全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月·233·
清抗体效价，从而增强体液免疫。
研究表明，肿瘤的发生、发展和转移过程与肿瘤
自身的细胞凋亡密切相关，凋亡一旦发生便不可逆
转。本研究发现，中、高剂量松节藻醇提取物诱导脾
淋巴细胞凋亡的能力要显著高于空白对照组，说明
松节藻醇提取物的肿瘤抑制作用可能是通过诱导细
胞凋亡而产生的。
本研究表明松节藻醇提取物具有一定的抗肿瘤
药理活性，虽然作为药物开发尚有大量的工作要做，
但为开发利用海洋生物资源带来了希望，其潜在的
药用价值应予重视。
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复方血尿停经肝微粒体代谢后对肾小球系膜细胞的影响
张红敏1，丁樱2，陈世伟3”，王丽英1
(1．成都中医药大学，四川I成都610075；2．河南中医学院第一附属医院，河南郑州450008；3．四川大学华西
公共卫生学院营养与食品卫生教研室，四川成都610041；4．河南省疾病预防控制中心，河南郑州450003)
摘要：目的探讨复方血尿停治疗以系膜增生为主要病理改变的肾小球疾病的作用机制。方法将复方血尿停
与大鼠肝微粒体共同孵育后加入到肾小球系膜细胞(GMc)体外培养体系中，MTT法观察细胞增殖情况，放射免
疫法测定白细胞介素一6(IL一6)、内皮素一1(ET一1)水平，速率法检测乳酸脱氢酶(LDH)的含量。结果经肝微粒
体代谢后，复方血尿停2、4、8mg／mL均抑制GMC的增殖及IL一6、ET一1的产生，且呈剂量依赖方式。结论复方
血尿停能抑制IL一6、ET一1的分泌和GMC的增殖，此作用可能是其治疗系膜增生性肾小球疾病的作用机制之一。
关键词：复方血尿停；肾小球系膜细胞；增殖；白细胞介素一6(IL一6)；内皮素一1(ET一1)
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)02—0233—04
EffectsofCompoundX eniaotingmetabolizedbylivermicrosomes
onglomerularmesangialcells
ZHANGHong—minl，DINGYin92，CHENShi—wei3”，WANGLi～yin91
(1．ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine，Chengdu610075，China；2．TheFirstAffiliatedHospital，
HenanCollegeofTraditionalChineseMedicine，Zhengzhou450008，China；3．WestChinaSchool
ofPublicHealth，SichuanUniversity，Chengdu610041，China；4．HenanProvinceCenter
forDiseaseControlandPrevention，Zhengzhou450003，China)
Abstract：ObjectiveTostudythemechanismoftraditionalChinesemedicineCompoundX eniaoting
(CXNT)intreatingglomerulusdiseaseswiththemainpathologicalchangesofproliferationinmesangial
cells．MethodsCXNTandratlivermicrosomeswereincubatedtogether。andthetheincubatedCXNT
wasaddedintoculturedglomerularmesangialce ls(GMC)invitro．TheproliferationofGMCwas
observedbyMTTassay，the1ev lsofinterleukin一6(IL一6)andendothelin一1(ET一1)weredeterminedby
radioimmunoassay，andcontentoflacticdehydrogenase(LDH)wasdeterminedbyv locityassay．Results
CXNT(2，4，8mg／mL)metobolizedbyratl vermicrosomescouldallinhibitethproliferationofGMC
