全 文 ：响[22 ] 。目前的研究表明多倍体内 ITS 区序列的进
化十分复杂 (尤其在异源多倍体中) ,祖先的 ITS 区
序列在多倍体内可能共存[23 ] ,也可能朝着某一祖先
的序列进化[24 ] 。绞股蓝种内有 4 种倍性 ,其多倍体
复杂的起源 (种内还是种间起源) 与扩散方式 ,以及
不同于二倍体的基因交流方式和复杂的 ITS 同步
进化方向可能导致其 ITS 基因型与地理分布的差
异。应用分子生物学方法对绞股蓝多倍体的来源和
性质进行研究是十分必要的。鉴于绞股蓝 ITS 基
因型与地理分布的部分不一致性 ,要确定不同地区
的绞股蓝合理的亲缘关系还需要结合其他方面的证
据 ,从而达到准确的分子鉴定的目的。
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高山红景天叶肉原生质体分离培养与植株再生
刘剑锋 ,程云清 ,陈智文 3
(吉林师范大学 ,吉林 四平 　136000)
摘 　要 :目的 　利用高山红景天组培苗叶片分离得到原生质体 ,经培养后获得再生植株。方法 　研究了外植体前
期预处理、外植体大小、酶液配比、酶液中甘露醇浓度等影响原生质分离的相关因素 ,确定最优分离条件。结果
用于原生质体分离的外植体无需黑暗预培养便可进行原生质体分离 ,外植体叶片长度大于 115 cm 为宜。获得原
生质体的酶液组成为 :110 %纤维素酶 Onzuka R210 + 015 %果胶酶 Macerozyme R210 + 10 mmol/ L CaCl2 ·2 H2 O +
011 % MES + 017 mmol/ L KH2 PO4 + 015 mol/ L 甘露醇 ,在 25 ℃条件下酶解 4 h ,原生质体最高产量为 39143 ×
106 个/ g 鲜质量 ,原生质体活力为 7816 %。原生质体培养基为 1/ 2MS + 1 mg/ L 2 ,42D + 015 mg/ L ZT + 015 mol/ L 甘
露醇 + 500 mg/ L 水解酪蛋白。浅层培养 40 d 时形成小愈伤组织。愈伤组织在 MS + 1 mg/ L 62BA + 011 mg/ L NAA
·7211·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
3 收稿日期 :2008210219　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金项目“药用植物高山红景天优良种质筛选与倍性创新研究”(30801516) ;吉林省教育厅“十一五”科学技术
研究项目“高山红景天四倍体的诱导与鉴定 (吉教科合字 2007 第 367 号)”
作者简介 :刘剑锋 (1976 —) ,男 ,湖北黄石人 ,吉林师范大学生命科学学院副教授 ,硕士生导师 ,从事细胞生物学的教学研究工作 ,已发表
论文 30 余篇。Tel : (0434) 3292019 　E2mail :jianfengliu1976 @1631com
诱导产生不定芽 ,不定芽转入 1/ 2MS 基本培养基可获完整再生植株。结论 　本研究为高山红景天多倍体育种提供
了科学依据。
关键词 :高山红景天 ;原生质体 ;培养 ;再生
中图分类号 :R28211 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0721127205
Protoplast isolation and plant regeneration from leaves of Rhodiola sachalinensis
L IU Jian2feng , CH EN G Yun2qing , CH EN Zhi2wen
(Jilin Normal University , Siping 136000 , China)
Abstract : Objective 　To isolate p rotoplast s f rom t ube plant leaves of R hodiol a sachal i nensis and re2
generate plantlet s af ter p rotoplast cult ure1 Methods 　Precult ure t reatment and size of explant s , enzyme
concent ration , mannitol concent ration in enzyme mixt ure related wit h p rotoplast s isolation were studied to
determine t he superior optimized conditions1 Results 　Explant s could be used to isolate p rotoplast wit hout
dark precult ure , and leaf lengt h should be longer t han 115 cm1 The best incubating enzyme solution con2
