全 文 ：高效毛细管电泳法测定生发灵酊中大黄酸的含量
郭　丹1, 陈娜娜2, 杨西晓1, 侯连兵1Ξ
(11 第一军医大学南方医院 药学部, 广东 广州　510515; 21 第一军医大学药物研究所, 广东 广州　510515)
　　生发灵酊剂为本部研制的一种中药复方外用擦
剂, 临床用于治疗脱发。处方中主含何首乌。目前测
定何首乌中大黄酸的方法有H PL C 法[1, 2 ]。高效毛
细管电泳 (H PCE) 是近年来发展迅速的一种新的分
离分析技术, 与传统的分离分析手段相比较, 具有高
效、快速、微量和易于自动化等优势。本实验建立了
H PCE 内标法测定生发灵酊剂中的大黄酸, 简便灵
敏、结果可靠, 重现性好, 能满足生发灵酊的药品质
量监控。
1　仪器与试药
　　W aters 公司高效毛细管电泳仪, 石英毛细管柱
(60 cm ×75 Λm ) , M illenn ium 32 数据处理系统, 离
心机 (ABBO T , 美国) ; 大黄酸、咖啡酸对照品 (中国
药品生物制品检定所) , 生发灵酊剂 (100 mL , 批号:
030612、030626、030718, 自制) , 四硼酸钠、氢氧化钠
均为分析纯。
2　方法与结果
211　缓冲液的配制: 精密称取 5174 g 四硼酸钠溶
于 500 mL 超纯水中, 配成 30 mmo löL 四硼酸钠电
泳缓冲液溶液, 磷酸调 pH 为 812。
212　电泳操作条件: 分离电压为 12 kV ; 检测波长
为 254 nm ; 进样量为 50 kPa×5 s; 缓冲液为 30
mmo löL 四硼酸钠溶液 (pH 812)。每次进样前用缓
冲液冲洗毛细管柱 10 m in, 每次分析后用 011
mo löL 氢氧化钠冲洗 2 m in, 水冲洗 10 m in。所用溶
液均经 0145 Λm 纤维树脂膜滤过。上述电泳条件,
得电泳图, 见图 1。
213　对照品溶液和内标溶液的配制: 精密称取大黄
酸对照品 1510 m g, 置于 100 mL 量瓶中, 用甲醇稀
释至刻度, 摇匀。吸取上述溶液 5 mL 置 25 mL 量瓶
中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 配成 30 ΛgömL 的大黄酸
对照品溶液。精密称取咖啡酸对照品 3010 m g 置于
100 mL 量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀。吸取上述溶液
5 mL 置 25 mL 量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 配成
60 ΛgömL 的咖啡酸内标溶液。 12大黄酸　22内标咖啡酸12rhein　22in ternal standard caffeic acid图 1　对照品 (A)、生发灵酊 (B)和阴性对照 (C)的 HPCE 图谱F ig1 1　HPCE chromatogram s of referencesubstance (A) , Shengfa l ing Tinctura(B) , and negative sample (C)214　供试品溶液的制备: 精密量取生发灵酊剂 10mL , 加 215 mo löL 硫酸 10 mL , 沸水浴回流 1 h, 冷却, 移至分液漏斗中, 用氯仿分 4 次振摇提取 (30、30、20、10 mL ) , 合并氯仿液, 水浴蒸干。残渣加甲醇适量, 微热使之溶解, 定量转移至 50 mL 量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀。精密量取 2 mL 溶液到 2mL 离心管中, 10 000 röm in 离心 15 m in。取上清液, 用 0145 Λm 有机滤膜滤过, 弃去初滤液, 收集续滤液作为供试品溶液。215　阴性对照溶液的制备: 按处方比例及生产制备方法, 制备不含何首乌的阴性样品, 按 214 项下方法制备阴性溶液。216　线性关系考察: 精密吸取大黄酸对照品溶液2、4、6、8、10 mL 置 25 mL 量瓶中, 分别加内标溶液5 mL , 用甲醇稀释至刻度, 摇匀, 按上述电泳条件,分别进样 5 s。以对照品质量浓度为横坐标 (C ) , 大
·75·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 36 卷第 1 期 2005 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2004203211
