全 文 ：硫酸酯化防风多糖的制备及其抗氧化作用研究
张泽庆,张 静* ,张宏艳, 孙明礼,柳 红
(陕西师范大学食品工程与营养科学学院, 陕西 西安 710062)
摘 要:目的 对防风多糖(SPS)进行硫酸酯化修饰, 并研究其抗氧化活性。方法 用三氧化硫2吡啶法对防风多
糖进行硫酸酯化修饰得到硫酸酯化防风多糖( S2SPS) , 利用紫外、红外分析手段对 S2SPS 进行鉴定, 通过气相色谱
方法研究其单糖组成, 并在体外化学模拟条件下,研究 SPS 和 S2SPS的总还原能力以及对超氧阴离子( OA2 )、羟基
自由基( # OH )的清除作用。结果 SPS和 S2SPS均由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成, S2SPS的
抗氧化活性明显好于 SPS。结论 硫酸酯化可以改善防风多糖的水溶性, 提高其抗氧化活性, 是防风多糖分子修
饰的一种好方法。
关键词:防风多糖;硫酸酯化;抗氧化
中图分类号: R284 文献标识码: A 文章编号: 025322670(2009) 0821208204
许多疾病与自由基导致的生物大分子如蛋白
质、脂质以及 DNA氧化损伤有关, 尤其是活性氧如
超氧阴离子自由基、羟基自由基、脂质自由基与心脑
血管疾病、糖尿病、癌症等密切相关, 而合成的各种
抗氧化剂对肝脏的损伤和致癌作用已成为不容忽视
的问题[ 1]。研究资料表明, 药用植物多糖具有较强
的抗氧化活性[ 2] , 其活性的大小直接或间接地受到
其分子结构的影响, 采取一定的方法对多糖的分子
结构进行适当修饰能够提高其原有的活性或增加新
的活性。目前,对多糖进行修饰的方法有硫酸酯化、
磷酸化、乙酰化、烷基化、磺酰化、羧甲基化等,其中
硫酸酯化最为常用。硫酸酯化修饰不但可能增强原
多糖的某些活性或产生新的生物活性, 而且可以改
善原多糖的水溶性[ 3]。
防风为伞形科多年生草本植物防风 Saposhni2
kovia diva rica ta ( Turez1 ) Schischk 的根, 又名屏
风、风肉、茴芸、茴草。研究表明防风水提液具有明
显的体内抗肿瘤和增强机体免疫功能的作用,大分
子多糖为其主要活性成分。防风多糖的分子修饰,
目前国内外尚未见相关文献报道,为此,本实验对防
风多糖( SPS)进行了硫酸酯化, 并对其抗氧化作用
进行了研究, 以期为防风多糖的开发利用提供实验
数据和参考资料。
1 材料和仪器
11 1 材料与试剂:防风购于西安市中药材店, 经陕西
师范大学药用植物资源与天然药物化学教育部重点
实验室田先华教授鉴定为 S1 divaricata ( Turez1 )
Schischk未抽花茎植株的干燥根。邻苯三酚、三羟甲
基氨基甲烷( Tris)、邻二氮菲( 1, 102菲啰啉)、硫酸亚
铁、双氧水、三氯乙酸( TCA)、三氯化铁、铁氰化钾、吡
啶、氯化钡、硫酸钾、乙酸酐、盐酸羟胺、明胶、各种单
糖标准品、三氧化硫2吡啶等均为分析纯。
112 主要仪器: U23010 Spectrophotometer 紫外可见
分光光度计(日本日立公司制造) ; LXJ ) ÒB型低速大
容量多管离心机(上海安亭科学仪器厂) ; ALPHA
1 ) 4型真空冷冻干燥机 (德国 CHRIST 公司) ;
PHS ) 3C型 pH 计(上海精密科学仪器有限公司) ;
TRACE气相色谱仪(美国菲尼根) ; EQUINX55型傅
里叶变换红外光谱仪(德国 Brucher公司)。
2 实验方法
21 1 SPS的提取:按照文献方法[ 4]优化出的最佳工
艺提取 SPS。
21 2 硫酸酯化防风多糖( S2SPS)的制备:三氧化硫2
吡啶法[ 5, 6]制备 S2SPS。
21 3 S2SPS 的定性判断与定量分析:利用紫外和红
外光谱扫描判断防风多糖硫酸酯化是否成功, 硫酸
钡比浊法[ 7]测定硫酸基的量,根据公式计算取代度
(DS) : DS= 11 62@S% / ( 32- 11 02@S% )。
21 4 SPS 和 S2SPS 的气相色谱分析: 分别称取
30 mg SPS 和 S2SPS, 放入具塞试管中, 加入 01 5
mol/ L硫酸溶液 3 mL后, 封管,在 105 e 水解 8 h,
水解液加少量蒸馏水,用 BaCO3 中和后离心, 上清