tains 110 % cellulase Onzuka R210 , 015 % Macerozyme R210 , 10 mmol/ L CaCl2 ·2 H2 O , 011 % M ES , 017
mmol/ L KH2 PO4 , and 015 mol/ L mannitol1 The enzyme and explant s mixt ure were shaken for 4 h at 25
℃1 The protoplast s yield and viability were 39143 ×106 / g f resh weight and 7816 % , respectively1 Purified
protoplast s were cult ured in medium 1/ 2 MS + 1 mg/ L 2 , 42D + 015 mg/ L ZT + 015 mol/ L mannitol + 500
mg/ L hydrolysis of casein initially with shallow liquid layers , and calli formed wit hin 40 d1 After calli were
t ransfered to MS + 1 mg/ L 62BA + 011 mg/ L NAA , adventitious buds were induced f rom calli1 Shoot s lon2
ger t han 2 cm rooted within 30 d when t hey were t ransfered to 1/ 2 MS medium1 Conclusion 　The study
provides t he scientific base for p rotoplast f usion in polyploidy breeding of R1 sachal i nensis1
Key words : R hodiol a sachali nensis A1 Bor . ; p rotoplast ; cult ure ; regeneration
　　高山红景天 R hodiol a sachal i nensis A1Bor1 为
景天科红景天属 ( R hodiol a L1 )多年生草本植物 ,是
长白山珍稀药用植物之一 ,具有抗缺氧、抗寒冷、抗
疲劳、抗微波辐射等显著功能。由于高山红景天资
源的大量开发利用 ,野生资源日趋枯竭[1 ,2 ] 。近年
来 ,高山红景天人工栽培技术逐渐完善[3 ] ,但其人工
栽培迄今始终受海拔高度限制 ,还受栽培周期长、产
量不丰、药用活性成分的量偏低等问题的严重制
约[4～6 ] ,因此 ,创造适宜人工栽培的新种质是推动高
山红景天可持续发展的根本出路之一。原生质体培
养、融合和转化已经成为植物细胞改良创造新种质
的新途径 ,并已在改变植物遗传性的应用研究和基
础研究中广泛应用[7 ,8 ] 。高山红景天多倍体育种与
原生质体培养研究在国内外尚未见到相关报道 ,本
研究在建立高山红景天组织培养体系的基础上 ,探
讨酶液配比、酶解时间等多种因素对分离高山红景
天原生质体的产量和活力的影响 ,并进行培养获得
愈伤组织 ,进而再生完整植株 ,为高山红景天原生质
体融合、遗传转化等研究提供科学依据。
1 　材料和方法
111 　材料 :建立高山红景天组培体系 ,参照刘剑锋
等[9 ] 的方法进行 ,以高山红景天组培苗叶片为材料
进行原生质体的分离纯化。
112 　原生质体分离与纯化 :在进行原生质体的分离
纯化前 ,对组培苗进行 2 d 的暗培养 ,对比分析光照
与暗培养对原生质体分离的影响。幼嫩叶片 (长
015～310 cm)切成宽 110～210 mm 的条状 ,以 1 ∶
10 的量将材料放入酶液。酶液组成为 015 %～2 %
纤维素酶 Onzuka R210 ,013 %～110 %果胶酶 Mac2
erozyme R210 , 10 mmol/ L CaCl2 ·2 H2 O , 011 %
M ES ,017 mmol/ L KH2 PO4 ,014～016 mol/ L 甘露
醇 ,p H = 518。于 25 ℃,黑暗条件下振荡酶解 1～5
h ,转速为 80 r/ min。酶解后的原生质体和酶混合
液经 250 目的尼龙网滤过后以 800 r/ min 离心 8
min 沉降原生质体。向沉降的原生质体中再加入洗
涤液和液体培养基各清洗 1 次备用。洗涤液为 10
mmol/ L CaCl2 ·2 H2 O , 011 % M ES , 017 mmol/ L
KH2 PO4 ,014 mol/ L 甘露醇 ,p H = 518。原生质体
液体培养基为 :1/ 2MS + 1 mg/ L 2 ,42D + 015 mg/ L
ZT + 015 mol/ L 甘露醇 + 500 mg/ L 水解酪蛋白。
113 　原生质体存活率及产量的测定 :原生质体产量
用血球计数板进行计数 ,以每克鲜质量组织获得的
原生质体个数 (个/ g) 来表示 ;活力测定采用 Evans
Blue 染色法[ 10 ] ,存活率 = (未染蓝细胞数/ 细胞总
·8211· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
