全 文 ：中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第11期2006年11月·1707·
药材与资源
灵芝液体发酵产漆酶最佳培养基和培养条件研究
许 颖，兰 进。
(中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京 100094)
摘 要：目的 研究灵芝液体发酵产漆酶的最佳培养基和培养条件。方法 以灵芝S。号菌株为试验材料，以灵芝
漆酶活性为衡量指标，通过正交试验分别对灵芝液体发酵培养基及培养条件进行优化筛选。结果 筛出最佳培养
基组成为葡萄糖30g／L、棉花0．2％、磷酸氢二铵0．66g／L、干酪素0．5％、聚山梨酯一800．15％；优化培养条件为初
始pH5．5、装液量75mL、接种量12．5％、菌龄5×24h、培养时间9×24h。结论 优化培养基及培养条件后，发酵
液中灵芝漆酶活性显著提高。
关键词：灵芝；漆酶；培养基；培养条件
中图分类号：R282．15 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)11—170．7—04
Optimumculturemediaandliquidconditionsinshakingflasksforlaccase
productionbyGa odermalucidum
XUYing，LANJin
(InstituteofMedicinalPl ntDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnion
MedicalCo lege，Beijing100094，China)
Abstract：ObjectiveTostudythoptimumculturemediaandliquidconditionsinshakingflasksfor
laecaseproductionbyGa odermalucidum．MethodsTakingS3 tainofG．1ucidumastestmaterialsand
laccasectivityofG．1ucidumasmeasurementindextOoptimizetheculturemediaandliquidconditions
throughorthogonaltest．ResultsTheoptimumculturecomponentsofmediawere：Glucose30g／L，cot—
ton0．2％，(NH4)2HP04O．66g／L，casein0．5％，Tween一800．15mI。；theoptimumconditionswere：ini—
tialpHvalueofmediumwas5．5，75mLmediumwasin250mL—flask，inoculationwas12．5％，mycelium
agewas5×24h for9×24h culture．ConclusionLaceasectivityofG．1ucidumhasbeenimproved
remarkablyintheoptimumculturemediaandliquidconditions．
Keywords：Ganodermalucidum(Leyss．exFr．)Karst；laccase；culturemedia；c lturecondition
漆酶(benzenediol：oxygenoxidoreductase)是
一种含铜的多酚氧化酶，与抗坏血酸氧化酶和哺乳
动物血浆铜蓝蛋白同源，都属于蓝色多铜氧化酶家
族[1]。1883年日本学者吉田(Yoshida)[23首次从日
本紫胶漆树RhusvernicifluaStokes漆液中发现一
种可催化漆固化过程的蛋白质，1894年Bertrand将
这种蛋白质命名为漆酶(1accase)。漆酶在自然界中
分布于多种植物、真菌、少数昆虫和细菌中。分泌漆
酶的真菌主要集中于担子菌亚门
(Basidiomyeotina)、子囊菌亚f-I(Asomycotina)及半
知菌亚门(Deuteromycotina)等高等真菌，其中最主
要的是担子菌亚门的白腐真菌口]。漆酶研究已有一
百多年的历史，是人类研究最早的酶之一，但人们对
这种酶的认识还很不完整。随着漆酶功能逐渐被发
现，有关漆酶的研究已备受关注[4]。目前，漆酶的研
究内容涉及微生物学、生物化学、酶学、分子生物学、
遗传学等多个领域，包括菌株生长特征、漆酶的合成