液冷冻干燥, 干燥后的样品经糖腈乙酸酯衍生
化[ 8, 9]后,进行气相色谱分析。称取 10 mg单糖标
#1208# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 8 期 2009年 8月
* 收稿日期: 2009201228 基金项目:国家自然科学基金( 10874108) ;陕西省自然科学基础研究计划资助( SJ08A16) ;陕西师范大学实验室开放基金项目资助作者简介:张泽庆( 1979 ) ) ,男,河南南阳人,硕士,研究方向为植物有效成分开发与利用。 E2mail: zeqingzhang@1261 com
* 通讯作者 张 静 E2mail: zhang jin@snnu1 edu1 cn
准品同法衍生化并气相色谱分析。色谱柱:石英毛
细管柱; F ID检测器;柱温, 150 e 保持 01 5 min, 7
e / min程序升温到 190 e , 再以 15 e / min程序升
温到250 e ;检测器温度, 250 e ;进样口温度, 250
e ;载气: N2 , 30 mL/ min,空气2H 2 是 350 B 35。以
肌醇六乙酸酯为内标, 按文献的方法计算样品中各
单糖的物质的量的比。
21 5 SPS和 S2SPS的抗氧化作用测定
21 51 1 SPS 和 S2SPS 的总还原力测定:参照曹炜
等[ 10]的方法,在 10 mL试管中分别加入不同质量浓
度( 1、2、4、6、8 mg/ mL )的 SPS 或 S2SPS 溶液 1
mL, 磷酸盐缓冲溶液 ( 01 2 mol/ L, pH = 61 6) 01 5
mL和 01 3%铁氰化钾 11 5 mL,置于50 e 水浴中反
应20 min, 然后加入 10%的三氯乙酸 1 mL, 混匀后
以3 000 r/ min 离心 10 min, 吸取上清液 2 mL, 加
01 3%三氯化铁溶液01 5 mL,摇匀后在700 nm处测
定吸光度值, 每个浓度平行做 3管,取其平均值。
21 51 2 SPS和 S2SPS 清除超氧阴离子自由基( OA2 )
能力测定:采用邻苯三酚自氧化法[ 11] , 按照表 1的
方法进行加样, 以空白作对照测定样品在 325 nm
下的吸光度值,每隔 01 5 min 记录 1次, 连续记录 4
min,各管的氧化速率及对 O A2 的清除率按下列公式
进行计算。
氧化速率= (最后 1 次记录值- 第 1 次记录值) / 4
清除率= (自氧化管氧化速率- 样品管氧化速率) /自氧
化管氧化速率@100%
表 1 邻苯三酚自氧化法加样表
Table 1 Adding samples of self2oxidation
of 1, 2, 32phentr iol
试 剂 空白管/ mL 自氧化管/ mL 样品管/ mL
T ris2HCl 41 5 41 5 41 5
蒸馏水 01 48 01 4 )
邻苯三酚 ) 01 08 01 08
SPS或 S2SPS ) ) 01 4
总体积 41 98 41 98 41 98
21 51 3 SPS和 S2SPS 清除羟自由基( # OH)能力测
定:按照文献方法[ 12] , 采用邻二氮菲2金属铁离子2
H 2O2 体系测定 SPS和S2SPS对# OH 的清除能力。
3 结果与分析
31 1 SPS 硫酸酯化的结果: 01 500 1 g SPS 经三氧
化硫2吡啶法硫酸酯化后得到01 717 4 g S2SPS,得率
为1431 45%, 硫酸钡比浊法测得 S2SPS 的硫酸基的
量为191 385 3% ,取代度( DS)为 01 412。SPS 经硫
酸酯化后颜色由浅棕色变为棕黄色, 且在水中的溶
解性能显著改善。
31 2 S2SPS 的光谱学鉴定结果:紫外光谱扫描显
示, S2SPS 在 218、264 nm 左右处出现了2S2O2和2
SO3 的吸收, 而 SPS 在 200~ 400 nm范围内没有出
现吸收峰,初步说明 SPS硫酸酯化已经成功。
SPS、S2SPS的红外光谱显示, 硫酸酯化前后的
SPS,在吸收波形、波数、吸收峰强度、峰宽等指标上
十分接近,说明两者的成分非常相似。S2SPS 的红