数) ×100 %。
114 　原生质体培养 :将原生质体密度调到 210 ×
105 个/ mL ,转入原生质体液体培养基中进行液体
浅层黑暗静置培养。在培养过程中每 10 d 以 3 ∶1
(原生质体培养基 ∶无渗透压调节剂培养基)比例加
入无渗透压调节剂培养基 ,逐步降低渗透压。
115 　愈伤培养与植株再生 :当多细胞团进一步增
大 ,形成肉眼可见的小愈伤组织时 ,挑出并转移到愈
伤组织培养基 MS + 62BA 2 mg/ L + NAA 015 mg/
L ,转为光照培养之前 ,首先经过 2～3 d 的弱光培养
锻炼阶段 ,然后转入光照培养 ,继续培养约 1 个月时
间。经 3 次继代培养后 ,挑选鲜绿色愈伤组织转入
芽分化培养基 MS + 1 mg/ L 62BA + 011 mg/ L
NAA ,待小芽长至 210 cm 左右 ,切下转入生根培养
基上形成完整植株 ,生根培养基为 1/ 2MS。培养基
p H = 518 ,琼脂 6 g/ L ,蔗糖 25 g/ L ,在 112 kg/ cm2
压力下灭菌 20 min ,培养温度 (25 ±2) ℃,光照强度
为 2 000～3 000 lx ,每天光照 12 h。
116 　统计分析 :应用 SAS812 统计软件中 GL M 模
块进行邓肯氏新复极差显著性分析 ,如结果为百分
率数据 ,经过反正弦转化后进行统计分析。
2 　结果与分析
211 　光照与黑暗预培养对高山红景天原生质体分
离的影响 :进行原生质体分离以前 ,材料常进行一段
时间的暗培养 ,暗培养可提高原生质体的产量[7 ] 。
在本研究中 ,光照与黑暗培养对高山红景天原生质
分离的影响见图 1 ,结果表明 ,在相同酶解时间条件
下 ,光照与黑暗培养处理的原生质体产量间差异均
不显著 ( P > 0105) 。因此 ,在进行原生质体分离以
前 ,用于原生质体分离的组培苗的光照条件似乎并
不是影响其最终的原生体产量的关键因素 ,在此后
的实验中 ,直接采用没有进行黑暗预培养的组培苗
进行原生质体分离。
212 　叶片大小对高山红景天原生质体分离的影响 :
采用不同长度叶片进行原生质体的分离 ,结果表明
外植体叶片长度与原生质体产量间存在密切的关系
(图 2) 。相同酶解时间条件下 ,叶片长度为 11 5～
215 cm 和大于 215 cm 的叶片原生质体产量显著高
于叶片长度小于 115 cm 的处理 ( P < 0105) ,但前两
者间的差异并不显著 ( P > 0105) 。因此 ,高山红景
天叶片进行原生质体分离时 ,选用长度大于 115 cm
的叶片较为适宜。
213 　酶类组合对高山红景天原生质体分离的影响 :
纤维素酶与果胶酶组合对高山红景天原生质体分离
的影响见表 1。在 9 种酶类的组合中 ,从存活率的
大小来看 ,各处理存活率大小顺序为 :1 > 4 > 5 > 2 >
7 > 3 > 8 > 6 > 9 ,从产量来看 ,各处理产量大小顺序
为 :5 > 3 > 6 > 2 > 7 > 4 > 8 > 1 > 9。因此 ,存活率与
产量间的变化并不一致。综合来看 ,处理 5 的产量
显著高于其他处理 ( P < 0105) ,而其存活率也保持
较高的水平 ,考察产量 ×存活率的数值 ,处理 5 也显
著高于其他处理 ( P < 0105) 。因此 ,采用处理 5 的
酶组合 (1 %纤维素酶 + 015 %果胶酶)可获得最大存
活原生质体产量。
214 　酶解时间与酶液中甘露醇浓度对高山红景天
原生质体产量的影响 :酶液中酶解时间与甘露醇浓
度对高山红景天原生质体产量的影响见表2 。从原
·9211·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
表 1 　纤维素酶与果胶酶组合对高山红景天原生质体分离
和存活率的影响
Table 1 　Effect of cellulase and pectinase combination
on isolation and survival rate of R1
sachalinensis protoplasts
处理
纤维素酶
/ %
果胶酶
/ %
产量
( ×106 个·g - 1)
存活率
/ %
产量×存活率
( ×106 个·g - 1)
1 015 013 2916 e 6713 a 19192 bc
2 015 015 3217 bcd 581 4 b 19109 cd
3 015 110 3514 b 491 7 d 17159 d
4 110 013 3214 cd 6514 a 21118 b
5 110 015 3813 a 601 3 b 23109 a
6 110 110 3317 bc 471 2 d 15190 e
7 210 013 3217 cd 5412 c 17172 d
8 210 015 3014 de 471 7 d 14150 e
9 210 110 2417 f 3916 e 9178 f
　　本实验中采用的酶液为 : 纤维素酶 ( 015 %～2 %) + 果胶酶
(013 %～ 1 %) + 10 mmol/ L CaCl2 ·2 H2O + 01 1 % MES + 01 7