调控，酶蛋白的分离纯化，晶体结构和催化机制研
究，相应基因的克隆、测序及异源表达等[5]。灵芝由
于其广泛的药用价值和保健作用受到人们的青睐，
资料表明漆酶参与灵芝菌丝体及子实体的生长和发
育过程。目前，对灵芝漆酶的研究相关报道较少，本
收稿日期：2006—02—15
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30271587)；卫生部资助项目
作者简介：许颖(1982一)，女，江苏省盐城市人，在读硕士研究生，从事灵芝生理生化研究工作。
*通讯作者兰进Tel：(010)62899723E—mail：lanjin60@hotmail．con3
万方数据
·1708· 中草喃 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第11期2006年11月
实验运用正交试验法对灵芝产漆酶的培养基和培养
条件进行了优化筛选，为深入研究漆酶在灵芝生长
发育过程中的生理生化作用奠定基础。
1材料与方法
1．1供试菌株：实验用神州一号宇宙飞船搭载的灵
芝S。号菌株，由中国医学科学院中国协和医科大学
药用植物研究所生物发酵实验室提供。
1．2培养基
1．2．1斜面培养基(1L)：麦麸50g，葡萄糖20g，
KH2P043g，MgS04·7H201．5g，VBl10mg，琼脂
18g，初始pH5．5，121℃灭菌30min。平肛培养基
和液体发酵培养基的灭菌条件与此相同。
1．2．2平皿培养基(1L)：配方同斜面培养基。
1．2．3筛选和产酶基础培养基(1L)：麦麸25g，葡
萄糖10g，KH2PO。2g，MgSO。·7H200．5g，
CaCl。·2H：O0．1g，琥珀酸1．8g，酒石酸铵1．84
g，VB，10mg，聚山梨酯一800．05％，微量元素溶液
70mL，初始pH5．5。
微量元素溶液组成(1I。)：MgSO。·7H203．0
g，MnS04·H200．5g，NaCl1．0g，FeS04·7H20
0．1g，CaCl20．1g，ZnS04·7H200．1g，CuS04·
7H200．1g，KAl(S04)2·12H2010mg， 38031
mg，Na2Mn04·2H2010mg。
1．2．4液体发酵培养基(1L)：用不同的碳源和氮
源组合替代筛选和产酶基础培养基中的葡萄糖和酒
石酸铵，以发酵液中漆酶的活性为衡量指标对培养
基进行优化实验。
1．3培养方法
1．3．1斜面菌种培养：在无菌条件下，接种斜面培
养基，25‘C避光培养7×24h，置于4℃保存，备用。
1．3．2平皿培养：在无菌条件下，用斜面培养所得
菌种接种平皿培养基，25‘C避光培养7×24h，置于
41C保存，备用。
1．3．3液体发酵培养条件：250mL摇瓶装100mL
液体发酵培养基，初始pH5．5，在无菌条件下用打
孔器定量取平皿培养基的菌丝块接种至摇瓶，置于
28℃旋转式摇床、160r／rain避光培养7×24h。所
有试验均重复3次。
1．4不同培养基组合对灵芝漆酶活性的影响：对不
同碳源和氮源组合进行L。。(54)正交试验，正交表设
计见表1。试验以筛选和产酶基础培养基作为对照。
发酵液稀释100倍测灵芝漆酶活性。分别测定不同
培养基组合对灵芝S。产漆酶活性的影响(试验均为
质量浓度)。
表1培养基组合正交试验的因素与水平
Table1 Factorsandlevelsofculturemedia
combinationoforthogonaltest
1．5不同培养基配比对灵芝漆酶活性的影响：对
1．4项中筛选出的较优组合进行配比优化实验，对
碳、氮源的不同配比组合进行L。。(55)正交试验，其
中，葡萄糖和磷酸氢二铵的量是按照所含碳、氮元素
的摩尔浓度进行确定的。发酵液稀释300倍测灵芝
漆酶活性。分别测定不同培养基配比对灵芝S。产漆
酶活性的影响。见表2(棉花和干酪素质量浓度，聚
山梨酯一80为体积浓度)。
表2培养基配比组合正交设计
Table2 Orthogonaldesignofmatching
combinationinculturemedia
O．1
O．2
O．3
0．4
O．5
O．1
O．2
O．3
0．4
O．5
0
O．05
0．10
O．15
0．20
1．6培养条件优化试验：在优化培养基前提下，进
一步进行培养条件的优化试验，分别对不同的初始
pH值、装液量、接种量、菌龄和培养时间进行L。。
(55)正交试验。发酵液稀释500倍测灵芝漆酶活性。
分别测定不同培养条件对灵芝S。产漆酶活性的影
响。见表3。
