全 文 ：中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月·69·
药理与临床
氧化苦参碱心肌保护作用及其作用靶点的研究
孙宏丽，商 蕾，初文峰，霍 蓉，刘 艳，杨宝峰+
(哈尔滨医科大学药理教研室黑龙江省生物医药重点实验室一省部共建国家重点实验室培育基地，黑龙江哈尔滨 150086)
摘 要：目的 研究氧化苦参碱对心肌缺血的保护作用，并进一步探讨其可能的作用靶点。方法 采用结扎大鼠左
冠状动脉前降支制备急性心肌缺血模型，观察氧化苦参碱对心肌缺血的保护作用；应用TUNEL法检测氧化苦参
碱对心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡指数的影响；应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)研究氧化苦参碱对急
性心肌缺血大鼠心肌L型ca”通道蛋白mRNA表达的作用。结果氧化苦参碱大、中、小剂量(20、10、5mg／kg)
组均可缩小心肌梗死面积，氧化苦参碱大、中剂量能明显提高血清SOD活力、降低MDA水平；TUNEL法证实氧
化苦参碱可降低心肌细胞凋亡指数；RT—PCR检测结果表明，急性心肌缺血大鼠心肌L型ca2+通道蛋白a。c
mRNA表达水平明显高于假手术组(P低(P肌L型Ca2+通道蛋白a，cmRNA表达，从而抑制心肌细胞凋亡有关。
关键词：氧化苦参碱；心肌梗死；L型Ca2+通道蛋白a。c
中图分类号：R286．2 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2007)01—0069—04
CardioprotectiVeeffectsandtheiractiontargetsofoxymatrine
SUNHong—li，SHANGLei，CHUWen—feng，HU0Rong，LIUYan，YANGBao—feng
(DepartmentofPharmacology，Bio—pharmaceuticalKeyLaboratoryofHeilongjiangProvince--CultivationBase，S ate
KeyLaboratoryCo-establishedbyProvinceandMinistry，HarbinMedicalUniversity，Harbin150086，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectsofoxymatrineonmyocardialischemiaand
furtherexploreth irunderlyingtargets．MethodsTheffectsofoxymatrineonmyocardialischemiawere
observedbyamodelofacutemyocardialinf rctionduetopermanentliga ionofleftanteriordescending
coronaryrteryinrats．Theapoptoticindexofcardiomyocytewasde ctedbyterminaldeoxynucleotid
transferasedirectedd—UTPnickandendlabeling(TUNEL)assay．RT—PCRtechniquewasutilizedto
studytheactionfoxymatrineonexpressionofL—typecalciumchannelproteinalcmRNAinthe
cardiomyo@tesofra s．ResultsOxymatrinecouldd creaseinfarctareaofmyocardiumatthedoseof5。
10，and20mg／kg．OxymatrinecouldalsoincreaseSODactivity，reduceMDAcontentinserum，and
attenuatemyocyteapoptosis．TheresultsofRT—PCRshowedthexpressionofL—typecalciumchannel
proteindlcmRNAinmodelratswasmarkedlyincreased(comparedwiththatinSham—operationts)(P<