mmol/ L KH2 PO4 + 01 4 mol/ L 甘露醇 ,酶解时间为 4 h。同列内相
同字母表示邓肯氏新复极差法检验在 0105 水平上差异不显著
　　Enzyme solution of experiment contains 01 5 % —2 % cellulase ,
01 3 % —1 % macerozyme , 10 mmol/ L CaCl2 ·2 H2O + 01 1 %MES ,
01 7 mmol/ L KH2 PO4 , and 014 mol/ L mannitol1 Duration of enzy2
maticdigestion is 4 h1 Different letters wit hin a column indicate sig2
nificant difference at P = 01 05 by Duncan′s multiple range test s
生质体产量看 (表 2) ,酶解时间 1 h 时 ,仅有少量原
生质体游离出来 ;在 1～4 h ,随酶解时间的延长 ,产
量递增 ,并在 4 h 时达到最高值 ,这与图 1 和 2 的结
果相似 ;以后随酶解时间的延长 ,产量下降。从原生
质体存活率看 ,酶解早期的原生质体存活率较高 ,到
产量最高值时 ,仍保持较高的存活率水平。但当酶
解时间达到 5 h 时 ,存活率明显下降。酶解后期的
产量和存活率下降 ,是由于酶解液长时间浸泡造成
部分原生质体破裂和损伤引起的 ,当大量原生质体
表 2 　酶解时间和酶液中甘露醇浓度对高山红景天原生
质体产量和存活率的影响
Table 2 　Effects of enzymaticdigestion time and mannitol
concentrations on yield and survival rate of R1
sachalinensis protoplasts
培养
时间/ h
原生质体产量/ ( ×105 个·g - 1 )
014/
(mol ·L - 1 )
015/
(mol ·L - 1 )
016/
(mol ·L - 1 )
存活率/ %
014/
(mol ·L - 1 )
015/
(mol ·L - 1 )
016/
(mol ·L - 1 )
1 6142 d 8197 e 5121 e 6514 a 7816 a 6312 a
2 19164 c 24187 d 16145 d 6513 a 7418 a 5518 b
3 30147 b 35171 b 24166 b 6316 a 6914 b 4918 c
4 35175 a 39143 a 28133 a 5814 b 6519 bc 4014 d
5 30165 b 32111 c 21187 c 5014 c 6017 c 3213 e
　　本实验中采用的酶液为 : 1 %纤维素酶 + 015 %果胶酶 + 10
mmol/ L CaCl2 ·2 H2O + 01 1 %MES + 01 7 mmol/ L KH2 PO4 + 甘露
醇 (014～01 6 mol/ L) ,同列内相同字母表示邓肯氏新复极差法检验
在 01 05 水平上差异不显著
　　Enzyme solution of experiment contains 1 % cellulose , 015 %
macerozyme , 10 mmol/ L CaCl2 ·2 H2O + 01 1 %MES , 017 mmol/ L
KH2 PO4 , and 014 - 01 6 mol/ L mannitol1 Duration of enzymaticdi2
gestion is 4 h1 Different letters wit hin a column indicate significant
difference at P = 0105 by Duncan′s multiple range test s
游离出来以后 ,应及时终止酶解过程并对原生质体
进行收集与纯化。
　　酶液中甘露醇的浓度对原生质体产量与存活率
均有十分明显的影响 (表 2) 。酶液中采用 014 mol/
L 的甘露醇 ,其原生质体产量与存活率均显著低于
采用 015 mol/ L 甘露醇的处理 ( P < 0105) ,如甘露
醇浓度进一步提高 ,原生质体产量及存活率明显下
降。从观察的结果来看 ,酶液中采用 015 mol/ L 甘
露醇的处理经纯化后呈圆球型 ,可观察到大量叶绿
体的存在 (图 321) 。因此 ,酶液采用 015 mol/ L 的甘
露醇用于维持原生质体渗透压效果较好。
12分离纯化后的原生质体　22原生质体第 1 次分裂　32原生质体多次分裂　42细胞团形成
52愈伤组织形成　62愈伤组织开始分化成芽　72试管苗生根　82移栽
12protoplast s after isolation and purification 　22first cell division of protoplast 　32protoplast s after several times of cell division
