全 文 ：中革焉ChineseTraditionalandHerhalDrugs第39卷第11期2008年11月· 637·
制剂与质量
内生镰刀菌漆酶辅助提取槐米中总黄酮的研究
许云峰，，张臻2，周建芹-，陈晶磊·，王剑文-。
(1．苏州大学药学院，江苏苏州215123；2．南京大学生命科学院，江苏南京210093)
摘要：目的研究内生真菌胞外漆酶在槐米总黄酮提取中的应用。方法内生镰刀菌在起始pH7．0的综合马铃
薯培养基中，20℃下摇瓶培养6d，具有较高的漆酶活力(36．1U／mL)。槐米干粉投入真菌发酵液中进行酶解处理，
比较酶料比、酶解温度、酶解时间和酶解液pH值对槐米总黄酮提取率的影响。结果槐米干粉以酶料比40：1加入
粗酶液中，在pH7．0、20℃下酶解处理1h后，总黄酮提取率可达11．4％．比常规提取法提高了28．7％。结论内生
菌漆酶辅助提取法为槐米总黄酮提取的可行新方法。
关键词：槐米；内生镰刀菌；漆酶}总黄酮；辅助提取
中图分类号：R284．2；R286．02文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)11—1637一04
Totalf avonoidextractedfromSopharajaponicabudswithassistantoflaccase
fromendophyticF比sariumsp．C一8
XUYun—fen91，ZHANGZhen2，ZHOUJian—qinl，CHENJing—leil，WANGJian—wenl
(1．SchoolofPharmaceuticalSc ences，SoochowUniversity，Suzhou215123，ChinaI2．SchoolfLifeSciences，
NanjingU iversity，Nanjing210093，China)
Abstract：ObjectiveTostudythapplicationofextracellularacc sef omendophyticfungitototal
flavonoidextraction．MethodsThextracellularacc sevitalityofanendophyticFusariumsp．C一8from
Artemisaannuareached36．1U／mLwhenthefunguswascultivatedinr visedPDAmediumwithinitial
pH7．0at20℃onarotaryshakerincubatorfor6d．Thecrudelaccasefromtheculturalmediumwas
appliedforextractionofflavonoidfromthebudsofSopharajaponica．Theoptimizationonheratioofdry
budstocrudeenzymeliquid，temperature，time，andpHvaluewascarriedoutduringtheprocessof
laccase—assistanttreatment．ResultsAfterincubationw th40：1ofcrudeenzyme(pH7．O)at20℃to
drybudsfor1 h，the
inregularextraction
extractionrateftotalftavonoidswas11．4％，amoreincreaseof28．7％thanthat
pr cess．ConclusionTheresultspresenta practicalmethodoflaccase—assistant
totalf avonesinS．japonicabuds．
budsofSopharajaponicaL．；endophyticFusariumsp．C一8}laccase；total
sistantex raction
extractionprocesson
Keywords：the
flavonoids；enzyme—as
槐米是豆科植物槐SophorajaponicaL．的干燥
花蕾，在中医临床上作为止血药，治疗痔疮、子宫出
血，并有清肝泻火、治疗肝热目赤的功效。槐米中含
有以芦丁为代表的黄酮类化合物。但是槐米中黄酮
类物质难溶于水。植物内生菌是指那些在其生活史
的一定阶段或全部阶段生活于健康植物各种组织和
器官内部或细胞间隙的真菌或细菌，它们在与植物
长期共存和进化过程中建立了一种共生关系。生活
在植物内部的内生真菌具有降解一部分植物木质素
和纤维素的能力，具有较高的果胶酶、木聚糖酶、纤
维素酶和多酚氧化酶活性[1’2]，单头孢霉属内生真
菌具有较高的漆酶活性[3]。漆酶是一种含铜的多酚
氧化酶，是最主要的3种木质素降解酶之一，可以有
效的降解木质素，增进植物中有效成分的释放，提高
提取率。目前少见将漆酶等木质素降解酶应用于中