作者简介: 郭　丹 (1971—) , 男, 湖南韶山人, 主管药师, 硕士研究生, 专业方向为药品检验和仪器分析。
T el: (020) 61641888287215　E2m ail: gdcnn@ 21cn1com
黄酸峰面积与内标峰面积比为纵坐标 (A ) 作图, 得
回归方程A = 01084 9 C - 01015 4, r= 01999 8, 表
明大黄酸在 214～ 12 ΛgömL 和大黄酸峰面积与内
标峰面积比线性关系良好。
217　精密度试验: 同一天配制 6、12、20 ΛgömL 大
黄酸对照品溶液进行测定, 另外同法在不同日内测
定, 分别计算日内、日间精密度, 结果见表 1。
表 1　精密度试验结果 (n= 5)
Table 1　Results of prec is ion test (n= 5)
质量浓度ö(Λg·
mL - 1)
日内精密度
测得量ö
(Λg·mL - 1) RSDö% 日间精密度测得量ö(Λg·mL - 1) RSDö%
2 5194 1118 5195 1134
12 11195 1192 11192 1159
20 19137 2117 19168 1188
218　稳定性试验: 将同一对照品溶液在相同电泳条
件下, 分别于 0、4、8、12、24 h 重复进样 5 s, 得大黄
酸质量浓度的 R SD 为 1192% , 表明大黄酸在 24 h
内测定结果稳定。
219　重现性试验: 对同一批号样品, 分别取样平行
测定 5 次, 得大黄酸质量浓度的R SD 为 2101%。
2110　回收率试验: 精密量取已测知质量分数的生
发灵酊剂 10 mL 于 25 mL 量瓶中, 分别加大黄酸对
照品溶液 (30 ΛgömL ) 2、4、6 mL 和内标溶液 210
mL , 加甲醇至刻度, 依法操作, 进样 5 s, 以大黄酸峰
面积与内标峰面积比代入回归方程计算回收率, 结
果见表 2。
表 2　回收率测定结果 (n= 5)
Table 2　Results of recovery test (n= 5)
样品量ö(Λg·mL - 1) 加入量ö(Λg·mL - 1) 测得量ö(Λg·mL - 1) 回收率ö% RSDö%
2198 0124 31212 96167 1196
2198 0148 31458 99158 2117
2198 0172 31689 98147 2122
2111　样品测定: 取生发灵酊剂 3 批, 精密量取 10
mL 置 25 mL 量瓶中, 加内标溶液 2 mL , 加甲醇至
刻度, 依法操作, 进样 5 s, 内标法计算质量分数, 结
果见表 3。
表 3　生发灵酊中大黄酸的测定结果 (n= 5)
Table 3　Con ten t of rhe in in Shengfa l ing Tinctura (n= 5)
批　号 大黄酸ö(Λg·mL - 1) RSD ö%
030612 7146 1187
030626 7153 2112
030718 7162 1171
3　讨论
　　中药复方制剂中, 所含成分复杂, 采用H PL C 法
进行测定时, 往往因杂质太多, 容易污染色谱柱, 使柱
效降低。而采用H PCE 法进行分析时, 由于毛细管柱
易冲洗再生, 保持高效, 使各成分的分离较佳。
　　本实验曾比较磷酸盐、硼酸2硼砂、四硼酸钠 3
种缓冲液, 发现四硼酸钠对大黄酸的分离最理想。研
究表明缓冲液浓度和 pH 值对分离具有重要影响。
高浓度缓冲液可获得较好的分离, 但保留时间会变
长, 而且导致通过毛细管的电流增加, 从而增大焦耳
热。因此, 实验选用 30 mmo löL 四硼酸钠作缓冲液。
pH 值选择是决定分离成败的一大关键。采用pH 为
812 的四硼酸钠缓冲液时分析时间短, 峰形尖锐、对
称并达到基线分离。研究表明, 柱温降低分离度变
好, 但柱效减低, 分析时间变长。综合考虑分离度和
迁移行为的变化, 本实验选用 25 ℃柱温较合适。分
离电压是毛细管电泳的一项重要参数, 实验表明, 增
加组份的迁移速度是减少谱带展宽、提高分离效率
的重要途径, 增加电场强度可以达到提高速度的目
的。但高场强度导致通过毛细管的电流增加, 从而增
大焦耳热。在 12 kV 时, 分离选择性最佳。
References:
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·85· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 36 卷第 1 期 2005 年 1 月