0．01)，andftert eatmentwithoxymatrine，theexpressionofL—typecalciumchannelproteinalcmRNA
waslowerthanthatinmodelrats(P<0．05)．ConclusionOxymatrineposs ssesprotectiveactiono
myocardialinfarctionofrats．Thepossiblemechanismsofanti—ischemiaareattributedtod creasingthe
expressionofL—typecalciumchannelproteinalcmRNAinventricularmyocytesofratsandfurther
inhibitingcardiomyocyteapoptosis．
Keywords：oxymatrine；myocardialinfarction；L—typec ciumchannelproteinalc
氧化苦参碱(oxymatrine)是从豆科槐属植物
苦豆子SophoraalopecuroidesL．中提取的一种苦
参型生物碱。基础及l艋床研究发现，氧化苦参碱具有
抗炎、抗过敏、抗心律失常、保肝、抗病毒等多方面药
理作用。关于氧化苦参碱药理作用机制的研究，多集
中在抗肝炎及抗肿瘤方面，已有许多实验证实，氧化
苦参碱对多种原因诱导的肝细胞凋亡具有抑制作
用‘13；另有研究表明‘2|，氧化苦参碱有明显的清除羟
收稿日期：2006—05—12
基金项目：国家自然科学基金重点项目(30430780)；哈尔滨医科大学研究生创新基金
作者简介：孙宏丽(1974一)，女，山东省昌乐县人，博士研究生，副教授，主要从事心血管药理学研究。
*通讯作者杨宝峰Tel：(0451)86671354E—mail：yangbf@ems．brbmu．edu．cn
万方数据
·70· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月
自由基的作用。但关于氧化苦参碱对心血管系统相
关疾病的研究鲜有报道，虽然已有实验证实氧化苦
参碱能对抗乌头碱、BaCl：、冠脉结扎和CaCl。一Ach
混合液诱发的心律失常，认为其抗心律失常的机制
是多方面的，但关于氧化苦参碱抗心律失常作用机
制的研究也只局限在对Na+通道的影响上；关于氧
化苦参碱抗心肌缺血作用方面的研究，国内外罕见
报道，经本室研究证实[3]，氧化苦参碱对豚鼠心室肌
细胞膜电压依赖性钙通道有明显抑制作用，由此推
测氧化苦参碱可能具有抗心肌缺血作用。因为在心
肌缺血时，钙超载和细胞凋亡是造成心肌损伤的重
要因素。因此本实验通过结扎大鼠左冠状动脉前降
支造成急性心肌缺血模型，观察氧化苦参碱对急性
心肌缺血的保护作用，并初步探讨其可能的作用
靶点。 ·
1材料与方法
1．1动物、药品、试剂和主要仪器：健康Wistar大
鼠，体重200～250g，雌雄兼用，由哈尔滨医科大学
实验动物中心提供。氧化苦参碱购自陕西慧科植物
开发有限公司，质量分数98．42％；超氧化物歧化酶
(SOD)和丙二醛(MDA)测定试剂盒购自南京建
成生物工程研究所；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒
购自德国Roche公司；Trizol为Gibco公司产品；
RT试剂盒为Invitrogen公司产品；Taq酶为上海
生工产品；引物由上海生工合成。PCR扩增仪
(BIO—RAD，美国)，低温高速离心机(JouanBR4i，
德国)，稳压稳流电泳仪(BIO—RAD，美国)，凝胶成
像系统(BIO—RAD，美国)。
1．2心肌缺血模型的制备H]：雄性Wistar大鼠，戊
巴比妥钠40mg／kg麻醉后仰位固定，气管插管接
呼吸机。将针形电极插入四肢皮下，连接心电图机，
记录标准Ⅱ导联心电图。沿胸骨左缘3～4肋间开
胸，暴露心脏，在左冠状动脉前降支距左心耳下缘
1～2mm处穿线，15min后取心电图正常者随机分
成5组：假手术组，冠状动脉下穿线不结扎；模型组，
结扎左冠状动脉前降支，以心电图ST段明显上抬，
结扎线以下心肌颜色变暗为心肌缺血标志；氧化苦
参碱小、中、大剂量组，分别iv氧化苦参碱5、10、20
mg／kg，10min后，结扎左冠状动脉前降支。
1．3 心肌梗死面积的测定：结扎左冠状动脉前降支
