全 文 ：中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第7期2007年7月·999·
制剂与质量
液氮快速冷冻对地龙中水溶性蛋白组成和活性的影响
王厚伟
(山东中医药大学药学院，山东济南250014)
摘要：目的探讨低温炮制工艺对地龙水溶性蛋白质组成以及溶栓与抗肿瘤活性的影响。方法地龙的炮制采
用传统与低温两种工艺，低温炮制采用液氮快速冷冻与冷冻干燥技术；采用SDS—PAGE与ImageTool软件，对两
种炮制工艺的地龙蛋白质组成的差异进行定性与定量分析；应用纤维蛋白平板法与体外溶栓试验，定性与定量分
析两种炮制工艺的纤溶活性的差异；应用显微观察与MTT法，对两种炮制工艺体外抑制人肝癌细胞增殖活性进行
定性与定量比较分析。结果低温炮制工艺地龙的水溶性蛋白组成比传统炮制工艺丰富，SDS—PAGE的蛋白条带
数与浓度明显高于传统工艺；两种炮制工艺的地龙蛋白液均具有显著的抗人肝癌细胞与纤溶活性，但低温炮制工
艺的两种活性显著高于传统工艺。结论不同炮制工艺对地龙水溶性蛋白组成及其抗肿瘤与溶栓活性有显著影
响；在保全地龙的蛋白质类药效成分的生物活性方面，低温炮制工艺优于传统炮制工艺。
关键词：地龙；炮制；SDS—PAGE；纤溶活性；抗肿瘤活性
中圈分类号：R284．1；R286．91文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)07—0999—05
Effectofliquidnitrogenrapidfreezingtechnologyoncomponentsofwater—soluble
proteinsingrounddragonandtheiractivities
WANGHou—wei
(CollegeofPharmacy，ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250014，China)
Abstract：ObjectiveTos udytheffectofcold—processingtech ologyonthecompositionof
water—solubleprot insngrounddragona dtheiractivitiesofthrombolysisandanti—tumoractivity．
MethodsGrounddragonwasrespectivelyprocessedbytraditionalprocessingtechnologyandcold—
processingtechnology．Thelatterwasdonebytheliquidnitrogenrapidfreezingtechnologyandlyophiliz—
ingtechnology．Bymeansofqualitativendquantitativetests，SDS—PAGEandthesoftwareofImageTool
wereappliedtoanalyzingthedifferenceofproteincomponentsingrounddragonfromthetWOprocessing
techniques．Fibrinplatem thodanthrombolysistestinvitrowerecarriedoutOdeterminethedifference
ofthetwoprocessingtechniquesforthefibrinolyticac vity．Micro—observationandMTTme hodswere
usedtoassessthedifferencesofantihepaticc nceractivitybetweenthetraditionaIandthecold—processing
groups．ResultsComparedwiththetraditionalgroup，thecomponentsofwater—solubleprot insnthe
grounddragonprocessedbycold—processingtech iquewermoreabundantthanraditionalone，andthe
numberofproteinbandsandconcentrationinSDS—PAGEgelweremoreandmuchhigher．Althoughthe
twokindsofproteinsolutionfromthedifferentprocessingtechniqueshadthevisiblefibrinolyticac vity
andantihepaticc nceractivity，bothactivitiesofcold—processingtech iquewermarkedlyhigherthan