外光谱显示了两个特征吸收带, 一个在1 2401 86
cm- 1的是由于 OSO-3 中不对称 S= O 伸缩振动引
起的,另一个在 8101 97 cm- 1的是由于对称的 C2O2S
振动引起的,进一步证明 S2SPS制备成功。
31 3 SPS 和S2SPS的气相色谱分析结果:图1为混
合标准单糖糖腈乙酸酯衍生化后的气相色谱分析结
果,图 2为 SPS、S2SPS水解产物糖腈乙酸酯衍生化
后的气相色谱分析结果。SPS、S2SPS的 GC图和混
合标准单糖的 GC图比较结果表明, SPS、S2SPS 的
单糖组成基本相同, 均由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、
葡萄糖和半乳糖组成, 只是各种单糖之间的比例略
有差别。SPS中各种单糖组成的物质的量比:鼠李
糖2阿拉伯糖2甘露糖2葡萄糖2半乳糖为 01 52 B
31 88 B01 92B 71 99 B 31 16; S2SPS中各种单糖组成
的物质的量比则为鼠李糖2阿拉伯糖2甘露糖2葡萄
糖2半乳糖为 01 20 B 21 17B 01 76 B 21 32 B 21 84。葡
萄糖、阿拉伯糖在 S2SPS中所占比例比在 SPS 中所
占比例显著降低,这可能与硫酸基团的引入有关。
31 4 SPS和 S2SPS 的抗氧化试验结果
31 41 1 SPS 和 S2SPS 的总还原力测定结果: 一般
情况下,物质的还原能力越强, 其抗氧化活性也越
高。根据21 51 1的方法, 各个样品反应后的生成物
t / min
12果糖 22鼠李糖 32阿拉伯糖 42木糖
52甘露糖 62葡萄糖 72半乳糖 82内标
12 fru ctose 22rhamnose 32arabinose 42xylose
52mannose 62glucose 72galactose 82internal standard
图 1 混合标准单糖气相色谱图谱
Fig1 1 Gas chromatogram of mixed
standard monosacchar ides
#1209#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 8 期 2009年 8月
t/ min
12鼠李糖 22阿拉伯糖 32甘露糖
42葡萄糖 52半乳糖 62内标
12r hamnose 22arabin ose 32mannose 42glu cose
52galactose 62in ternal stan dard
图 2 SPS、S2SPS水解产物气相色谱图谱
Fig1 2 Gas chromatogram of hydrolyzed SPS and S2 SPS
在 700 nm处的吸光度值的大小即反映了其抗氧化
能力的大小,值越大则样品的还原能力越强, SPS 及
S2SPS 的还原力测定结果见表 2。可以看出, 在实
验质量浓度范围内( 1~ 8 mg/ mL) , SPS 和 S2SPS
的还原力与其质量浓度呈现明显的线性关系, 随着
质量浓度增大, 还原力逐渐增强,且在每种质量浓度
下 S2SPS 的还原力均强于 SPS,可能是由于 SPS 经
硫酸酯化后,多糖残基上的某些羟基接上了硫酸基
团,这种结构上的改变引起了活性的增强。
31 41 2 SPS和 S2SPS 对O A2 的清除作用: SPS和 S2
SPS对 O A2 的清除作用结果见图 3。
可以看出, SPS 和 S2SPS 对 OA2 均具有一定的
清除作用, 并且清除率与多糖质量浓度之间呈现出
表 2 SPS和 S2SPS的还原能力( x? s, n= 3)
Table 2 Reducing power of SPS and S2SPS (x ? s, n= 3)
样 品 700 nm下的吸光度值
1 mg# mL- 1 2 mg# mL- 1 4 mg# mL- 1 6 mg# mL- 1 8 mg# mL- 1
SPS 01098 ? 01 001 01 151 ? 01 001 01263 ? 01 005 01 424 ? 01 002 01 442 ? 01 007
S2SPS 01120 ? 01 002 01 219 ? 01 001 01403 ? 01 002 01 644 ? 01 003 01 758 ? 01 002