6h后立即取出心脏，剪下左室，每隔2mm将心肌
横切成片，放入1％TTC磷酸缓冲液(pH7．4)
中，37℃水浴避光染色10min后，剪下梗死心肌称
质量，以梗死心肌占左室质量比为梗死百分率。
1．4血清SOD活力和MDA水平的测定：各组动
物于冠脉结扎6h后颈总动脉取血，离心制备血清，
按试剂盒操作方法测定SOD活力和MDA水平。
1．5 凋亡指数的检测：采用原位末端脱氧核糖核酸
转移酶介导的d—UTP缺口末端标记(TUNEL)法
检测心肌细胞凋亡指数，根据凋亡阳性细胞分布情
况，在400×高倍视野下，每张切片于梗死区周围选
择6个无重叠视野，计算细胞凋亡指数。
凋亡指数一凋亡阳性的细胞核数／总计数的细胞核数×
100％
1．6 RT—PCR检测
1．6．1心肌组织总RNA的提取：采用Trizol法
(每50～100mg组织加入Trizol1mL)，提取右心
室肌组织总RNA，一80℃保存备用。各总RNA样
本A26。／A。8。值均为1．8～2．0。
1．6．2扩增引物设计与合成：根据Genebank的序
列，用Primer5．0软件分别设计t3-actin和L型
Ca2+通道d。c引物。p-aetin引物序列为上游引物：5L
AGGCCCCTCTGAACCCTAAG一37；下游引物：57一
TGCCACAGGATTCCATACCC一37。L型Ca抖通
道a。c引物序列为上游引物：57一TGACTACC—
TGACTAGGGATTG一3’；下游引物：5t-GCTT—
CATGCTGGTCCTCT一37。
1．6．3逆转录和扩增反应：测定总RNA浓度，取
200ng参照RT试剂盒说明书进行逆转录反应合
成cDNA第一链。双重PCR反应体系50肛L：10×
buffer5．0弘L，MgCl23．0弘L，dNTP0．4弘L，ft-actin
上游引物及下游引物各2．0肛L，L型Ca2+通道Q。c
上游引物及下游引物各2．0弘L，cDNA4．0弘L，Taq
酶1．0弘L，去离子水28．6弘L，混匀后离心数秒，置
PCR仪上，反应条件为94℃变性30S，51．5℃退
火30S，72℃延伸30S，进行30次PCR循环。
1．6．4PCR产物检测及结果分析：将PCR产物用
2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，置凝胶图像处理
系统下拍照，0【。c产物为362bp，ft-actin产物为500
bp。用凝胶图像处理系统记录0[1C和f3-actin产物为
电泳带的密度，计算比值，进行半定量分析。
1．7统计分析：数据用z±S表示，用￡一检验进行差
异的显著性检验，双尾概率P性意义。
2结果
2．1 氧化苦参碱对急性心肌缺血大鼠心肌梗死面
积的影响：模型组梗死面积与假手术组相比具有显
著差异(P 万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月·71·
功。当预先给予氧化苦参碱后再结扎冠状动脉，结果
显示氧化苦参碱各剂量(5、10、20mg／kg)均可降
低心肌梗死面积，结果见表1，说明氧化苦参碱能缩
小缺血心肌梗死范围，对大鼠急性心肌缺血具有保
护作用。
表1 氧化苦参碱对急性心肌缺血大鼠心肌梗死面积的
影响(；土s)
Table1 Effectofoxymatrineon farctareaofmyocar-
diuminacutemyocardialischemiarats(；土s)
组别
剂量／ 动物／ 梗死区质量／ 左室质量／ 梗死百分率／
(mg‘kg一1)只 g g ％
模型 一 i0 0．138-t-0．0244。0．42士0．0635土74。
氧化苦参碱 5 i0 0．108=1=0．020’’0．38-t-0．0529±5’
10 11 0．104士O．014’。0．37士O．0727±4。。
20 11 0．102士O．017’。0．3810．0427±4。’
与假手术组比较：44P<0．01
与模型组比较：’P44P。P2．2 氧化苦参碱对血清SOD活性和MDA水平
的影响：结果显示模型组大鼠血清中SOD水平明
显低于假手术组(P<0．01)，MDA水平明显高于
假手术组(P<0．01)，表明急性心肌缺血时可产生
大量氧自由基导致心肌损伤。氧化苦参碱10、20
mg／kg剂量组血清中SOD水平明显高于模型组
(P<0．05)，而MDA水平明显低于模型组(P<
0．01)，说明氧化苦参碱能够提高血清SOD活力，