thoseinthetraditionalgroup．ConclusionEffectsofdifferentprocessingtechniquesofgrounddragonon
fibrinolyticac vityandanti．．tumoractivityaresignificant．Onprotectinghebioactivityofproteinsn
grounddragon．thecold—processingtech iquesisadvantageothetraditionalprocessingtechnology·
Keywords：grounddragon；processing；SDS—PAGE；fibrinolyticactivity；anti—tumoractivity
地龙又称蚯蚓，味咸，性寒，归肝、脾、膀胱经，具
有清热平肝、消炎止痛、活血化瘀及主治高热狂燥等
功效。已从蚯蚓中提取分离出多种药理活性成分，包
括纤溶酶、纤溶酶激活剂、钙调素、钙调素结合蛋白、
胆碱酯酶、过氧化氢酶、促髓系细胞增殖组分，抗微
生物蛋白，收缩血管蛋白，溶血蛋白，免疫球蛋白样
收稿日期：2006一10—08
毳喜器界：皇蠢震教育要写骂雾山Ig东(J0日6L照1人7)(1973 ，讲师，博士，主要研究方向中药生物工程。作者筒介：王厚伟 一)，男，山东日照人，讲师，博士，主要研究方向中药生物工程。
Teli(0531)82613129E—maillhouweiw@163．corn
万方数据
·1000· 中草115ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第7期2007年7月
黏连物和抗肿瘤等成分[1]。这些蛋白质类活性成分
在传统晒干、蒸、煮等炮制工艺条件下容易降解、变
性、失活，引起药效降低。针对蛋白质类药物的特点，
本实验采用液氮迅速冷冻和冷冻干燥技术对地龙进
行低温炮制，并对低温与传统两种炮制工艺下的地
龙中水溶性蛋白的组成、溶栓活性以及抗肿瘤活性
进行了比较研究。
1仪器与试药
美国Labconco77530—01冷冻干燥机，美国
Bio—Rad蛋白质电泳系统，AET一40SM十万分之
一电子天平，美国NU一4750型C02培养箱，苏州
CJ一1F型医用超净台，美国Beckman公司酶联免
疫分析仪，日本Olympus倒置显微镜。
新鲜参环毛蚓Pheretimaarspergillum，Eper—
rier；人肝癌SMC721细胞株由本实验室传代保种，
常规传代培养。
纤维蛋白原、凝血酶、丙烯酰胺、Ⅳ，Ⅳ一亚甲基
双丙烯酰胺、SDS、p琉基乙醇(Sigma)；Tris碱、溴
酚兰、甘油、考马斯亮蓝R一250、冰醋酸、甲醇(上海
巴斯德生物工程公司)；胰酶、DMEM培养基、胎牛
血清(Gibco．)；MTT(Sigma)。
2方法与结果
2．1传统炮制工艺：参照《中国药典》2005年版一
部地龙项下方法，取新鲜蚯蚓，剖开腹部，除去内脏
泥沙等杂质，洗净切段，晒干。
2．2低温炮制工艺：新鲜地龙1条(17g)，剖开腹
部，除去内脏泥沙等杂质，洗净切段；放置研钵，加入
适量液氮(5～10mL／g)，迅速冷冻，将冻块压力粉
碎，并将碎末转移至研钵研磨，边研磨边加液氮(每
次加液氮1～2mL／g)，直至成细末(粒度70～120
目)，并转移至冻干瓶中，冷冻干燥，制成地龙冻干
粉，4℃冰箱保存备用。
2．3蛋白质溶液的制备：准确称量10mg传统炮
制工艺制备的地龙药材粉末与低温炮制工艺制备的
冻干粉，分别溶入1mL0．05mol／LTris—HCl(pH
7．6)缓冲液中，充分溶解，100 0×g离心10min，
取上清液，于4℃冰箱保存备用。
2．4蛋白质溶液的SDS—PAGE[2]：配制12％SDS—
PAGE凝胶，各取20弘L两种炮制工艺所得地龙蛋
白质溶液，与5弘L缓冲液充分混合，水浴煮沸2
min，100 0×g离心2min，取上清液电泳。先以10
mA恒流电泳至分离胶，再调为15mA恒流到电泳
结束；将聚丙烯酰胺凝胶用固定液固定2h；倾去固
定液，以考马斯亮蓝染色液染色4h；倾去染色液，
加入脱色液，缓慢摇动脱色，脱色到获得蓝色条带及
干净的背景为宜，见图1。结果表明，低温炮制工艺
所得水溶性蛋白组成比传统炮制工艺的更加复杂，
主条带数明显多于传统炮制工艺。特别是相对分子
质量在1．44×104～4．30×104与相对分子质量大
于6．62×104以上的凝胶区段，传统炮制工艺组未
见明显的主带，而低温炮制工艺组则含有至少15条
左右的蛋白主带；相对分子质量在4．30×104～
6．62×104区，两种炮制工艺的蛋白条带数相近，但
低温炮制工艺组条带的浓度明显高于传统炮制工
艺；在1．44×104以下的低相对分子质量区，传统炮
制工艺组有两条明显高于低温炮制工艺组的主带。
1一传统炮制工艺‘2一低温炮制工艺M一标识
1-traditionalpr cessingtechnique
