全 文 ：·1548· 中革菊Chin凹eTraditionalandHerbalDr gs第38卷翦10期2007年10月
·药材与资源·
PMT和H6H双基因共转化颠茄发根的植株再生
杨春贤‘，周启贵1，陈敏2，彭梅芳1，张婷婷1。张磊3，廖志华”
(1．西南大学生命科学学院天然产物与代谢工程实验室三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆400715
2．西南大学药学院，重庆400715；3．第二军医大学药学院生药学教研室，上海200433)
摘 要：目的获得I，4-丁二胺一氨一甲基转移酶(putrescineN—methyltransferase．PMT)和茛菪碱一6辟羟化酶
(hyoscyamine6p-hydroxylase。H6H)双基因共转化的颠茄发根的再生植株。方法选用P胛和H6H双基因共转
化的东蓖菪碱高产发根单克隆T4．用1／2MS+1．0mg／LNAA固体培养基培养1、5、10d后，转入1／2MS固体培
养基中诱导不定芽和不定根，培养条件均为(25]hI)℃，55szmoI／(m。·s)．12h／d。采用PCR扩增检测再生植株的
尸Ⅳ71、H6H和NPT—I。结果发根在1／2MS+1．0mg／LNAA固体培养基上培养5d后，转入1／2MS固体培养
基上培养，60％的外植体能自发长出不定芽，1／2MS+0．1mg／LIBA固体培养基中诱导生根较1／2MS筒体培养基
强．15d产生的条数平均为9条，形成丁完整的再生植株。PCR检测表明所有再生植株均为颠茄的转基因再生植
株。结论建立了颠茄转化发根再生体系，为实现颠茄托品烷类生物碱的代谢工程及开展分子育种奠定了基础。
关键_i即：颠茄；1，4-丁二胺氮一甲基转移酶；莨菪碱一6}羟化酶；发根；再生
中图分类号：R282．2 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)10—1548—04
PlantletregenerationforhairyootsofAtropabelladonna
byCO—transformedPMTanH6H
YANGChun—xianl，ZHOUQi—guil，CHENMin2，PENGMei—fan91，
ZHANGTing—rin91．ZHANGLei3．LIA0Zhi—hual
(1．LaboratoryofNaturalProductsandMetabolicEngineering。KeyLaboratoryofEco—environmentsinThreeGorges
ReservoirRegion，MinistryofEducation，SchoolofLifeSciences，SouthwestUniver ity，Chongqing400715，China；
2-CollegeotPharmacy，SouthwestUniversity，Cbongqing400715，Chinal3．DepartmentofPharmacognosy，
SchoolofPharmacy，SecondMilitaryMe icalUniversity，Shanghai200433，China)
Abstract：ObjectiveTos ablisharegenerationprotocolforhairyootlinesofAtropabelladonnaby
co—transformedputr scineN—m thyltransferase(PMT)andhyoscyamine6争hydroxylase(H6H)genes．
MethodsTotransferthetransgenichairyootlineofT4tO1／zMSsolidmedium+1．0mg／LNAAand
incubated1，5，and10dat(25．0士1．0)℃withphotoperiod(55^tmol／m2·s)12h／dsoastoindueecal一
1US。thentransferthexplantstOhormone—free1／zMSsolidmediumandincubatedhesameconditions
tOinduceadventitiousbudsandroots，andthenextractDNAfromregenerationplanrletsayessoasto
detect尸Mr，月6Ⅳ，andNP丁一Iaswell．ResultsAf erbeingculturedfor5donl／ZMSsolid
medium+1．0mg／LNAA，thehairyootwastransferredtohormone—free1／2MSsolidmedium，then
adventitiousbudsermergedfrom60％explantandrootedspontaneouslyon1／2MSsolidmedium。butthe
rootingpercentagewasimprovedbetteratthepresenceinl／zMS+0．1mg／LsolidsediumIBAthanthat
in1／2MSsolidmedium．Theaveragetwigswerenineproducedduring15dandthecompleter g neration