药成分提取的报道。为进一步挖掘内生真菌的胞外
酶活性以及在中药生物技术中的潜在应用，本实验
以槐米总黄酮为目标，利用产漆酶的内生镰刀菌粗
提液处理槐米，并优化槐米总黄酮提取的酶法辅助
提取工艺。
收稿日期：2008—02—19
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30772731)I江苏省自然科学基金资助项目(BK2007051)，苏州大学青年教师研究基金资助项目
(Q3132625)
作者简介：许云峰(1983一)，男，江苏盐城人。硕士研究生．研究方向为中药生物技术。Tel；13646210745E—mail：yfxu83@yahoo．corn．cn
-通讯作者王剑文Tel：(0512)65880025E—mail：jwwang@suda．edu．cII
万方数据
·1638· 中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrags第39卷第11期2008年11月
1仪器及材料
22PC型可见光分光光度计(上海棱光技术有限
公司)，电子分析天平(Starorious)，PYX—DHS一
40X50—S—II型隔水式电热恒温培养箱(上海跃进
医疗器材厂)，HZQ—X100型恒温振荡培养箱(江
苏太仓市实验设备厂)，高速冷冻离心机(Beckman
Allegra64R)。
槐米购自四川省中药材公司，经苏州大学药学
院刘春宇教授鉴定为豆科植物槐S．japonicaL．的
干燥花蕾。芦丁(供定量测定用，批号0080—9705，中
国药品生物制品检定所)，邻联甲苯胺、NaNO。、
AI(N03)3、Na0H等均为分析纯。
2方法与结果
2．1 内生菌培养及漆酶活性筛选：在加入0．2％没
食子酸的PDA培养基(马铃薯20％，葡萄糖2％，琼
脂1％，pH值自然)上接种待测真菌[“，28℃避光培
养5d，平板上有脱色圈者表明有漆酶产生。将产酶
菌株挑出，接种于马铃薯液体培养基(马铃薯20％，
葡萄糖2％，KH2PO．0．3％，MgSO。0．15％，维生素B1
10mg／L，酵母膏0．5％)[5]，振荡培养5d后，测定漆
酶酶活力。酶活力以样品与邻联甲苯胺反应5min
后吸光度的改变值表示，以每分钟吸光度增加0．01
为一个酶活力单位(U／mL)E副。
通过没食子酸PDA平板初筛发现内生镰刀菌
具有分解没食子酸的能力。该菌分离自黄花蒿
ArtemisiaannuaL．茎韧皮部，菌种保藏在苏州大学
药学院真菌资源与菌种保藏室。将筛选出的产酶菌
株接种于PDA平板上活化，25℃培养5d后接种于
综合马铃薯培养基中，装液量为每个500mL摇瓶装
液300mL，接种量为5％，摇床转速为150r／min。在
不同温度(10～60℃)和pH值(pH4～9)条件下发
酵培养o～12d，以筛选菌株的最佳产酶培养条件。
内生镰刀菌的生长曲线见图1。可见发酵至第6天，
真菌生长转入生长中后期，此时漆酶酶活力达到最
高，为36．1U／mL。
经比较，培养基pH7．0，培养温度为20℃时，内
生菌胞外漆酶活性较高，见图2。内生镰刀菌发酵液
以5000r／min离心10min，上清液为漆酶粗提液，
测定酶活后一80℃保存，使用前测定酶活力。
2．2槐米总黄酮的测定
2．2．1溶液的制备：精密称取120℃干燥恒重的芦
丁对照品10．0mg，置于20mL量瓶中，加入70％乙
醇使其溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为芦丁对照品
t／d
田1 内生镰刀曹的曹丝生物■和胞外漆酶酶活力
Fig．1Myceliab omassndextracellularacc se
vitalityofendophyticFusariumsp．C一8
—30
■
皇
当20
R
蜒10
溢
O
f、
●
昌
巳＼
．R
烬
溢
O 10 20 30 40 50 60
温度／℃
圈2培养温度(A)和培养基pH值(B)对内生镰刀菌
胞外漆酶酶活力的影响
Fig．2Effectofculturetemperature(A)andpH
valueofmedium(B)oniaccasevitality
ofendophyticFusarium叩．C-8
溶液。槐米烘干磨碎，过60目筛，称取50g，以酶料比
40：1加入粗酶液，摇匀后30℃水浴2h，再加入60
倍量蒸馏水后室温放置24h，4500r／min离心并吸
取上清液5mL，置于25mL量瓶中，加入70％乙醇
稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
2．2．2标准曲线的制备：分别精密吸取0．5
mg／mL芦丁对照品溶液0、0．5、1．0、2．0、3．0、4．0、
5．0mL于10mL量瓶中，用70％乙醇稀释至5．0
mL。分别加入5％NaN020．3mL，摇匀，静置6min。