2-coldprocessingtechniqueM—marker
图1地龙水溶性蛋白SDS—PAGE
Fig·1SDS·PAGEofwater-solubleproteins
ingrounddragon
应用ScionImage分析软件对地龙的SDS—
PAGE凝胶图像做定量扫描分析，见图2。根据
Lanel相对分子质量标记的蛋白峰大小，对照相应
条带的蛋白的量，可以定量估测Lane2、3各蛋白峰
的蛋白质的量。低温炮制工艺组蛋白峰数(30土4)明
显多于传统炮制工艺(21±4)；沿电泳方向，在凝胶
的25～50mm区段，低温炮制工艺组有15个左右
的蛋白峰，而传统炮制工艺组在此区间内，仅有几个
较小的蛋白峰；在凝胶50mm以外的低相对分子质
量区，传统炮制工艺组有两个较大的蛋白峰，除此之
外，低温炮制工艺组的蛋白峰值均高于传统炮制工
艺组的相应峰，该分析结果与图1结果一致。
2．5纤维蛋白平板测定纤溶活性：纤溶酶活力测定
方法参照文献报道[3“]，稍加修改。8．1mL1％琼脂
万方数据
中草115ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第7期2007年7月·1001·
Lane1-标识Lane2-传统工艺Lane3-低温炮制
Lane1-markerLane2-traditionalpr cessing
techniqueLane3-cold—processingt chnique
图2地龙水溶性蛋白SDS—PAGE圈像分析
Fig·2GelanalysisofSDS-PAGEofwater—soluble
proteinsingrounddragon
糖于55℃时加入8．1mL0．3％纤维蛋白原溶液和
0．65mL凝血酶(1BP／mL)，混匀倒入平板中，静置
冷却。在平板上打孔，取10肛L适当稀释的蛋白溶
液，加入到孔中，将平板置于37℃培养箱中培养15
h，取出平板，测量其清晰的溶圈面积。对照加10弘L
纤维蛋白平板缓冲液。纤溶酶活力与溶圈面积的大
小成正比。可直接用溶圈面积的大小表示纤溶酶的
相对活力。用尿激酶制作标准曲线，计算出纤溶酶活
力大小，见图3。可见对照孔没有出现纤维蛋白水解
圈；传统炮制工艺组与低温炮制工艺组在加样孔周
围出现明显的水解圈；低温炮制工艺组的水解圈面
积显著大于传统炮制工艺组，显示出较强的纤溶活
性。将尿激酶标准品用缓冲液依次稀释为100、50、
25、12．5、5U／mL，分别取10肛L点在纤维蛋白平板
上，加盖后37℃保温18h，以尿激酶浓度的对数为
横坐标，以尿激酶水解纤维蛋白在纤维蛋白平板上
形成的水解圈面积的对数为纵坐标，制成标准曲线，
回归得方程Y一0．8728X一0．6593，R2=0．997。
根据标准曲线方程，得出两种炮制工艺条件下地龙
水溶性蛋白组分相对于尿激酶的纤溶活力，见表1。
可见低温炮制工艺组的纤溶活性约为480U／mL，
是传统炮制工艺组(160U／mL)的3倍。
2．6体外溶栓实验口]：在冰浴中混合250弘L血浆
和750rtLTNTC缓冲液(20mmol／LTris—HCl，
0．16mol／LNaCl，0．001％聚山梨酸酯一80，30
mmol／LCaCl。，pH7．4)，迅速混匀后分装到小的
Ep管中，每管100t．tL。37℃保温30min凝块形成
后，编号称定质量，小心加入100v-L待测样品，37
℃保温12h，吸净Ep管中溶液，称定质量，2次质量
之差即为血凝块溶解的质量。采用SPSS10．0统计
软件包对表1中各组数据进行单因素方差分析。结
果表明，低温炮制工艺组的体外溶栓指数为70％左
右，传统炮制工艺的溶栓指数为24％左右，低温炮
制工艺组的纤溶活性是传统炮制工艺组的3倍左
右，与纤维蛋白平板法测定结果一致。
l一低温炮制工艺2一对照3一传统炮制工艺
1-coldprocessingtechnique2-control
3-traditionalpr cessingtechnique
图3地龙水溶性蛋白纤溶活性检测结果
Fig．3Determinationoffibrinoiyticactivityofwater—
solubleproteinsingrounddragon
表1地龙水溶性蛋白组分的纤溶活性检测
与体外溶栓试验结果(i土s)
Table1 Resultsoffibrinolytieactivityandthromnolysis
testinvitroofwater-solubleproteininground
dragon(i土s)
2．7水溶性蛋白组分抗肿瘤活性的显微观察：按产
品说明配制DMEM培养基，用0．1mol／L盐酸调
pH值至7．2---7．4，4℃保存；胎牛血清于56℃灭活
30min，一20℃保存；胰蛋白酶用0．01mol／L，pH
7．4PBS配制成2．5g／L的溶液，4℃保存；MTT