plantletsw reformed．PCRdetectiondemonstratedth PMT，H8H，andNPT—Ihadinsertedintothe
genomeoftheregenerationplantletsofA．belladonna．ConclusionTheresultspresentedhereprovidea
protocoloftransgenichairyootregenerationofA．belladonna，whichcouldbehelpfulintropanelkaloids
metabolicengineeringandmolecuarbreeding·
Keywords：Atropabell donnaL．；putrescineN-m thyhransferase(PMT)；hyoseyamine一6}hydro一
收稿日期：20081231
麓；2兽嚣播碧乌罄臻：誓嚣省03甥0a盒)；县A18：，助$理0蓑翳箍焉嬲端霈瓣嚣紫”。删。。，一删。。。t逋讯作看蘑志华T“：(023)68367146Faxt(023)68252365Email：zhliao@jwu哪edcn —
万方数据
中革蒋ChineseTraditionalandHerbalDrup第38卷第10期2007年10月· 549·
xylase(H6H)fhairyoots；regeneration
颠茄AtropabelladonnaL．是一种茄科重要药
用植物，一直作为商业化生产东莨菪碱和蓖菪碱的
主要药源，我国南北部药物种植场有引种栽培。天然
的颠茄中托品烷类生物碱的量很低“]，而且东莨菪
碱的量远远低于茛菪碱。随着需求量不断增加，人们
越来越迫切希望获得高产托品烷类生物碱特别是东
莨菪碱的转基因颠茄。目前托品烷类生物碱的生物
合成途径已较为清楚，1，4一丁二胺一氮一甲基转移酶
(PMT)和莨菪碱一6p羟化酶(H6H)是托品烷类生物
碱生物合成途径中催化关键步骤的限速酶”。]，国内
外有大量关于茛菪烷类生物碱的代谢工程研究的报
道口“]。但至今未见有P^仃、H6双基因共转化
颠茄以及转基因颠茄植株再生的报道。
l材料和方法
1．1材料：PMT和H6H双基因共转化的东莨菪碱
高产的颠茄发根单克隆T4。来源：将“卸甲”根癌农杆
菌AgrobacteriumumefaclensC58C1菌株(含pRi—
A4质粒和携带均以CaMV35S为启动子的来源于烟
草Nicotianat b cumL．的PMT和来源于莨菪
HyoscyamusnigerL．的H6H的植物双价表达载体
pXl(图1)口]，采用叶盘法转化颠茄无菌苗叶片获得发
根口4J，经分子检测和定量筛选出P艇T和H6t-1双
基因共转化的东莨菪碱高产颠茄发根单克隆。
1．z方法：将在无激素的1／2MS培养基(本研究所
LB-左边界RB-右边界35S-Pro-CaMV35S启动于Pro-N08一Nos启动子Non—Ter-Nos终止子
．v用’一I一新霉隶磷酸转移酶基因
LB-leftborderRB-rightborder35S—Pro-CaMV35SpromoterPro—NosNospromoter
Nos—Ter·NosterminalⅣ月一I—neomycinphosphotransferase—I
围1带有PMT和H6H的植物双价表达载体pX!
Fig．1DualexpressionofpXlplasmidw thPMTandH6H
有培养基均附加30g蔗糖和7g琼脂，pH5．8)上 72℃、1．5rain)，72℃、5min；NPT-I(568bp)正
暗培养生长的发根系T4转人1／2Ms十1．0mg／L 向引物为，ⅣP丁一I：5-CCAACGCTATGTCCT—
NAA培养基上诱导愈伤组织，培养时间分A：1d， GATAG一3’，反向引物为州Pr—l：5’一cTGAAT—
B：5d，C：10d3种处理组，每1处理组外植体数均
为lo个，再转入1／2MS培养基中诱导不定芽，20d
继代1次，60d统计丛生芽诱导率和丛生芽个数。
长出芽后将芽切下，转入1／2Ms+0．1mg／LIBA
和1／2Ms培养基中诱导不定根，20d调查不定根的
数量。小苗长至4cm时。切成2片展开叶的节段继
代于1／2Ms培养基中扩大繁殖。用SDS法口3抽提
再生植株的叶片DNA对目标基因PMT和日6H
及筛选标记基因ⅣP丁一I进行PCR检测“]，P肘T
(451bp)正向引物，PMT：5’一GCCATTCCCAT—
GAAcGGCC一3’，反向引物rPMT：5’CCTCcGcC—
GATGATCAAAACC一3’，PCR反应条件为：94℃、
5min，35个循环(94℃、1min，60℃、1rain，72℃、
1．5min)，72℃、5rain；H6H(1．Zkb)正向引物
fH6H：5’一GGATCCCAACGTATAGATTCTTC一
3’，反向引物r日6H：5-CGGGAATTcGGATCc—
CAAACCATCACTGcAAT一3’，PCR反应程序为：
94℃、5min，35个循环(94℃、1min，54℃、1min，
GAACTccAGGAcGAG一37，PcR反应条件为：94
℃预变性5min，然后开始35个循环包括94℃变
性60s，54℃退火60s，72℃反应1．5min，最后于
72℃延伸5rain。
2结果
2．1愈伤组织的诱导及不定芽的分化：将暗培养在
无激素的l／2MS培养基上生长的发根系T4转入
1／2MS+1．0mg／LNAA培养基上，(25±1)℃，55
