全 文 ：·1184· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月
药理与临床
香加皮水提取物诱导人胃癌细胞BGC一823凋亡及其作用机制
单保恩，李俊新，张静
(河北医科大学第四医院科研中心暨河北省肿瘤基因诊断、预防和治疗重点实验室，河北石家庄050011)
摘 要：目的 研究香加皮水提取物(CPE)诱导人胃癌细胞BGC一823凋亡及其作用机制。方法采用Giemsa染
色观察细胞凋亡形态学变化；电子显微镜观察凋亡细胞的超微结构变化；流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳方法检测
BGC一823细胞凋亡率、细胞周期和细胞凋亡的DNA水平变化；RT—PCR方法检测细胞凋亡相关基因bcl一2、bax和
survivinmRNA表达水平变化；免疫细胞化学方法检测bcl一2、bax和survivin蛋白表达的变化。结果经CPE作
用后，人胃癌细胞BGC一823出现明显的细胞凋亡形态学变化及超微结构改变，细胞DNA琼脂糖凝胶电泳呈现梯
形图。经250pg／mLCPE处理48h后，多数BGC一823细胞被阻滞在G：／M期，而且细胞发生明显的凋亡变化，
BGC一823细胞凋亡率可达18．9％。CPE可抑制BGC一823细胞bcl和survivinmRNA及蛋白的表达，促进bax
mRNA及蛋白的表达。CPE可明显延长s。。。荷瘤小鼠生存期，且具有剂量依赖性。结论CPE通过阻滞BGC一823
细胞于Gz／M期及诱导BGC一823细胞凋亡发挥抗肿瘤作用，其作用机制与抑制细胞的bcl一2和survivin基因
mRNA及蛋白表达、促进bax基因和蛋白的表达有关。
关键词：香加皮；人胃癌细胞BGC一823；bcl一2；bax；survivin
中图分类号：R286．91 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)08—1184一05
Inductiveeff ctofCortexPeriplocaeextractonapoptosis
ofhumangastriccancercellsBGC一823
SHANBao—en，LIJun—xin。ZHANGJing
(HebeiKeyLaboratoryofGeneDiagnosis，Prophylaxis，andTherapy，ResearchCenter。TheFourthHospital
ofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050011，China)
Abstract：ObjectiveTostudythinductiveeff ctofCortexPeriplocaeextract(CPE)onapoptosisf
humangastriccancercellsBGC一823anditsmechanism．MethodsThecellmorphologyandsuper—mi—
crostructuralhangesofapoptosiswereanalysedbyGiemsast ininga delectricm roscope，respectively．
TheBGC一823apoptosisratio，cellycles，andchangesofapoptosisinDNAlevelwerestudiedbyFlowCy—
tometryandagarosegel lectrophoresis．ThegenesmRNAandproteinxpressionofapoptosis—related
genesbcl-2，bax，andsurvivinwerestudiedbyRT—PCRandimmunologycellchemistrymethod．Results
Aftert eatmentwithCPE，BGC一823cellsshowedsometypicalmorphologicfeaturesanduper—microstruc—
turalchangesofapoptosis．DNAagarosegellectrophoresisshowedcharacteristic“DNAladder”pattern．
MostBGC-823cellswerearrestedatG2／Mphase．SometypicalsubdiploidpeaksbeforeGo／G1phasew re