溶液用生理盐水配制，使用质量浓度为5g／L，0．22
肛m微孔滤器滤过除菌，分装，4℃保存。人肝癌细胞
株SMC721在含10％精制小牛血清、双抗(青霉素
100U／mL，链霉素100／』g／mL)的DMEM培养基
中于37℃，5％CO。培养箱培养，每日显微镜下观
察，细胞呈单层生长，铺满培养瓶时，经胰酶消化后
传代。待分瓶的SMC721细胞停止消化后，加入
DMEM培养液，进行细胞计数，并调节细胞密度至
万方数据
·1002· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第7期2007年7月
2×105／mL(含‘50AFBS)，分入3个小培养皿中，每
皿1．8mL，置37℃，5％C02培养箱培养12h后，
给药，除对照外，每皿加入200弘L不同炮制工艺所
得1mg／mL地龙水溶性蛋白组分，继续培养24h
后，应用倒置显微镜观察，见图4。可见，对照组
SMC721细胞贴壁生长良好；传统炮制工艺组给药
24h后，部分细胞浮起，虽然贴壁的细胞尽管在形
态上仍然较为完整，但数量显著减少，细胞体积明显
比对照小，生长缓慢，近乎停止生长和分裂；低温炮
制工艺给药组的细胞大量浮起死亡，少数仍然贴壁
的细胞皱缩变圆，胞质回缩、细胞间隙增大。
2．8 水溶性蛋白组分抗肿瘤活性的MTT比色实
A一对照 B一传统炮制工艺C一低温炮制工艺
A--controlB—-traditionalpr cessingtechniqueC·-coldprocessingtechnique
图4不同炮制工艺对地龙水溶性蛋白抗人肝癌细胞(SMC721)活性的影响
Fig．4Effectofwater—solubleprot insingrounddragonprocessedbydifferentt chniquesonactivity
ofanti-hepaticcancerSMC721
验[6]：取对数生长期的SMC721细胞，以1×105／mL
密度接种子96孔板，每孔100弘L，埋板12h后加
药。不同炮制工艺的地龙水溶性蛋白组分设5个剂
量，分别为1250、250、50、1099／mL，每个剂量均设
3个复孔。给药24h后，小心吸弃孔内培养上清，每
孔以PBS洗1次，再将上清吸弃。每孔加完全
DMEM培养液100肛L，MTT液10弘L，37℃／5％
CO。饱湿继续孵育4h后中止培养，小心吸弃孔内
培养上清。每孔加入150止DMSO，振荡10rain，充
分溶解后，用酶标定量测试仪测定490nm处的吸
光度(A)值，计算细胞生长抑制率[细胞生长抑制
率一(对照组平均A值一用药组平均A值)／对照
组平均A值×100％]，见表2。可见两种炮制工艺所
得地龙水溶性蛋白组分对体外培养的人肝癌细胞
(SMC721)均具有显著的增殖抑制作用；在给药后
24h，给以1．25mg／mL低温炮制工艺所得地龙蛋
白组分对SMC721细胞增殖抑制率(36％左右)显
著高于传统炮制工艺组(15％左右)。
3讨论
动物药活性成分以多肽和蛋白质为主，受历史
技术条件的限制，传统动物药的炮制以简单的在常
温或高温条件下获得药材的干燥品为主。然而，自然
晒干或高温蒸煮的炮制工艺容易引起药材中蛋白质
类活性成分的降解和变性。针对蛋白质类活性成分
易降解、变性的特点，本研究采用液氮快速冷冻技术
和冷冻干燥技术对地龙进行低温炮制。对低温与传
统炮制工艺下的地龙水溶性蛋白的组成、溶栓活性
表2不同炮制工艺的地龙水溶性蛋白组分对SMC721
细胞的增殖抑制作用(i士s)
Table2 Inhibitoryeffectofwater—solubleprot ins
ingrounddragonprocessedbydifferent
techniquesonSMC721proliferation(i士s)
细胞生长抑制率／％剂量7‘pg‘“L_1’_丽丽五r—丽蕊
以及抗肿瘤活性的比较分析结果表明：在保全蛋白
质类药效成分的生物活性方面，低温炮制工艺优于
传统炮制工艺。
地龙溶栓与抗肿瘤活性成分主要是蛋白类的蚓
激酶和地龙肽[1]。在传统炮制工艺条件下，新鲜地龙
自然晒干为干燥品的历时较长，其间，由于组织和细
胞逐渐被破坏而释放出的蛋白酶容易引起蛋白类活
性成分的降解；另外地龙蛋白组分在外界不良理化
因素的长时间作用下容易变性，导致相应生物活性
的丧失。进一步研究证实，采用晒干工艺制备的地龙
干燥体中蚓激酶的量很低，纤溶活性几乎完全被破
坏。相反低温炮制工艺将新鲜地龙用液氮迅速冷冻，
可以在短时间内冻结内部组织细胞的生物酶活性，
进而在低温条件下研制成粉末后，采用冷冻干燥技
术制成冻干粉。整个炮制工艺在低温下完成，历时短
暂，可以有效阻止生物酶的活性，避免蛋白类活性成
分的降解与变性。结果表明，传统炮制工艺所得地龙
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第7期2007年7月