表3培养条件正交设计
Table3 Orthogonaldesignofculturecondition
1．7 漆酶活性测定方法：漆酶可催化ABTS[-2，27一
azinobis一(3-ethylbenzthiazoline一6一sulphonate)]发
生氧化，生成的氧化型ABTS在420nm处有还原
万方数据
中革喃 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第11期2006年11月·1709·
型ABTS所没有的强吸收峰，所以可通过检测420
nm处的吸光度的增加来测定漆酶的活性。
酶活性测定方法：3mL酶活反应体系中，0．2
mL3mmol／L的ABTS，1．8mL0．1mol／L醋酸一
醋酸钠(pH4．5)缓冲液和1mL稀释酶液。先将缓
冲液和底物ABTS混匀，再加入酶液启动反应，25
℃反应5min后，于420nm测定吸光度。以灭活酶
液的相同处理作为对照。酶活定义：1个酶活力单位
(U)是指在一定条件下，反应体系中每分钟催化1
ttmolABTS氧化所需的酶量。
2 结果
2．1 不同培养基组合对灵芝漆酶活性的影响：碳源
和氮源是影响灵芝菌丝生长的重要因子，以筛选和
产酶基础培养基为基础，分别以小分子碳源：葡萄
糖、蔗糖、麦芽糖、甘油；高分子碳源：甲基纤维素、淀
粉、麦麸、棉花；无机氮源：硫酸铵、磷酸氢二铵、硝酸
铵、酒石酸铵；有机氮源：酵母浸粉、蛋白胨、干酪素、
大豆粉的不同组合取代相应的碳源和氮源，测定不
同培养基组合对灵芝漆酶活性的影响。比较极差，确
定各因子对结果的影响，极差由大到小依次为：有机
氮源>高分子碳源>小分子碳源>无机氮源，有机
氮源是影响灵芝漆酶活性的关键因子，其他3种都
有一定的影响。见表4。方差分析表明，有机氮源对
灵芝漆酶活性的影响显著高于其他因子。
表4培养基组合正交试验方差分析
Table4 Varianceanalysisoforthogonaltest
oncombinationofculturemedia
水平选优与组合选优：根据各试验因子的总计
数或平均值可以看出：A取A。，B取B。，C取C。，D
取D。，即漆酶活性最高的培养基组合为：
A：B。C。D。——葡萄糖、棉花、磷酸氢二铵、干酪素。
该组合不在正交试验的25个组合之中，因此对该组
合进行补充试验。结果表明，筛选培养基组合是灵芝
漆酶活性最高的培养基组合。
将筛选培养基A。B。C。D。组合与筛选和产酶基础
培养基进行比较，见图1。筛选培养基组合液体发酵液
中漆酶活性是筛选和产酶基础培养基的14．23倍。
2．2不同培养基配比对灵芝漆酶活性的影响：对不
同培养基组合实验得到的筛选培养基组合进行不同
：卜45
—40
H35
堇：30，
划20
烬15
髓10
j|鲢5
褒5培养基配比组合正交试验方差分析
Table5 Varianceanalysisoforthogonalteston
matchingcombinationofculturemedia
对正交试验结果进行极差与方差分析，结果表
明：干酪素极差最大，是在液体发酵培养过程中灵芝
漆酶活性的主要影响因素，其他依次为葡萄糖、聚山
梨酯一80、棉花和磷酸氢二铵。磷酸氢二铵的变化对
灵芝漆酶活性的影响最小。
水平选优与组合选优的各试验因子的总计数或
平均值可以看出：A取A。，B取B。，C取C，，D取
D。，E取E。即漆酶活性最高的培养基组合为：
A。B。C。D5E4——葡萄糖30．0g／L、棉花o．2％、磷酸
氢二铵o．66g／L、干酪素0．5％、聚山梨酯一80
0．15％，是正交试验所有组合中活性最高者。
将筛选培养基A。B。C，D。E。组合分别与未经筛
选时的培养基、筛选和产酶基础培养基进行比较，如
图2所示。经筛选后培养基液体发酵液中漆酶活性
是筛选前培养基的1．86倍，是筛选和产酶基础培养
基的25．72倍。
2．3 不同培养条件对灵芝漆酶活性的影响：通过实验
已得到了以灵芝漆酶活性为衡量指标的优化培养基，
在此培养基的基础上进一步对培养条件进行优化筛选
实验。培养条件的优化试验仍是选用正交试验的方法。
从表6中可见菌龄极差最大，是在液体发酵培
养过程中灵芝漆酶活性的主要影响因素，其他依次
为初始pH值、培养时间、接种量和装液量。后3个
万方数据
·1710· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第11期2006年11月
因素的变化对灵芝漆酶活性的影响均较小，其中装
液量的影响可以忽略不计。
?