Q/ ( mg# mL- 1)
图 3 SPS和 S2SPS对 OA2 的清除作用
Fig1 3 Scavenging ef fect of SPS and S2SPS on OA2
明显的量效关系, 随着质量浓度增加,清除率逐渐增
强,在同样的质量浓度下, S2SPS 对 O A2 的清除作用
明显高于 SPS,这可能与硫酸基的引入改变了多糖
的结构有关。
31 41 3 SPS和 S2SPS 对# OH 的清除作用: SPS和
S2SPS对 # OH 的清除作用结果见图 4。由图 4可
以看出, SPS和 S2SPS 对 # OH 均具有显著清除作
用,并且清除率与多糖质量浓度呈现良好的线性关
系,质量浓度越高,清除率越强, 其中 S2SPS作用效
果明显好于 SPS, 质量浓度在 8 mg/ mL 时, S2SPS
对 # OH 的清除率可达911 257 7%, 远高于 SPS 的
661 043 6%。
4 讨论
Q/ ( mg# mL- 1 )
图 4 SPS和 S2SPS对# OH的清除作用
Fig1 4 Scavenging eff ect of SPS and S2 SPS on # OH
多糖作为一类重要的生物活性物质, 到目前为
止,虽然只有云芝多糖、猪苓多糖、香菇多糖、裂褶多
糖、茯苓多糖等少数应用于临床, 但它们在抗肿瘤、
抗凝血、抗突变、调血脂、抗衰老、抗病毒等疑难病症
的治疗方面已显示了广阔的前景。为了提高多糖的
原有活性或增加新活性, 通过合适的方法对多糖的
结构进行分子修饰是必要的。本研究结果表明, 三
氧化硫2吡啶法对 SPS进行硫酸酯化后,其水溶性和
抗氧化活性明显增强, 这可以为防风多糖类药物的
开发利用提供借鉴与参考。
参考文献:
[ 1] Wang Z J , Luo D H1 Ant ioxidant activit ies of different frac2
t ions of polysaccharide purified from Gynostemma p entap hyl2
#1210# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 8 期 2009年 8月
lum Makino [ J]1 Carbohydr Polymer , 2007, 68( 1) : 542581
[ 2] Kard osova A, Machova E1 Ant ioxidant act ivity of medicinal
plant p olysaccharides [ J]1 Fi toterap ia, 2006, 77 ( 5) : 3672
3731
[ 3] 邓成化, 杨祥良, 王 雁, 等1 硫酸酯化虎奶多糖的制备及
其抗氧化作用研究 [ J]1 中国生化药物杂志, 2001, 22( 1 ) :
1241
[ 4] 张泽庆, 张 静 1 防风多糖提取工艺的研究 [ J]1 陕西农业
科学, 2007 ( 3) : 102131
[ 5] 田庚元, 李寿桐, 宋麦丽, 等1 牛膝多糖硫酸酯的合成及其
抗病毒活性 [ J ]1 药学学报, 1995, 30( 2) : 10721111
[ 6] 刘燕琼, 黄雪松 1 硫酸化大蒜多糖的制备及其鉴定 [ J ]1 食
品科学, 2007, 28( 2) : 912931
[ 7] 丛建波, 王长振, 李 妍1 褐藻硫酸多糖硫酸基含量测定2硫
酸钡比浊法研究 [ J]1 解放军药学学报, 2003, 19( 3 ) : 1812
1831
[ 8] 张惟杰1 糖复合物生化研究技术 [ M]1 第二版. 杭州: 浙江
大学出版社, 19991
[ 9] 朱小萤, 潘建明, 刘小涯, 等1 沉积物中多糖的微波消解及
气相色谱分析 [ J]1 分析化学, 2007, 35( 8) : 1127211311
[ 10] 曹 炜, 卢 珂, 陈卫军, 等1 不同种类蜂蜜抗氧化活性的
研究 [ J]1 食品科学, 2005, 26( 8) : 35223561
[ 11] 艾志录, 王育红, 潘治利, 等1 苹果渣中多酚物质的抗氧化
活性研究 [ J]1 食品科学, 2006, 27( 12) : 16021631