降低MDA水平，从而保护氧自由基引起的心肌损
伤，具有抗脂质过氧化作用，结果见表2。
表2氧化苦参碱对急性心肌缺血大鼠血清SOD活力
及MDA水平的影响(；±s)
Table2 EffectofoxymatrineonSODactivity
盛ndMDAlevelinserl¨∞ofacute
myocardialischemiarats(；±s)
与假手术组比较：4PGO．05
44PG0．01
与模型组比较：’PGO．05一PGO．Ol
4PGO．0544PGO．OlvsShamgroup
。PGO．05’。PGO．Ol05modelgroup
2．3 氧化苦参碱对急性心肌缺血大鼠心肌细胞凋
亡指数的影响：假手术组未发现心肌细胞凋亡，心肌
细胞核呈蓝色，模型组可见大量心肌细胞凋亡，凋亡
的心肌细胞核在TUNEL染色DAB显色时呈深浅
不一的棕褐色，氧化苦参碱治疗组心肌细胞凋亡指
数明显减少(P<0．05)，说明氧化苦参碱可以降低
心肌细胞凋亡指数，从而保护心肌。结果见表3。
表3氯化苦参碱对急性心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡指数
的影响(i±s，n一8)
Table3 Effectofoxymatrineonapoptoticindex
ofcardio—myocytesofacutemyocardial
ischemiarats(；±s，n一8)
与假手术组比较：44PG0．01；与模型组比较：。PG0·05
44PGO．OlusShamgroup；’P2．4 氧化苦参碱对急性心肌缺血大鼠心肌L型
Ca2+通道蛋白a，ctuRNA表达的影响：以大鼠心肌
总RNA为模板，在同一反应体系中以特异性引物
同时扩增L型Ca2+通道alC和pactin的特异片段，
在2％琼脂糖凝胶电泳后可见在362bp处及500
bp处各出现1条带，与预期的目的条带位置相符，
PCR产物电泳后置凝胶图像处理系统下进行泳道
分析，结果显示模型组大鼠心肌L型Ca2+通道蛋白
a。cmRNA表达量显著高于假手术组(P氧化苦参碱大、中剂量组同模型组比较表达量有所
降低(P表4氧化苦参碱对急性心肌缺血大鼠心肌L型Ca2+通道
蛋白alcmRNA表达的影响(；±s，n一5)
Table4 EffectofoxymatrineonexpressionofL--typecal--
ciumchannelproteinalcmRNAinmyocardium
ofacutemyocardialischemiarats(；土s，一：5)
与假手术组比较：44PGO．01
与模型组比较：。PGO．05一PGO．Ol
44PGO．Ol795Shamgroup
。PGO．05+’PG0．01口smodelgroup
3讨论
心肌缺血、缺氧时不仅可产生大量的氧自由基，
同时由于SOD活性的降低，无法清除过多的氧自
由基，结果使自由基上的活跃电子与多种生物大分
子发生脂质过氧化反应，导致大分子变性失活，造成
万方数据
·72· 中单菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第1期2007年1月
能量代谢障碍，钙通遁的特性发生1『改变，细胞外
Ca2+通过细胞膜上的L一型钙通道大量内流，同时通
过钙介导的钙释放(CICR)‘73机制使肌浆网(SR)
内的Ca2+也大量释放，致使细胞内[Ca2+]。明显升
高。Ca2+的增加将会激活细胞凋亡的信号转导途
径，促进细胞凋亡启动基因的表达，使凋亡抑制因子
的功能受到影响，最终产生细胞不可逆性损伤，由此
可见在心肌缺血过程中，细胞内Ca2+超载是引起心
肌细胞损伤的重要机制之一。本研究结果显示氧化
1一M。，k。，DL20002～4一氧化苦参碱(20、10、5。g／kg)组
苦参碱对急性心肌缺血大鼠心肌细胞膜上L型
5一模型组6一假手术组 Ca2+通道蛋白alcmRNA表达的增高具有抑制作
1一MarkerDL20002--4-oxymatrine(20，10，and5mg／kg) 用，以往的研究结果跚表明氧化苦参碱对高K+去
groups5一modelgroup6一Shamgroup 极化引起的[Ca2+]i升高具有明显的降低作用，这
图1 PCR产物电泳图 就提示氧化苦参碱可能通过抑制大鼠心肌细胞膜上
F‘g·1E1．ectroph。。。‘。g。am。‘PcRp。。du。‘L型Caz+通道蛋白mRNA的表达，影响L一型钙通