umol／(m2·S)12h／d培养，c处理组第4天发根开
始变粗、膨大，在发根剪切的伤121处逐渐产生少量疏
松的淡黄色愈伤组织，第10天的发根完全愈伤化，
转入1／2MS培养基后随着培养时间延长，愈伤组织
体积迅速增大，愈伤组织淡黄色、且质地疏松，继代
培养60d后仍未见不定芽的分化。B处理组第4天
出现发根开始变粗，膨大，转入1／2MS培养基后在
发根剪切的伤口处逐渐产生少量较致密的浅黄色愈
伤组织，且愈伤组织仍不断长出少量的发根，最早在
30d愈伤组织上长出淡黄绿色不定芽(图2一B)。
万方数据
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AP^fr和H6H双基困共转化的发根单克隧(i／2MS堵养基)，箭头所币为自发形成少量愈伤组织辟转基因发根诱导的
煎伤组织及芽点，箭头所示为幼芽C一转基因发根诱导的丛生芽口转基因再生植株
Ahairyootlinebyco—transformedP胛andH6Hculturedon11eMSmedium，arrowindicatesthatlittlecalluswas
spvntaneouslyf rmedB-callusandadventitiousbudformationfr m．hairyroots&rrowindicatestenderbuds
C—regenerationshootsfromPMTandH6Hbyco—transformedhairyootlinel、regenerationplantlets
圈2 PMT。H6H双基因共转化的颠茄发根的植株再生
Fig．2RegenerationplantletofhairysrootofA．belladonnabyco—transformedPMTanH6H
45d后长出真叶，丛生芽诱导率达60％，平均不定 产生的少。Subroto等01研究表明，转基因颠茄不定
芽为6个(图2一c)。A处理组第8天观察到部分发芽生根较困难，在MS培养基中添加不同浓度的2，
根形成少量愈伤组织，在培养过程中愈伤组织生长 4一D、NAA等均未成功，可能足使用的工程菌不同
缓慢，发根生长迅速，第45天形成少量不定芽点。丛 所致。再生苗长势良好，小苗长至4～5cm时，将其
生芽诱导率为20％，平均不定芽为2．4个。结果表切成两片展开叶的节段接种于1／2Ms培养基上继
明，发根在1／zMs+1．omg／LNAA培养基上培养 代扩繁。
的时间长短对不定芽的影响极大，培养时间过长，导 2．3再生植株的PCR检测：对目标基因PMT和
至发根完全愈伤化，难以分化出不定芽，而培养时间 Ⅳ6H及筛选标记基因ⅣP丁一I进行PCR检测表
过短则导致发根生长旺盛，不定芽数量偏少。 明，所有再生植株和阳性对照pXI质粒均能扩增出
2．2 生根与扩繁：将幼芽切下转入l／2Ms+了预期的目的片段，非转化的植株不能扩增出对应
0．1mg／LIBA培养基中诱导生根，5～6d后开始长 韵片断，与转基因发根的分子检测结果完全吻合。进
出不定根，15d产生的条数平均为9条，形成了完整 一步证明发根为获得了外源基因的发根，通过诱导
的再生植株。所产生的幼芽在无激素的1／2MS培养愈伤组织，获得的再生植株后外源DNA仍整合在
基中培养8～9d后，也可见从其基部形成不定根， 植物基因组，所有再生植株均为尸M丁和H61-1双
数目明显比1／2MS+IBA0．1mg／L培养基所诱导基因共转化。部分PCR检测结果见图3。
M—DNA分子量标准(100～zooobp)+pXI质粒阳性对照一野生型颓茄阴性对照T一双基目共转化发擞的再生菹株
M—DNAMarker(100—2000hp)+一plasmidpXl埘positivecontrol一一DNAofwildA．kr缸d伽埘a5negativecongroI
T—DNAofregenerationplantofP胛andH6Hbyco—transformedhairyootiineofA．klladonna
围3转基因颠茄再生植株的PMT(451bp)、H6H(1．2kb)、_Ⅳ册一I(568bp)基因的PCR检测
Fig．3PCRAmplifiedDNAbandsofPMr(451bp)，H6H(1-2kb)，andNFr—I(568bp)ofregeneration
plantlettransformedwithpXlplasmid
3讨论
转基因发根在1／2Ms培养基上继代培养过程
中发现，极个别发根单克隆先出现少量愈伤r图2一
A)，将愈伤在光照培养条件下继代培养后长出不定
芽，因此设想通过诱导愈伤组织后在诱导不定芽，从
而获得颠茄转基因再生植株。结果表明，在获得
PⅣ丁、H6H双基因共转化的颠茄东莨菪碱高产发
根系T4的再生植株的适宜条件为：1／2MS+1．0
mg／LNAA培养基培养5d后转入无激素的
l／2MS培养基诱导不定芽和不定根，在附加0．1
mg／LIBA的l／2MS培养基上不定根长势较l／2MS
培养基好，培养条件均为(25土1)℃，55pmo[／(m2
·s)，12h／d。所有在无激素的1／2Ms培养基上能
长出不定芽的外植体均带有愈伤组织和发根，完全
愈伤化的外植体和完全是发根的外植体未长出不定
芽，可能是发根和愈伤组织的内源激素发生变化所
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致，有待对其内源激素水平等进一步研究其机制。本