andproductionofIL一6andET一1inadose—dependentmanner．ConclusionCXNTcani hibitethprolif—
erationofGMCandrestrainthesecretionofIL一6andET一1，thisfunctionmaybeoneofC：XNTmecha一
收藕日期：2004—05—08
基金项目：河南省自然科学基金资助项目(0111023200)
作者筒介：张红敏(1969一)，女，河南濮阳人，主治医师，成都中医药大学2002级在读博士，主要从事内分泌与肾脏疾病的防治研究。
E—mail：zhm0916@126．eom
万方数据
·234· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月
nismsintreatingsomem sangialproliferativeglomerulonephritis．
Keywords：CompoundXueniaoting(CXNT，atraditionalChinesemedicineprescription)；glomerular
mesangialcel (GMC)；proliferation；interleukin一6(IL一6)；endothelin一1(ET一1)
复方血尿停是儿科肾病专家丁樱教授的经验
方，具有养阴、清热、活血化瘀作用，经临床观察，对
过敏性紫癜性肾炎、IgA肾病、急性肾炎恢复期、慢
性肾炎等临床以血尿为主要表现、病理类型以系膜
增生为主要表现者有较好的疗效[1]。考虑肾小球系
膜可能为该方的主要作用部位，为深入研究其作用
机制，本实验利用肾小球系膜细胞(GMC)体外培
养技术，观察复方血尿停对GMC增殖的影响。由于
目前中药体外药效试验药物添加方式——直接添加
和含药血清添加都存在一定问题，因此，本实验借鉴
毒理学的试验方法，将大鼠肝微粒体与中药共同孵
育，来模拟体内代谢过程，再加入到体外培养体系
中，以期探讨复方血尿停治疗系膜增生性肾小球肾
炎的可能作用机制。
1材料
1．1细胞：从4周龄C5781／6J×SJL／J小鼠肾小
球分离克隆的系膜细胞(GMC)，由南京军区南京
总医院解放军肾脏病研究所刘志红研究员惠赠。
1．2主要药品与试剂：复方血尿停提取物(以下简
称血尿停，XNT)为复方血尿停颗粒剂相同处方药
物的不含任何赋形剂的提取物，主含药物：生地、水
牛角粉、知母、当归、旱莲草、生蒲黄、虎杖、三七，提
取物相当于含生药4g／mL，由河南中医学院儿科
所特别制备。脂多糖(LPS)、MTT为Sigma产品；
白细胞介素一6(IL一6)、内皮素一1(ET一1)放免试剂
盒由解放军总医院科技开发中心放免所提供；乳酸
脱氢酶(LDH)试剂盒，北京中生生物工程高技术
公司生产；氧化型辅酶Ⅱ(NADP)和还原型辅酶I
(NADH)均为进口分装，购自北京百泰生化试剂公
司；6一磷酸葡萄糖脱氢酶(G一6一PDH)为Sigma
产品。
1．3 仪器：LNAmlllDH型CO。培养箱，日本生
产。V1．2型全自动酶标分析仪，芬兰生产。SPACE
型全自动生化分析仪，美国生产。SN--695B型智能
放免丫测量仪，上海原子核研究所日环仪器一厂
生产。
2方法
2．1肝微粒体制备：参考文献方法瞳]，取经苯巴比
妥诱导[-ip苯巴比妥60mg／(kg·d)，连续4d]、禁
食不禁水过夜的健康成年雄性SD大鼠(体重200
g左右)的肝脏，在0～4℃条件下，用冷的0．15
mol／LKCl溶液漂洗后，按1g肝湿重加3mL冷
TMS缓冲液(pH7．5，50mol／LTris—HCl、3mol／L
MgCI。、200mol／L蔗糖)制备肝匀浆，1000 ×g离
心10min，弃去最上面脂肪层后的上清液25000×
g离心10min，取上清液，再105000×g离心60
min，沉淀部分为微粒体。将微粒体悬浮在TMS缓
冲液中(1g肝湿重加1mLTMS缓冲液)。按
Lowry法进行肝微粒体蛋白含量的鉴定，合格者储
存在液氮中备用。
2．2血尿停肝微粒体代谢物的制备：参考文献方
法[3]，取血尿停提取物，用I号液(RPMI1640培养
液，加L一谷氨酰胺300mg／L、丙酮酸钠2mmol／L、
Hepesl5mmol／L、青霉素100U／mL及链霉素100
U／mL，碳酸氢钠调pH至7．1～7．4)配制成1g／
mL溶液，取1mL，加肝微粒体(LM)混合液[含
微粒体蛋白2mg／mL、lmmol／LNADP、1mmol
NADH、1IU／mLG一6一PDH、10mmol／L6一磷酸葡