蛋白组分的SDS—PAGE条带数明显少于低温炮制
工艺，溶栓活性与抗肿瘤活性也显著低于低温炮制
工艺。
在传统炮制工艺条件下，地龙部分蛋白组分被
降解为小分子肽或游离的氨基酸，该类产物或在
SDS—PAGE凝胶的低相对分子质量区积聚成带，或
较早跑出凝胶进入电泳缓冲液而不能在凝胶上显
示；变性的蛋白组分在电泳上样前，经离心沉淀而被
除去；低温炮制工艺与之不同，使用液氮将新鲜的地
龙快速冷冻，在低温下研制成粉末后，应用冷冻干燥
技术制成冻干粉，整个工艺流程在低温下进行，蛋白
酶的活性极低，可有效阻止蛋白组分的降解和变性，
更好的保全其活性。因此，低温炮制工艺的SDS—
PAGE总条带数多于传统炮制工艺，但在低相对分
子质量区，传统炮制工艺明显多出两条主带。另外两
种炮制工艺所得地龙的水溶性蛋白组成都很复杂，
多种相对分子质量相近的组分在SDS—PAGE中没
有有效分开，导致凝胶图像扫描分析结果的蛋白峰
型不规则，峰间距小，甚至重叠，明显的蛋白峰数低
于电泳的实际条带数。理论上，本研究提出的低温炮
制工艺也适用于活性成分以多肽和蛋白质为主的其
他动物类中药的炮制。
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超临界C02反相微乳萃取人参中人参皂苷的研究
罗登林，聂英，刘建学，郭金英
(河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471003)
摘 要：目的 提高超临界c0。萃取人参中人参皂苷的萃取率。方法采用二一(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠
(AOT)／乙醇／水／超临界CO。反相微乳对人参皂苷的萃取进行研究。结果在萃取压力25MPa、温度45℃、时间
4h、C02流量为2L／h条件下，超临界C0z反相微乳萃取的人参皂苷萃取率是乙醇／水／超临界C0z萃取的3．2
倍。人参皂苷的萃取率随加入的水量、萃取压力的增大而增大，随AOT浓度、萃取温度的升高先增大后减小。萃取
人参皂苷时，采用适量水先浸泡物料与萃取过程中加入水相比，人参皂苷的萃取率要提高30％。结论结合实验结
果与理论探讨，超临界C0z反相微乳萃取人参皂苷的机制主要是其形成的极性水池增大了对人参皂苷的溶解度。
关键词：人参；人参皂苷；超临界coz反相微乳萃取；超临界C0z萃取
中图分类号：R284．2；R286．02文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)07—1003一04
GinsenosidesfromPanaxginsengbysupercriticalC02reversemicroemulsionextraction
LUODeng一1in，NIEYing，LIUJian—xue，GUOJin—ying
(FoodandBioengineeringColle e，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China)
Abstract：ObjectiveToraiseginsenosidesyieldfromPanaxginsengbysupercriticalC02reversemi—
croemulsionextraction．MethodsBis一(2一ethylhexyl)sodiumsulphosuccinate(AOT)／ethanol／water／su—
percriticalC02reversemicroemulsionextractionwascarriedoutoextractgingsenosides．ResultsTh
ginsenosidesextractingratebysupercriticalC02reversemicroemulsionextractionwas3．2timesthatofby
ethanol／water／supercriticalC02extractionnextractingpressure25MPa，extractingtemperature45℃，
收稿日期：2006—1I-29
作者简介：罗登林(1976一)，男。湖北廓城人，博士，主要从事天然产物生化技术、超临界流体技术和食品营养与安全的研究。
Tel：(0379)64282342E—mail．．1uodenglin@sohu．corn
万方数据
液氮快速冷冻对地龙中水溶性蛋白组成和活性的影响
作者： 王厚伟， WANG Hou-wei
作者单位： 山东中医药大学药学院,山东,济南,250014
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(7)
被引用次数： 1次

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