42cell cluster formed 　52calli formed 　62buds differentiated f rom calli 　72t ube plant rooted 　82t ube plant after t ransplant
图 3 　高山红景天原生质体分离纯化、培养分化与植株再生
Fig13 　Isolation , differentiation and plant regeneration of R1 sachalinensis protoplasts
·0311· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
215 　高山红景天原生质体培养与植株再生 :将纯化
的原生质体密度调到 2 ×105 个/ mL ,在黑暗条件下
进行液体浅层培养 ,经 3 d 可见第 1 次细胞分裂 (图
322) ,图 323、4 为液体浅层培养 14 d 和 20 d 形成细
胞团的情况。在液体浅层培养约 40 d 时 ,可形成图
325 中肉眼可见的愈伤组织。经过 2～3 d 的弱光培
养锻炼 ,将愈伤组织转移到培养基 MS + 2 mg/ L 62
BA + 015 mg/ L NAA 上进行光照培养。继续培养约
45 d 时 ,愈伤组织生长十分旺盛 ,并有少量芽体萌发
(图 326) 。挑选鲜绿色愈伤组织转入芽分化培养基
MS + 1 mg/ L 62BA + 011 mg/ L NAA 进行芽诱导 ,待
小芽长至 210 cm 左右 ,切下转入 1/ 2MS 生根培养基
上形成完整植株 (图 327) ,再生苗移栽温室 1 个月的
情况见图 328。
3 　结语
目前 ,高山红景天的人工栽培需 4～5 年 ,通过原
生质融合的方式获得多倍体种质是提高其药用成分、
缩短栽培年限的可行性途径之一。高山红景天的原
生质体培养研究在国内外尚未见报道 ,本研究结果为
高山红景天的多倍体育种等研究提供了科学依据。
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夏枯草 ISSR分子标记技术的建立与体系优化
廖 　丽 ,郭巧生 3
(南京农业大学中药材研究所 ,江苏 南京 　210095)
摘 　要 :目的 　建立并优化夏枯草 ISSR2PCR 反应体系和扩增程序 ,为探讨夏枯草种质间遗传多样性奠定基础。
方法 　采用单因子试验和正交设计方法 ,研究 Mg2 + 、dN TP、引物、Taq DNA 聚合酶、模板 DNA、退火温度及循环
次数对 PCR 扩增的影响。结果 　夏枯草 ISSR2PCR 的最佳反应体系为 :在 20μL 的反应体系中含模板 DNA 30
ng ,Mg2 + 212 mmol/ L 、dN TP 175μmol/ L 、引物 0175μmol/ L 、Taq DNA 聚合酶 110 U。在此基础上 ,从 92 条引物
中筛选出 18 条扩增稳定、多态性丰富的 ISSR 引物 ,并通过梯度 PCR 试验 ,确定引物最佳退火温度。结论 　采用
单因子试验和正交设计方法可以快速建立 ISSR2PCR 反应体系 ,经过 24 份夏枯草种质检验 ,证明该体系稳定可靠 ,
可用于夏枯草遗传分析。
关键词 :夏枯草 ; ISSR2PCR ;正交设计 ;单因子试验
中图分类号 :R28217 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 0721131205
Establishment of ISSR marker technology and optimization of its system in Prunella vul ga ris
L IAO Li , GUO Qiao2sheng
( Institute of Chinese Medicinal Materials , Nanjing Agricultural University , Nanjing 210095 , China)
Abstract : Objective 　To establish and optimize t he ISSR2PCR reaction system for Prunel l a v ul garis
and lay foundation for it s genetic diversity research1 Methods 　The single2factor and ort hogonal design
were applied for optimizing seven factors in t he ISSR2PCR reaction system including Mg2 + , dN TP , p rim2
·1311·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
3 收稿日期 :2008210228　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30772730)
作者简介 :廖　丽 (1981 —) ,女 ,江西乐安人 ,博士研究生。E2mail :fafu301 @yahoo1con1cn3 通讯作者　郭巧生　Tel : (025) 84396591 　E2mail :gqs @njau1edu1cn