萄糖(G一6一P)、4mmol／L硫酸镁和0．2mmol／L磷
酸盐缓冲液(PBS)]1mL，37℃水浴孵育30min
后，冰浴终止反应，105000×g离心60min，取上清
液，用I号液稀释10倍，调pH至7．1～7．4，微孔
滤膜滤过除菌，即得0．05g／mL血尿停肝微粒体代
谢物。
2．3细胞培养、实验分组及药物处理：将第5代生
长良好的小鼠GMC经胰蛋白酶一EDTA消化液消
化后，收集于离心管中，加Ⅱ号液(I号液中加20％
灭活小牛血清、0．66U／mL胰岛素，调pH至7．1～
7．4)配制成3．3×104／mL细胞悬液，按每孔150
弘L转种至96孔培养板(Nunc产品)中。37℃、5％
CO。培养箱中孵育32h后，吸弃上清液，更换I号
液，继续培养24h，使细胞生长同步于生长间期。实
验共分4大组：空白对照组、LPS诱导组、肝微粒体
对照组(LM对照组)和血尿停肝微粒体代谢组
(XNT—LM组)，其中血尿停肝微粒体代谢组包括血
尿停低、中、高剂量(2、4、8mg／mL)组。每组设6
个复孔，除空白对照组外，各组均加入LPS(50旭／
mL)50ttL，肝微粒体对照组加肝微粒体混合上清
液4肛L，血尿停肝微粒体代谢低、中、高剂量组分别
加血尿停肝微粒体代谢物10、20、40弘L，余加I号
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月·235·
液使每孔终体积为250ttL。LPS诱导组含LPS10
t-g／mL，肝微粒体对照组含肝微粒体混合液16ttL／
mL，血尿停肝微粒体代谢低、中、高剂量组血尿停的
终质量浓度分别为2、4、8mg／mL。
2．4 GMC及上清液的收集：将加好样品的96孔
培养板放入37℃、5％cO。培养箱，12h后收集无
细胞上清液，测定IL一6及ET一1水平。48h后收集
无细胞上清液，测定LDH水平；同时将抽净上清液
的细胞加I号液150肛L洗涤1次，以除去药物颜色
对MTT测定法的干扰，检测系膜细胞增殖。
2．5指标测定：GMC增殖采用MTT法[41测定。培
养上清液中IL一6、ET一1采用放射免疫法测定。培养
上清液中LDH采用速度法，用全自动生化分析仪
测定。
2．6统计学处理：数据均以z±S表示，多个样本均
数的比较用方差分析，多样本均数间的两两比较用
q检验。
3 结果
3．1复方血尿停对GMC增殖及其LDH的影响：
由表1可知，LPS诱导组的吸光度(A)值及LDH
水平较空白对照组明显提高(P
坏作用。肝微粒体对照组的A值及LDH水平与
LPS诱导组比较差异不显著，表明肝微粒体对
GMC的影响与I号液相当。血尿停肝微粒体代谢
各组的A值较肝微粒体对照组明显降低，呈剂量依
赖趋势。表明血尿停经肝微粒体代谢后可抑制
GMC的增殖。血尿停肝微粒体代谢各组的LDH水
平与肝微粒体对照组比较差异不显著，表明血尿停
的细胞毒作用不明显。
表1复方血尿停对GMC增殖及其LDH水平
的影响(z士s，一一6)
Table1 EffectofCXNTonGMCproliferation
anditsLDHlevel(j±s，n一6)
与空白对照组比较：一P<0．01
与LM对照组比较：△zlp<0．01
。’P<0．01口sblankcontrolgroup
△△P<0．01F5LMcontrolgroup
3．2复方血尿停对GMC产生ET一1及IL一6的影
响：由表2可知，上清液中，LPS诱导组的ET一1与
IL一6水平均较空白对照组明显提高(P
用。而肝微粒体对照组与LPS诱导组比较差异不显
著，表明肝微粒体对GMC分泌ET一1与IL一6的作
用与I号液相当。血尿停肝微粒体代谢各组的
ET一1与IL一6水平较肝微粒体对照组降低(P<
0．01)，且呈剂量依赖趋势，说明血尿停有抑制
GMC释放ET一1与IL一6的作用。
表2复方血尿停对GMC产生ET一1及IL一6
的影响(；±s，n一6)
Table2 EffectofCXNTonproliferationofET一1
andIL～6inGMC(工士s，n=6)
与空白对照组比较：～P
△△P<0．01wLMcontrolgroup
4讨论
目前，中药的体外药效试验有两种药物添加方
式：直接加药和血清药理学方法。由于很多中药是药
效活性和毒性成分的前体，直接加药法不能反应药
物在体内经生物转化后起作用的真实药物成分。虽
血清药理学方法可以避免这种不足，但血清本身是
最有效的促增殖成分[5]，且血清中含多种细胞因子，
以往的研究显示，将含药血清加入GMC培养体系
中，GMC生长极好，远远超过LPS刺激组，严重干