observed．TheapoptoticrateofBGC一823was18．9％after250tlg／mLCPEtreatedfor48h．Thegene
mRNAandproteinxpressionofbcl一2andsurvivinwereinhibitedbyCPE。whereasthatofbaxwasup—
regulated．CPEcouldenhanceth1ifespanofS180bearingmiceinadose—dependentmanner．Conclusion
CPEcaninhibitthe umorg owthbyarrestingheBGC一823cellcycleatG2／MphaseandinducingBGC一
823apoptosis．ItsmechanismiSrelatedotheinhibitionongenemRNAandproteinxpressionofbcl一2
andsurvivin，andenhancementofthoseofbax．
Keywords：CortexPeriplocae；humangastriccancercellsBGC一823；bcl一2；bax；survivin
香加皮始载于《神农本草经》，系萝蘼科植物杠
柳PeriplocasepiumBunge的根皮，主产于东北和
华北地区‘1|。临床应用主要为强心和祛风湿作用。有
关香加皮抗肿瘤及诱导细胞凋亡的作用尚未见报
道。本实验室在抗肿瘤中药筛选中发现香加皮具有
抗肿瘤作用，可明显延长S。。。荷瘤小鼠生存期。为了
收稿日期：2004—12-22
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30371753)；河北省自然科学基金资助项目(C2004000610)
作者简介：单保恩(1962一)，男，河北省广平县人，教授，博士，博士生导师，研究方向为肿瘤免疫学。
Tel：(0311)6033941—283或290E—mail：baoenshan@yahoo．com．en
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月·1185·
研究香加皮水提取物(CortexP riplocaeextract，
CPE)抗肿瘤的作用机制，本实验对CPE诱导人胃
癌细胞BGC一823凋亡进行了研究。
1材料与方法
1．1 肿瘤细胞株及其培养：人胃癌细胞株BGC一
823由本室保存，于RPMI1640培养液(含10％
胎牛血清、青霉素和链霉素各100U／mL)，置于37
‘C、饱和湿度、5％CO：条件下培养。待细胞进入对数
生长期后，用0．25％胰蛋白酶消化细胞，Hank7 s
液洗涤后，调节成相应的细胞浓度。
1．2 实验动物：纯种BALB／c小鼠，二级，雌性，
6～8周龄，购自中国协和医科大学肿瘤医院动物研
究所，许可证编号：SCXK京2000。
1．3 CPE制备：香加皮购自安国市中药市场，经河
北医科大学生药教研室鉴定。称取香加皮5g于
100mL蒸馏水中浸泡过夜，回流提取1h，用无菌
滤器(NipponMillipore公司)滤过后即得5．0％
(含生药50mg／mL)CPE。经薄层色谱和质谱分
析，CPE符合《中国药典》2005年版一部标准。
1．4 主要试剂：MTT为美国Sigma公司产品；
SDS为美国Biotec公司产品；胎牛血清为杭州四季
青公司产品；RPMI1640培养液和胰蛋白酶为
Gibco公司产品。蛋白酶K、琼脂糖、EDTA、溴化乙
锭、RT—PCR混合酶为华美生物工程公司产品；
200bpDNAladder为鼎国生物工程公司产品；兔
抗人bcl一2单克隆抗体、兔抗人bax单克隆抗体、免
疫组化显色试剂盒为北京中山生物工程公司产品；
抗survivin抗体由美国MD公司提供；Giemsa染
液自制心J。
1．5细胞凋亡分析
1．5．1细胞凋亡的形态学分析：采用Giemsa染色
法[2]。BGC一823细胞(5×106／mL)悬液50mL接
种于细胞培养瓶中，加入终质量浓度分别为250、
125和62．5pg／mLCPE，置37‘C、5％CO。培养箱
中培养48h后，用0．25％胰蛋白酶消化收集细胞
制备细胞涂片，晾干，以醋酸甲醇固定30rain。
Giemsa染液染色15rain，自来水冲洗。晾干后光学
显微镜下观察细胞形态变化。
1．5．2 细胞超微结构分析：细胞处理同上，37℃
培养48h后经2．5％戊二醛前固定，1％锇酸后固
定，逐级乙醇脱水，树脂包埋，超薄切片，经醛酸双氧
铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜(日本日立公司
H一7500型)观察凋亡细胞的超微结构。
1．5．3流式细胞仪分析：细胞处理同上，37℃培
养48h，收集细胞，用预冷的70％乙醇固定细胞，
PBS洗3次，加入不含DNase的RNA酶及PI，室
温反应30min，用流式细胞仪(美国BD公司
FACSCalibur)及Singlehistogramst tistic分析
软件测定细胞周期DNA变化。
1．5．4DNA琼脂糖凝胶电泳[3]：同上收集细胞，经
Hank
7s液洗涤，加入细胞裂解液，混匀后加入10％
SDS和蛋白酶K(终质量浓度100mg／L)，55‘C
水浴3h，冷却后加等体积Tris—HCl饱和酚，充分
震荡，4℃、12000r／min离心20min。吸取上清液
加等体积Tris—HCl饱和酚和氯仿一异戊醇(24：1)
重复抽提。吸取上清液加等体积无水乙醇和1／10
体积NaAc沉淀DNA，用70％乙醇洗去残留的有
机物，用去离子水溶解DNA。取DNA与溴酚蓝混
匀，于1．5％琼脂糖凝胶中(含EB终体积分数5×
10_5)，在80V电压下电泳30min，用凝胶成像系
统(美国Image公司Fotodyne)分析DNA条带。
1．6 bcl一2、bax和survivinmRNA表达的分析：
BGC一823细胞(5×106／mL)悬液1mL，加入终质
量浓度为250pg／mLCPE，37℃培养48h，收集细
胞，按Trizol试剂说明常规提取各组细胞RNA，进
行RT—PCR扩增，扩增产物经1．5％琼脂糖凝胶电
泳，应用Gel—pro凝胶分析软件对电泳谱带mRNA
进行基因表达差异分析。各引物(上海生物工程技
术服务有限公司合成)序列及其扩增条件见表1。
表1 bcl一2、bax和survivin引物序列及其PCR扩增条件
Table1 Sequenceofbcl一2，bax，andsurvivinprimers
ndconditionsofPCRamplification
基因名称 引物序列
退火温
度／C
65
产物长
g[／bp
388bcl一2Ez] 5’一CGACTTCGCCGAGATGTCCAGCCAG一3‘
5-ACTTGTGGCCCAGATAGGCACCCAG一3’
bax[33 5-GGCCCACCAGCTCTGAGCAGA一3’
5-GCCACGTGGGcGTCCCAAAGT一3‘
survivinE435-CGGCATGGGTGCCCCGACGTTG一3’
5『一TTGAGGCCTCTGGCCGGAGC一3’
B-actinL5J5ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG一3‘60838
5-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC一3’
1．7 bcl一2、bax和survivin蛋白表达的分析：细胞
处理同1．6项，37℃培养48h，收集细胞，取1～2
滴细胞悬液涂于载玻片，晾干。95％乙醇4℃固定
30rain，室温下用0．3％过氧化氢甲醇溶液作用30
rain(用以阻断内源性过氧化物酶的活性)，用10％
羊血清封闭20min，分别滴加抗bcl一2、bax和sur—
vivin抗体(一抗)，4‘C过夜，用PBS冲洗3次，滴
加链霉素蛋白一过氧化酶溶液(用以标记第二抗
万方数据
·1186· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月
体)，孵育30min，PBS冲洗3次，加入辣根酶标记
链霉卵白素，DAB溶液显色15～20min；流水冲洗
后，苏木素染色5min，常规脱水、透明、封片。同时
用正常羊血清取代第一抗体，作为阴性对照。bcl一2
和bax定位于细胞质和细胞膜，survivin定位于细
胞浆中。细胞染色呈棕褐色或棕黄色为阳性。光镜
下随意选取5个高倍视野，计算阳性细胞比率。
1．8 CPE对S。。。荷瘤小鼠生存期的影响：收集S。。。
细胞，调整细胞浓度为5×106／mL，小鼠右腋皮下
局部消毒后，每只小鼠接种0．2mL。24h后，实验
动物随机分为5组，空白组ig生理盐水0．2mL／10
g，阳性对照组ig环磷酰胺10g／kg，实验组各组分
另0 igCPE2．5、1．25、0．625g／kg。连续iglOd，记
录小鼠死亡时间，计算生命延长率。
生命延长率一(实验组平均存活时问一空白组平均存活
时间)／空白组平均存活时间×100％