[ 12] 柳 红, 张 静1 不同南瓜多糖体外清除羟自由基作用的研
究 [ J]1 武汉植物学研究, 2007, 25( 4): 35623591
印度块菌的化学成分研究
吴少华,陈有为, 杨丽源,李绍兰,李治滢*
(云南大学云南省微生物研究所, 云南 昆明 650091)
摘 要:目的 研究印度块菌 Tuber ind icum 的化学成分。方法 采用硅胶、Sephadex LH220 柱色谱进行化学成
分的分离纯化, 根据理化性质和波谱数据进行结构鉴定。结果 从印度块菌的 95% 乙醇提取液中分出 10 个化合
物, 分别鉴定为星鱼甾醇( stellasterol, Ñ)、麦角甾醇过氧化物( ergosterol 5A, 8A2peroside, Ò)、菜子甾醇( brassicast2
erol, Ó)、麦角甾醇( ergosterol, Ô)、啤酒甾醇( cer evisterol, Õ)、( 2S, 3S , 4R, 2cR )222N2( 2c2hydroxy2tr icosanoyl)2oc2
tadecan21, 3, 42tr iol(Ö)、脑苷脂 B(cer ebroside B, ×)、尿嘧啶核苷( uridine, Ø)、腺嘌呤核苷( adenosine, Ù)、阿洛糖
醇( allitol, Ú)。结论 化合物Ñ~ Õ为麦角甾醇类衍生物, Ö、×为植物鞘氨醇型鞘酯, 化合物Ñ为首次从该菌中
分离得到。
关键词:印度块菌;真菌;星鱼甾醇
中图分类号: R2841 1 文献标识码: A 文章编号: 025322670(2009) 0821211204
印度块菌 Tuber indicum Cooke et Massee1 为
块菌科块菌属真菌, 分布在海拔1 200~ 2 800 m的
高原坡地上, 与高山针叶林和高山阔叶栎林有共生
关系,主要分布于四川省及云南省,鲜时口尝菌肉有
清甜味,并具有奇特的香味和营养价值,在世界上为
最名贵的野生食用菌之一, 有商品价值出口外销。
为了探讨其化学成分和食用价值的关系, 笔者对采
自云南省永胜县的印度块菌进行了化学成分的研
究,从其乙醇提取物中分离得到 10个化合物,经理
化鉴定和波谱分析, 分别确定为星鱼甾醇( stellas2
ter ol, Ñ)、麦角甾醇过氧化物 ( ergosterol 5A, 8A2
per oside, Ò)、菜子甾醇( brassicasterol, Ó)、麦角甾
醇 ( ergosterol, Ô)、啤酒甾醇 ( cerevisterol, Õ)、
( 2S, 3S, 4R, 2c R )222N2( 2c2hydroxy2t ricosanoyl)2
octadecan21, 3, 42t riol ( Ö)、脑苷脂 B( cer ebroside
B, ×)、尿嘧啶核苷( uridine, Ø)、腺嘌呤核苷( aden2
osine, Ù)、阿洛糖醇( allitol, Ú)。其中化合物Ñ~
Õ为麦角甾醇类衍生物, Ö和×为植物鞘氨醇型鞘
酯,该类化合物具有抗肿瘤和免疫调节的作用[ 1]。
化合物Ñ为首次从该菌中分离得到。
1 仪器与材料
熔点用四川大学科仪厂生产的 XRC) 1型显微
熔点仪测定, 温度计未校准; IR 光谱在 Bio2Rad
FTS2135红外光谱仪上测定;核磁共振谱用 Bruker
AM ) 400型超导核磁共振仪测定, TMS为内标;质
谱由 VG Auto Spec ) 3000型质谱仪测定。薄层色
谱硅胶和柱色谱硅胶均为青岛海洋化工厂出品。印
度块菌新鲜子实体采集于云南省永胜县, 标本由云
南大学云南省微生物研究所陈有为研究员鉴定。
2 提取与分离
印度块菌新鲜子实体切片后风干, 干质量
405 g,用 95%工业乙醇冷浸 3 次, 滤过, 回收乙醇,
#1211#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 8 期 2009年 8月
* 收稿日期: 2009202216 作者简介:吴少华( 1975 ) ) ,女,云南省昆明人,博士,副研究员,现在云南大学云南省微生物研究所工作,主要从事天然产物化学研究。
Tel: ( 0871) 5032423 E2mail: s hwu123@1261 com