扰血尿停对GMC作用的观察和评价。因此，本实验
借鉴了药物的体外代谢方法，使血尿停与肝微粒体
温孵，以模拟体内代谢过程，然后加入细胞培养体系
中，这样既模拟了体内代谢过程，又避免了血清成分
对实验的干扰，能比较好地评价血尿停对GMC增
殖的影响。
在肾小球肾炎发生与发展过程中，GMC既是
受害者(靶细胞)，又是炎症过程的直接参与者(炎症
细胞)，处于炎症的中心地位口]。GMC增殖及系膜基
质增加是肾小球疾病中最常见而又突出的病理学特
征，也是导致肾小球硬化的主要原因。本实验表明，
万方数据
·236· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月
血尿停经肝微粒体代谢后可抑制GMC的增殖，考
虑与血尿停由生地、水牛角粉、知母、当归、旱莲草、
生蒲黄、虎杖、三七等组成，具有养阴清热、活血化瘀
的功效有关。近年来，大量的实验研究显示，具益气养
阴、清热利湿、活血化瘀作用的中药复方能明显抑制
系膜增生性肾小球肾炎动物模型的GMC增生和系
膜基质增多[7’8]，本实验结果与体内实验结果一致。
IL一6和ET都是GMC的自分泌细胞因子，也
是重要的炎症介质。IL一6在细胞增生激活转导信号
和Ras／Map级联反应或HGF／c—met轴中起重要
作用o]。IL一6在一定浓度范围内以剂量依赖方式诱
导GMC增生[1叫，在肾小球肾炎的发病中有重要作
用[11|。ET是一种具有21个氨基酸的强烈缩血管多
肽，肾脏也是其合成的场所。ET一1是一个能导致
GMC持续增殖的细胞因子，在肾小球肾炎发病机
制中起着重要作用[12,13]。大量的体内外实验研究显
示有多种细胞因子参与GMC的增生、迁移和黏附。
在病理情况下，这些细胞因子刺激GMC过度增生，
增殖的GMC分泌出一系列细胞因子及炎症介质，使
损伤进一步扩大。随着GMC的增殖及系膜基质的增
多，最终导致肾小球硬化、肾单位毁损[14|。血尿停经
肝微粒体代谢后可明显地抑制IL一6和ET一1的产
生，推测血尿停抑制GMC增殖的机制可能是通过抑
制IL一6和ET一1的产生，打破了IL一6、ET一1和
GMC增殖之间的恶性循环而实现的。
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补阳还五汤4类有效部位对局灶性脑缺血大鼠脑梗死体积的影响
唐映红1，邓常青”，刘旺华2，张秋雁2，李花2，贺福元3
(1．湖南中医学院药理教研室，湖南长沙410007；2．湖南中医学院病理生理实验室，湖南长沙410007；
3．湖南中医学院药剂学教研室，湖南长沙410007)
摘 要：目的 研究补阳还五汤(BYHWD)中生物碱、多糖、苷、苷元4类有效部位对大脑中动脉闭塞(MCAO)
后局灶性脑缺血大鼠脑梗死的作用。方法用颈内动脉线栓法建立大鼠局灶性脑缺血模型，检测脑梗死体积，并比
较其神经功能行为评分。结果脑缺血6h，模型组脑梗死体积显著增大(尸
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30171132)；教育部高等学校学术与技术带头人资助项目；湖南省优秀博士论文作者科研项目
作者简介：唐映红(1962一)，女，湖南株洲人，医学硕士，副研究员，主要从事心脑血管药理研究。Tel：(0731)5381272
*通讯作者Tel：(0731)5381111E—mail：dehangq@sohu．corn
万方数据
复方血尿停经肝微粒体代谢后对肾小球系膜细胞的影响
作者： 张红敏， 丁樱， 陈世伟， 王丽英， Zhang Hong-min， DING Ying， CHEN Shi-wei，
WANG Li-ying
作者单位： 张红敏,王丽英,Zhang Hong-min,WANG Li-ying(成都中医药大学,四川,成都,610075)， 丁
樱,DING Ying(河南中医学院第一附属医院,河南,郑州,450008)， 陈世伟,CHEN Shi-wei(四
川大学华西公共卫生学院营养与食品卫生教研室,四川,成都,610041;河南省疾病预防控制中
心,河南,郑州,450003)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(2)
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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200502031.aspx