1．9 统计学处理：所有实验均重复6次，数据用
z±S表示，采用SPSS10．0软件对数据进行分析，
计量资料统计采用t检验；相关性采用Spearman
相关检验。
2结果
2．1 CPE可诱导BGC一823细胞发生凋亡的形态
学和超微结构变化：CPE作用后，倒置显微镜下可
见BGC一823细胞发生凋亡的形态学变化，随药物质
量浓度的增加，凋亡细胞数量也明显增加；而对照组
细胞生长良好，细胞透明，颗粒较少，细胞核隐约可
见。经Giemsa染色，CPE作用过的细胞在光学显微
镜下可见细胞质浓缩，细胞变圆，核着色不均匀，核
物质边集成块状，部分核膜破裂，核物质外泄，并随
药物质量浓度增加，形态学发生变化的细胞比例也
显著增加。而对照组细胞呈菱形或梭形，形态饱满，
较大，细胞核染色均匀，核仁清晰可见。透射电镜下
(放大5000～200 0倍)可见实验组细胞体积缩
小，微绒毛减少，胞质浓缩，胞核局部向外呈锐角突
起，核染色质高度浓缩，电子密度增高，边集于核膜
下，有的核染色质呈半月形，有的出现核固缩和核碎
裂，偶见凋亡小体。而对照组细胞未见细胞凋亡超微
结构变化(图略)。
2．2 CPE对BGC一823细胞凋亡率的影响：CPE处
理48h的BGC一823细胞，经流式细胞仪分析，在
DNA直方图的G，期峰前出现明显的细胞凋亡峰，
随着CPE质量浓度的增加细胞凋亡率明显上升，呈
剂量依赖关系。结果见表2。
2．3 CPE对BGC一823细胞周期的影响：经CPE
处理48h的BGC一823细胞的细胞周期发生明显变
化(表2)，G。／M期细胞明显增多，G。／O，期细胞比
率显著下降，多数细胞阻滞在G：／M期。
2．4 CPE诱导细胞凋亡可表现在DNA水平：细胞
DNA经凝胶电泳后，对照组细胞DNA在加样孔附
近有一条清晰条带，而经CPE处理的细胞DNA出
现较典型的梯状电泳带(图1)。
表2 CPE对BGC一823细胞凋亡率和细胞周期
的影响(；±s，n一6)
Table2 EffectofCPEonapoptoticrateandcell
cyclesofBGC一823(；±s，n一6)
P／ 细胞周期／0A 凋亡率
组别 ’——
(pg·mL1) Go／G1 S G2／M ／％
对照 一
CPE250
125
62．5
与对照组比较：+P+P<0．05。。PⅣ陆出啊
1
2
3
4
1～3—62．5、125、250弘g／mLCPE组4一对照组
1—3—62．5，125，250／*g／mLCPEroup4-controlg up
图1 BGC一823细胞DNA琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig．1Agarosegelelectrophoretogram
OfBGC一823cellsDNA
2．5 CPE影响BGC一823细胞bcl一2、bax和sur—
vivinmRNA的表达：未经CPE作用的BGC一823
细胞的bcl一2、bax和survivinmRNA校正值(bcl一
2／8一actin、bax／13一aetin和survivin／13一actin)分别为
0．722±0．335、0．224±0．120、0．649±0．320；而经
250／zg／mLCPE作用后，BGC一823细胞的bcl一2、
bax和survivinmRNA校正值分别为0．127±
0．219、0．645±0．240、0．159±0．160。CPE作用后
细胞中的bcl一2和survivin基因表达水平明显低于
对照组细胞(P高于对照组(JP2．6 CPE对BGC一823细胞bcl一2、bax和survivin
蛋白表达水平的影响：CPE作用前后BGC一823细
胞中均可见到棕黄色颗粒，但是CPE作用后细胞内
bcl一2和survivin蛋白表达水平明显较对照组减少，
而bax蛋白表达水平明显增加。结果见表3。
i
2
2
7(u
6
O
O
O
0±土±±
9
9
7
6
8
．8
6
7
0
1
1
7
O
8
8
Cu
5
4‘3±+一±+一
3
1
3
O
1
0J
7
3
2
2
2
2
6
3
5
4
5
3
4
4士±±±1^t^口1
3
2
2
3
2
2
2
2
，L
4
1
5
7
6，u
4土±±士
6
5
1
0u
5
Oo
O
3
5
4
5
5
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月·1187·
2．7 CPE对S。。。荷瘤小鼠生存期的影响：CPE可