实验的丛生芽诱导率、每个外植体产生的不定芽数
量均较低，有待进一步优化。同时再生植株的东茛菪
碱、莨菪碱的量及其遗传稳定性等有待研究。基于发
根的转基因颠茄植株再生体系的建立，为利用植物
基因工程技术实现颠茄托品烷类生物碱特别是东莨
菪碱的代谪}工程及开展分子育种奠定了基础。
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茅苍术HMGR基因保守区片段的克隆与分析
刘群1，曹小迎1，蒋继宏“，藏传超2
(1．徐州师范大学江苏省药用植物生物技术重点实验室．江苏徐州 221116
2．南京师范大学生命科学学院．江苏南京210097)
摘要：目的 对茅苍术3一羟基一3一甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy一3一methylglutaryl—CoAreductase，
HMGR)进行基因克隆及序列分析。方法采用cDNA束端快速扩增技术．阻茅苍术撤叶总RNA的cDNA为模板
扩增茅苍术HMGR基因的保守区片断。结果序列分析表明，所克隆的cDNA保守区序列长度为458bp，而且同
时得到了两个核苷酸序列的同源性为84．28％的片段，相应的氨基酸序列的同源性为9z．11％。分别命名为HM．
G风rl，H卅Rcr2。推断这可能是该基因家族中的两个成员。而且同源序列比对发现．推断的H肘G＆r1氨基酸序
列和HMGRcr2氨基酸序列与其他植物都有鞍高的同源性。结论首次分离并报道了茅苍术HMGRcDNA克隆。
为进一步研究萜类生物合成机制及其在提高植物药用价值方面提供理论依据。
关毽词：茅苍术，3一羟基一3一甲基戊二酰辅酶A还原酶；基因克隆
牢固分类号：R282．I 文献标_i}}码：A 文章编号：0253—2670(2007)10—1551—04
Cloninga danalysisofHMGRgeneconservedfragmentsi A ractylodeslancea
LlUQunl．CAOXiao—yin91，JIANGJi—hon91，DAIChuan—cha02，
(1．KeyLaboratoryofBioteehno[ogyforMedicinalPl nt，XuzhonNormal．University。Xuzhou221t16，Chinal
2．Collegeo{Life．SciencestNa jingNormalUniversity，Nanjing210097，China)
Abstract：ObjectiveTocloneandsequenceeDNAencoding3-hydroxy一3一methylglutaryl·coenzymeA
reductase(HMGR)fromAtractylodesla月fPⅡ．MethodsThecDNA，encodingH肘GRinA．1ancea，was
amplifiedbyRACEstrategywiththecDNAofthetotalRNAofyoungleavesasthetemplate．Thepartial
fragmentsofHMGRwereclonedandsequenced．ResultsTheanalysisresultsrevealedthattheconserved
fragmentswere458bp．Atthesametime，thewofragmentshadbeenobtained84．28％identificationin
nucleotideaciand92．1％identificationncorrespondingaminoacid，namedsHMGRcrlandHMGR—
cr2，respectively．ItwasdeducedhatheymaybemembersoftheHMGRgenefamilyinA．1aneea．Se一
鉴銎最曹：茬亲；笔篇植物重点宴骑宅开放课题赞助(。2AxL，：)
尊嘉景靠挚害蓥鎏84T—ehl,女(05’扛16苏)83宿40丘3人515’硕E上．m研a究iL：生jhj’i主an要g@从x事znu药．用edu植．c物n生物技术的研究工作
万方数据
PMT和H6H双基因共转化颠茄发根的植株再生
作者： 杨春贤， 周启贵， 陈敏， 彭梅芳， 张婷婷， 张磊， 廖志华， YANG Chun-xian，
ZHOU Qi-gui， CHEN Min， PENG Mei-fang， ZHANG Ting-ting， ZHANG Lei， LIAO Zhi-
hua
作者单位： 杨春贤,周启贵,彭梅芳,张婷婷,廖志华,YANG Chun-xian,ZHOU Qi-gui,PENG Mei-
fang,ZHANG Ting-ting,LIAO Zhi-hua(西南大学生命科学学院,天然产物与代谢工程实验室
,三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆,400715)， 陈敏,CHEN Min(西南大学药学院,重
庆,400715)， 张磊,ZHANG Lei(第二军医大学药学院,生药学教研室,上海,200433)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(10)
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