6* *
DXR 10 691 4 ? 191 5* *
与阴性对照组比较: * P< 01 05 * * P< 01 01
* P< 01 05 * * P < 01 01 v s negat ive cont rol group
31 11 3 集落形成试验: ZE4 对 SMMC-7721 细胞克
隆形成的抑制作用, 阴性对照组集落形成率为
541 9%, ZE4 121 5~ 100 Lg/ mL 及 5-FU 组无集落
形成, ZE4 61 25 Lg/ mL 剂量组集落形成率为
101 2%,抑制率为 791 8%; 31 125 Lg/ mL 剂量组集
落形成率为 361 0% , 抑制率为 281 5%。普通光镜
拍照结果见图 1。
31 11 4 划痕试验: ZE4 体外对肝癌 SMMC-7721 细
胞迁移的影响, 在各时间点, ZE4 ( 100 Lg/ mL) 组
细胞的迁移距离均小于对照组, Giemsa 染色后普通
光学显微镜观察并拍照,结果见图 2。
31 11 5 内皮细胞黏附试验: 试验结果显示, 随给药
剂量增加,对内皮细胞 ECV 304 黏附的抑制作用提
高, 100 Lg/ mL ZE4 对 ECV 304 黏附的抑制率为
511 5% ,且与对照组比较具有极显著性差异 ( P<
01 01) , 结果见表 3。
表 3 ZE4 对内皮细胞黏附的影响 (x ? s, n= 6 )
Table 3 Ef fects of ZE4 on adhesion of endothelial cells
(x ? s, n= 6 )
组 别 剂量/ (Lg # mL- 1) A
对照 - 21 667 ? 01 544
ZE 4 121 5 21 258 ? 01 156
25 11 688 ? 01 066* *
50 11 569 ? 01 340* *
100 11 293 ? 01 238* *
200 01 566 ? 01 276* *
400 01 256 ? 01 051* *
与阴性对照组比较: * * P< 01 01
* * P < 01 01 v s negat ive cont rol group
31 2 体内抑瘤作用的药效学研究
31 21 1 ZE4对小鼠 H 22肝癌的增殖抑制作用; 实验
#110# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 1 期 2009 年 1 月
结果显示 ZE4 可显著抑制小鼠 H 22肝癌的增殖, 抑
制率均在 30% 以上, 且与对照组相比差异显著或
非常显著 ( P< 01 05, 01 01) 其中 200 mg/ kg 剂量
组的抑瘤效果最好, 可达到 571 8%,见表 4。
表 4 ZE4 对小鼠 H22肝癌的增殖影响 ( x? s, n= 10 )
Table 4 Effects of ZE4 on multiplication
of H22 in mice ( x ? s, n= 10 )
组 别 剂量/
( mg # kg- 1)
动物体质量/ g
前/后
瘤质量/
g
抑瘤率/
%
阴性对照 - 191 9/ 231 4 11 47 ? 01 87 -
ZE4 400 191 7/ 231 2 01 66 ? 01 34* * 541 6
200 201 1/ 221 6 01 62 ? 01 34* * 571 8
100 191 1/ 231 1 01 85 ? 01 44* 421 1
CT X 25 201 4/ 221 9 01 45 ? 01 17* * 691 0
与阴性对照组比较: * P< 01 05 * * P< 01 01
* P< 01 05 * * P < 01 01 v s negat ive cont rol group
31 21 2 ZE4 对小鼠脏器指数的影响: ZE4 各剂量
组对小鼠的肝指数、脾指数、胸腺指数的影响与阴性
对照组相比均无显著性差异, 而 CTX ( 25 mg / kg)
组的胸腺指数明显下降, 且与阴性对照组相比具有
极显著性差异 ( P< 01 01)。与 CTX 组相比, ZE4
各剂量组胸腺指数都有显著性或极显著性差异
( P< 01 05、01 01) ,说明 ZE4 在发挥抗癌作用的同
时不会产生 CTX 那样的免疫抑制,结果见表 5。
4 讨论
每年有 90% 的癌症病人死于肿瘤的转移。如
何抑制肿瘤细胞由原发病灶迁移到其他器官已成为
肿瘤治疗的一大挑战。目前抗肿瘤药物的研究通常
集中在对癌细胞增殖的抑制方面, 而对血管生成和
细胞迁移的研究正逐步成为抗肿瘤药物的研究热
表 5 ZE4 对小鼠脏器指数的影响 (x ? s, n= 10 )
Table 5 Effects of ZE4 on indexes of organ in mice (x ? s, n= 10 )
组 别 剂量/
( m g # kg- 1 )
动物体质量/ g
前/后
肝指数/
( g # kg- 1 )
脾指数/
( g # kg- 1 )
胸腺指数/
( g # k g- 1)
阴性对照 - 191 9/ 231 4 55167 ? 71 98 71 88 ? 2126 21 68 ? 11 27
ZE4 400 191 7/ 231 2 51175 ? 61 51 81 48 ? 1175 21 43 ? 11 04# #
200 201 1/ 221 6 51135 ? 51 72 81 31 ? 1165 11 95 ? 11 24#
100 191 1/ 231 1 54177 ? 81 69 71 94 ? 2149 21 44 ? 11 06# #
CT X 25 201 4/ 221 9 55166 ? 81 69 81 62 ? 2113 11 17 ? 01 30* *
与阴性对照组比较: * * P < 01 01; 与 CT X组比较: # P < 01 05 # # P < 0101
* * P< 01 01 v s n egative cont rol g rou p; # P < 01 05 # # P < 01 01 v s CTX group
点[ 6]。本研究的体外实验结果表明 ZE4 对肝癌
SMMC-7721细胞的增殖和迁移有明显抑制作用,
提示其在治疗肿瘤转移方面有很大的潜力。体内实
验结果表明, ZE4 可显著抑制小鼠 H 22肝癌的增殖,
其中中剂量 ( 200 mg / kg) 组的抑瘤效果最好,可达
到 571 8%。而且 ZE4 各剂量组对小鼠的肝指数、
脾指数、胸腺指数的影响与空白组相比均无显著性
差异,说明 ZE4 在发挥抗癌作用的同时不会对机体
的免疫功能造成影响。而其体内肿瘤转移的作用及
其机制还有待深入研究。以上研究结果为 ZE4 临
床应用、新药开发提供了一定的实验数据、理论依据
和较好的参考价值, 也说明该药具有很好的推广、应
用前景。
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