明显延长S，。。荷瘤小鼠生存期，结果见表4。
表3 CPE对BGC一823细胞bcl一2、bax和survivin
蛋白表达的影响(z±S，n一6)
Table3 EffectofCPEonproteinxpressionofbcl一2，bax，
andsurvivininBGC一823cells(；+S，n一6)
组别
P／
(／*g·mL
蛋白表达阳性细胞／％
对照 一 88．32±9．2829．83±7．5493．54士7．65
CPE 250 43．55±6．77+。91．33±9．18’‘48．17土8．56。’
与对照组比较：一P’’P<0．01VScontrolgroup
表4 CPE对$180荷瘤小鼠生存期的影响(x±s，聆一6)
Table4 EffectofCPEonlifespanofS180
bearingmice(x_4-s，n一6)
与对_}!{l组比较：+P<0．05
。P<0．05口scontrolgroup
3讨论
本实验结果表明，香加皮提取物(CPE)作用于
BGC一823细胞后，可诱导细胞发生较典型的凋亡形
态学变化及超微结构改变，如胞体缩小，胞质浓缩，
胞核向外呈锐角突起，染色质浓缩，密度增高，边集
于核膜下或呈新月形，核碎裂以及凋亡小体形成等。
流式细胞仪检测结果显示，CPE作用过的细胞，其
DNA直方图上可见G。期峰前出现明显的细胞凋亡
峰亚G，期峰，可诱导凋亡，凋亡率可达18．9％。
肿瘤发生发展的基础是基因的改变，如基因突
变、失活以及过度表达或表达降低等，进而引起肿瘤
细胞周期变化。CPE能明显抑制BGC一823细胞的
周期转换，使G。／M期细胞明显增多。G：／M期阻
滞，使肿瘤细胞停止在G。期限制点进行自身修复，
以决定是否能克服G：期限制点以继续完成细胞分
裂，还是停留在G：／M期发生凋亡。药物作用过的
肿瘤细胞在一定时间内无法克服G。／M期阻滞时，
就会发生G。／M期细胞凋亡[6]。细胞凋亡时的主要
生化特征是细胞核内限制性内切酶活化，将DNA
链在核小体之间切口，使核内DNA断裂，形成
180～200bp整倍数的核酸片段。本实验结果显示，
CPE作用后，BGC一823细胞DNA琼脂糖凝胶电泳
呈现典型的细胞凋亡梯形改变。
为探讨CPE诱导细胞凋亡的机制，本实验研究
了CPE作用前后BGC一823细胞bcl一2、bax和sur—
vivin基因和蛋白表达的变化。bcl一2蛋白是一种细
胞内膜蛋白，主要位于线粒体膜、内质网和核膜
上[7]，在多种肿瘤组织中表达，具有抗凋亡作用[8]。
bax基因编码一种相对分子质量为21000的蛋白
质，属于bcl一2家族成员。该蛋白的组织表达与分布
与bcl一2相似但作用相反，可以促进细胞凋亡[9]。其
促细胞凋亡机制可能是直接激活死亡效应因子cas—
pasesElo]或通过改变细胞膜通透性，引起细胞色素c
释放并使某些离子和小分子物质通过细胞膜口1’”]。
survivin基因是一个新近发现的细胞凋亡抑制基
因[13_4|，其编码的蛋白质是凋亡抑制蛋白(in—
hibitorofapoptosisprotein，IAP)家族的成员，是
一种胞浆蛋白。survivin表达于胚胎和发育期的胎
儿组织，而在终末分化的成人组织中则表达减少乃
至消失，但在转化细胞系和许多人类肿瘤组织中再
度表达[1乳16]。survivin通过直接抑制caspase一3和
caspase一7，使二者分离，从而抑制caspase蛋白酶活
性[17|。本实验结果显示，CPE作用后，BGC一823细
胞的bcl一2和survivinmRNA表达减少，而bax
mRNA表达增加；免疫细胞化学结果显示，bcl一2和
survivin蛋白表达减少，bax蛋白表达增加，蛋白水
平和基因水平结果相符。
前期实验研究了CPE对小鼠脾细胞(fie为正常
细胞和免疫细胞)的作用，显示出CPE对脾细胞的
增殖反应有促进作用，表明CPE对正常细胞无抑制
作用(该结果在本实验中未显示，将另文发表)。
为了进一步证实CPE的体内抗肿瘤作用，本实
验还研究了CPE对s。。。荷瘤小鼠生存期的影响。结
果表明CPE可明显延长S，。。荷瘤小鼠生存期，且具
有剂量依赖性。高、中剂量组荷瘤小鼠生存期明显延
长，与对照组相比差异显著，而低剂量组与对照相比
较差异不显著。
本实验结果提示，CPE抑制肿瘤细胞BGC一823
细胞增殖，使其阻滞于G。／M期；可诱导肿瘤细胞
凋亡，其机制可能是通过下调bcl和survivin基因
和蛋白的表达，上调bax基因和蛋白表达来实现
的，这些作用的进一步研究，有利于香加皮抗肿瘤作