J
●
o
目
5
、～
划
烘
髓
鹾
制
『嚓
养基
图2培养基配比优化前后发酵液中灵芝漆酶活性比较
Fig．2ComparisonoflaccasectivityofG．
1ucidumbeforeandafteroptimum
culturemediummatching
表6培养条件正交试验方麓分析
Table6 Varianceanalysisoforthogonaltest
onculturecondition
水平选优与组合选优的结果表明：A取A。，B
取B。，C取C。，D取D。，E取E。，即漆酶活性最高的
培养基组合为：A。B：C。D、E。一初始pH5．5、装液量
75ml一接种量12．5％、菌龄5X24h、培养时间9×
24h，是正交试验所试组合中活性最高者。
将最终的优化组合A。B。C。D，E。分别与经配比
优化后的培养基、经培养基组合优化后的培养基以
及筛选和产酶基础培养基进行比较，见图3。优化条
件下培养基液体发酵液中漆酶活性是经配比优化后
培养基的2．12倍，是经培养基组合优化后培养基的
3．76倍，是筛选和产酶基础培养基的49．26倍。
3讨论
灵芝的液体深层发酵培养基及培养条件经优化
后，发酵液中灵芝漆酶的活性显著提高。灵芝产漆酶
的优化培养基为：葡萄糖33．0g／L、棉花0．2％、磷
酸氢二铵0．66g／I．、干酪素0．5％、聚山梨酯一80
0．15％。在未优化培养条件下，优化培养基发酵液中
漆酶活性是筛选和产酶基础培养基的25．72倍。在
优化培养基的基础上进行培养条件的优化试验，得
出最佳培养条件为：初始pH5．5、装液量75rnL、接
种量12．5％、菌龄5×24h、培养时间9×24h。在优
化培养基和优化培养条件下，液体发酵液中的灵芝
漆酶活性是筛选和产酶基础培养基的49．26倍。
宁
J
●
名
目
5
＼
划
烘
撩
磺
制
联
140
120
100
∞培养条件+配比+组合筛选培养基
蕊配比+组合筛选培养基
豹组合筛选培养基
门基础培养基
图3培养条件优化前后发酵液中灵芝漆酶活性比较
Fig．3ComparisonoflaccasectivityofG．
1uciduminliquidbeforeandafter
optimumcultureconditions
多数研究采用单因子试验的方法对最适培养基
和培养条件进行筛选。通过单因子试验可分析比较
不同因子的影响，但不能确定这些因子不同水平的
组合中哪个是最好的，同时，用正交试验的方法具有
准确、高效的特点，因此本试验中对灵芝菌种的最适
培养基和培养条件的筛选均采用正交试验法。
菌丝体生长过程中，碳、氮源的利用是首先利用
小分子有机碳源和无机氮源，其次是高分子有机碳
源和有机氮源。大多文献中的碳、氮源筛选都选择单
因子试验，从而得到一种最适的碳源或氮源。本研究
中将碳源中的小分子有机碳源与高分子有机碳源相
区分，将氮源中的无机氮源与有机氮源相区分，分别
作为影响因素进行试验，既考虑到单个碳源或氮源
的影响，又考虑到小分子有机碳源和高分子有机碳
源、无机氮源和有机氮源之间不同组合的影响，可使
得到的优化培养基营养更为均衡，更有利于菌种的
生长。将得到的最适培养基组合与基础培养基相比
较，前者的氮源的量远小于后者，可见，氮源的相对
限制可能利于灵芝漆酶的分泌。
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∞
∞
们
加
0
万方数据
灵芝液体发酵产漆酶最佳培养基和培养条件研究
作者： 许颖， 兰进， XU Ying， LAN Jin
作者单位： 中国医学科学院,中国协和医科大学药用植物研究所,北京,100094
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(11)
被引用次数： 2次

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