加10％AI(N03)30．3mL，摇匀，静置6min，再加4％
Na0H4．0mL，用70％乙醇稀释至刻度，摇匀，静置
12min，于510nm处测定吸光度(A)值[引。以A为纵
坐标，质量浓度(C)为横坐标进行回归，得方程4=
0．8796C+0．0343(r=0．9995)。
2．2．3样品的测定：取上述制备样品5mL，按标准
万方数据
中草喃ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月· 639·
曲线的制备项下方法于510nm处测定A值，根据方
程得样品中总黄酮的量，计算槐米中总黄酮提取率
(总黄酮提取率=提取液中总黄酮的质量／槐米的质
量X100％)。
2．3酶法辅助提取试验
2．3．1单因素试验：使用内生镰刀菌漆酶粗提液
(酶料比10：1～50：1)处理槐米，在pH值为7．0，酶
解2h后，总黄酮提取率提高了13．8％～65．4％，
粗酶提取的最佳温度为20℃，最佳酶料比为40：1，
见图3。漆酶处理时，处理液pH值和处理时间单一因
素变化对总黄酮提取率影响不显著。
术
静
盛
掣
冰
瓣
釜
掣
温度／℃
爵科比／(mL。g-。)
图3 内生菌漆酶处理温度(A)和酶料比(B)对总黄酮
提取率的影响
Fig．3Effectsof reatmentt mperature(A)and
amountofcrudelaccasefromendophytie
Fusarfumsp．C-8(B)ontotalf avones
extractionrate
2．3．2正交试验：准确称取槐米干粉，每份50g，在
使用漆酶粗提液处理槐米时，选择不同的处理时间、
温度、pH值和酶料比(发酵液量／投料量)，分别研
究各提取条件对总黄酮提取率的影响。根据单因素
的试验结果，选取L。(3‘)正交表进行正交试验，结果
见表1，并进行极差分析以确定最佳处理条件。方差
分析见表2，当考虑因素间的相互作用时，酶解温度
对总黄酮提取率的影响程度较显著，其他因素影响
不显著。结合单因素试验结果，酶法提取槐米总黄酮
的最佳工艺条件为A，B：C。D。：即酶解温度20℃、pH
值7．0、酶料比40：1、酶解时间1h。
衰1正交试验结果
Table1 Resultoforthogonaltest
寰2方差分析
Table2 Analysisofvariance
F0．05(Z，2)=19t0．01(ZtZ)=99
2．4验证试验：以总黄酮提取率为指标，精确称取
等量(50g)的槐米干粉，采用试验确定的最佳工艺
条件提取，即以酶料比40：1加入槐米干粉中，在pH
7．0、温度20℃下，酶解处理1h，按该工艺优化条件
进行重复试验3次，总黄酮平均提取率可达11．4％，
与常规水提法相比提取率提高了28．7％。
3讨论
能够分泌漆酶的真菌主要集中于担子菌亚门、
子囊菌亚门及半知菌亚门等高等真菌，其中担子菌
亚门的白腐真菌是产漆酶活性较高的生产菌[8]，镰
刀菌属的一些类群产漆酶的能力也较强[9]。笔者已
从黄花蒿中分离到72株内生真菌，一些内生真菌具
有较强的抗菌和青蒿素调节等生物活性[1叫。黄花蒿
内生镰刀菌的漆酶活性部分反映了内生菌具有在宿
主植物内部侵染和共生的能力。
应用活性酶协同常规法进行中药有效成分提取
的相关报道目前已引起重视[1h12]，但此类研究中大
多使用的是纯酶，成本较高，易受中药成分或其他环
境因素的影响。应用内生菌发酵粗酶液提取中药材
有效成分的方法还未见报道，本实验采用内生镰刀
菌的漆酶发酵液作用于槐米总黄酮的提取，并优化
万方数据
·1640· 中革1IsChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月
出酶法提取的最佳条件：以酶料比40：1加入槐米
干粉中，在pH7．0、温度20℃下，酶解处理1h后，总
黄酮提取率可达11．4％，比常规提取率增加了
28．7％。使用微生物粗酶辅助法是中药材提取的新
方法，值得进一步探讨和进行工艺优化。
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苦瓜籽MAP30的聚乙二醇化学修饰条件优化及纯化研究
张永明，刘盛邦，黄 凯，聂 宇，孟延发。
(四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川成都 610064)
摘要：目的探讨聚乙二醇修饰苦瓜籽核糖体失活蛋白(MAP30)的反应条件以及修饰产物的纯化方法。方法
在不同条件下，将聚乙二醇活性酯(mPEG)z-NHS与MAP30反应，用SDS—PAGE分析不同反应条件对产物成分的
影响；采用SephacrylS一300HR分子筛柱色谱法对修饰产物进行分离纯化，TNBS法测定目标产物PEG—MAP30的
氨基修饰度。结果 聚乙二醇修饰MAP30的最优反应条件为4℃，pH8．5硼酸硼砂缓冲液，MAP30质量浓度