用的开发和利用。
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2．DepartmentofBiomedicalEngineering，MedicalCollegeofShandongUniversity，Jinan250012，China；
3．DepartmentofH matologyandOncology，QiluHospitalofShandongUniversity，Jinan250012，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatethem chanismsoforidonininducingapoptosisonacute
leukeamiaNB4cellsanditsmechanism．MethodsNB4cellsinculturemediuminvitroweregivenwith
differentconcentrations(8，16，24，and32／1mol／L)ofori onin．Theinhibitoryrateofthecellswasmea—
suredbyMTTassay，cellapoptoticratewasdetectedbyflowcytometry(FCM)，morphologyofap ptosis
wasobservedbyHoechst33258fluorescencestaining，DNAfragmentationw sassayedbyagarosegel
electrophoresis，caspase一3expres ionwasdetectedbyWesternblotting，andcaspase一3activitywasas—
sayedwithcolorimetricassaykitbeforeandafterapoptosisccurred．ResultsOridonin(over16Fmol／L)
couldinhibitthegrowthofNB4cellsandcauseapoptosissignificantly，thesuppressionwasb thinatime—
andose—dependentmanner．Markedchangesofapoptosisincludifigcondensationofehromatinndnuclear
fragmentationwereobservedveryclearlybyHoechst33258fluorescencestaininga dacharacteristic“lad—
der”ofDNAfragmentswaselicitedbyagarosegellectrophoresis；Westernblotanalysisr vealedthat
caspase一3wasactivatedbythelOSSofcaspase一3proenzyme(32kDa)andtheappearanceofits20kDasub—
unit，andthatalongwiththeapoptoticpro essca pase一3activitywasincreasedconcurrently．Conclusion
Oridonincan duceapoptosisinNB4cellsviactivationofcaspase一3．TheseresultswilIprovidelaborato一
收稿日期：2005一Ol一07
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30300312)
作者简介：刘加军(1966)，山东省日照市人，主治医师，讲师，硕士生导师，山东大学博士，中山大学博士后，主要从事血液肿瘤的分子
生物学及细胞凋亡机制等研究。Tel：(020)85516867—2227
万方数据
香加皮水提取物诱导人胃癌细胞BGC-823凋亡及其作用机制
作者： 单保恩， 李俊新， 张静， SHAN Bao-en， LI Jun-xin， ZHANG Jing
作者单位： 河北医科大学第四医院,科研中心,暨河北省肿瘤基因诊断、预防和治疗重点实验室,河北,石
家庄,050011
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(8)
被引用次数： 17次

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