生物膜损伤，同时使过氧化物MDA增高。因此，氧
道的功能，抑制外Caz+内流，进而降低[ca2+]i而发
化应激对心肌损伤的程度可通过内源譬#氧化酶 挥抗凋亡作用的。
SOD活性及MDA水平的变化间接评定口3。本实验
本实验表明氧化苦参碱对缺血心肌具有保护作
结果表明，氧化苦参碱能缩小左冠状动脉前降支结
用，其作用机制可能与抗脂质过氧化，抑制大鼠心肌
扎大鼠心肌梗死范围，提高血清sOD活力，降低其 细胞膜上L型Caz+通道蛋白mRNA表达，使外钙
MDA水平，提示氧化苦参碱可能通过抑制脂质过
内流减少，进而使Caz+]；降低，从而抑制心肌细胞
氧化过程，并提高内源性抗氧化酶sOD活性而减
的凋亡有关。本研究阐明了氧化苦参碱新的药理作
轻氧自由基对心婴的损伤。 用，这将为氧化苦参碱的临床应用提供可靠的实验
Kaj8‘u‘a等¨。研究认溪细胞凋亡是心肌缺血时依据。
心肌损伤的主要形式，心肌缺血导致机体抗氧化能
Ref。，。n。e。：
力下降，使氧自由基在体内积聚，一方面损伤细胞膜 E1]xi。。gxx，w。。gGJ，c。ix州以Eff。。t。f。。y。。trin。。。
结构，使细胞膜通透性增加；另一方面可能损伤线粒 murinefulminanthepatitisandhepatocyteapoptosis[J]．
体等膜结构和功能，引起细胞内钙稳态的失衡，从而 [2]东：黑，≮篓j’B11，5s(。4。)。c59P3-，5甜96．以EsRs。。d，。。。h。
激活了细胞凋亡机制，导致细胞凋亡的发生。心肌细 effectsofoxymatrineonscavenginghydroxylradicaland
胞凋亡决定了心肌梗死面积的大小。本实验结果发 PprLoAte秀描医ag学ai杂ns志tir)r，ad。i。a。ti60，n，[。J(]6．)j0三篓d∞抽
现，缺血6h后，在模型组梗死心肌周围出现了凋亡 [3|S～un。曼L，Xu?Q，LiZ，甜以叫ect．。f。x?龟!ine。n
的心肌细胞，心肌细胞凋亡指数较假手术组明显增 点：爿?n(筝葺罴i志cu)la，‘。m。04，yocy。t。e(o。f)g鬻竺：．u土㈨”
加，而氧化苦参碱对心肌缺血所诱发的心肌细胞凋 [4]LiuY，XuCQ，JiaoJD，eta1．M3一R／IKM3anewtargetof
亡具有明显的抑制作用，能明显降低心肌细胞凋亡 ：n㈣tiar‘h州ythnmic¨ag，en‘8啪·A甜。P加⋯s跏‘药学学报’
指数，这提示氧化苦参碱对缺血心肌的保护作用可 [5|HammondB，HessML．The
ox．ygcnfre：：adicalsystem：
能部分是通过减少心肌细胞凋亡来实现的。乏裂1m98ed5i，at60(r1)o：f三瑟：l“㈠则“7u上。A”∞以
为进一步探讨氧化苦参碱抑制心肌细胞凋亡的 [6]KajsturaJ，ChengW，ReissK，eta1．Apoptoticandnecrotic
机制，研究其潜在的作用靶点，应用RT—PCR方法 infmy。orctcy’：i薹1}冀竺s[J]ar．e如ind6ep，e⋯ndment1c909n6tr，1b7u4ff(nlg)：v：=笋耐
观察了氧化苦参碱对大鼠心肌细胞膜上L型Ca2+[7]BerridgeMJ．Elementaryandglobalspectsofcalcium
通道蛋白alcmRNA表达的影响。心肌缺血时，由于
8ignaling[J]·JP幻5i。2，1997,499‘2’：291—306‘
保 护 环 境 造 福 子 孙
万方数据
氧化苦参碱心肌保护作用及其作用靶点的研究
作者： 孙宏丽， 商蕾， 初文峰， 霍蓉， 刘艳， 杨宝峰， SUN Hong-li， SHANG Lei， CHU
Wen-feng， HUO Rong， LIU Yan， YANG Bao-feng
作者单位： 哈尔滨医科大学,药理教研室,黑龙江省生物医药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育
基地,黑龙江,哈尔滨,150086
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2007,38(1)
被引用次数： 11次

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