lmg／mL，MAP30与(mPEG)z-NHS质量比1：10为最佳修饰条件，5min内反应完全；反应产物进一步纯化，经
SDS-PAGE检测目标产物PEG-MAP30中不含未修饰的MAP30；TNBS法测定MAP30的氨基修饰度为44．9％。结
论初步确定了聚乙二醇修饰MAP30的反应条件和修饰产物的纯化方法。
关键词：苦瓜籽；核糖体失活蛋白(MAP30)}聚乙二醇；化学修饰
中图分类号：R284．2}R286．02文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)11一1640—04
ModificationconditionsoptimizationandpurificationofPEGylatedMAP30
fromSemenMomordicaeCharantiae
ZHANGYong—ming，LIUSheng—bang，HUANGKai，NIEYu，MENGYan—fa
(KeyLaboratoryofBio—resourcesandE o—environment，MinistryofEducation，CollegeofLifeScience。
SichuanUniversity．Chengdu610064，China) ．
Abstract：ObjectiveToexploreconditionsforthemodificationofMAP30fromSemenMomordica
Charantiaewithpolyethyleneg ycol(PEG)andthemethodforthepurificationofPEG—MAP30．Methods
ToanalyzethinfluenceofvariousconditionsonthecomponentsofPEG—MAP30bySDS—PAGE，purify
PEG—MAP30bySephacrylS一300HRmolecularsievecolumnchromatography。anddetectthemodification
rateofaminobyTNBSundertheoptimalreactionconditionwiththereactionof(mPEG)2一NHSand
MAP30．ResultsTemperature4℃，boricacid—boraxbufferwithpH8．5，concentrationofMAP30
1mg／mL，themassratioofMAP30tO(mPEG)2一NHS(1：10)，and，5minforreactiontimewere
selectedastheoptimalreactionco dition．Molecularsievecolumnshowedagoodpurificationeffect．The
基金项目：国家自然科学基金资助项目(C01020404)
作者简介：塑永明(1982--)，男，河奄新乡人．硕士研究生，2005年毕业于河南师范大学生命科学学院，研究方向为蛋白质工程与酶工
程。E—mail：dongxlel10@tom．corn
*通讯作者盂延发E．mail：yfmeng：@163．net
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万方数据
内生镰刀菌漆酶辅助提取槐米中总黄酮的研究
作者： 许云峰， 张臻， 周建芹， 陈晶磊， 王剑文， XU Yun-feng， ZHANG Zhen， ZHOU Jian-
qin， CHEN Jinglei， WANG Jian-wen
作者单位： 许云峰,周建芹,陈晶磊,王剑文,XU Yun-feng,ZHOU Jian-qin,CHEN Jinglei,WANG Jian-
wen(苏州大学药学院,江苏,苏州,215123)， 张臻,ZHANG Zhen(南京大学生命科学院,江苏
,南京,210093)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(11)
被引用次数： 5次

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2.陈今朝.王剑锋.李江.饶军.秦家顺 煤附生真菌产漆酶菌株的分离鉴定及产酶特性研究[期刊论文]-菌物学报
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3.赵一璐.许云峰.周建芹.陈韶华.王剑文 内生青霉菌纤维素酶在银杏总黄酮提取中的应用研究[期刊论文]-中国实
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5.靳蓉.张飞龙 漆酶的应用技术[期刊论文]-中国生漆 2013(2)


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