全 文 ：·药理与临床·
宝藿苷2Ⅰ对人食管癌细胞 Eca2109 增殖及细胞周期的影响
刘晓霞1 ,刘红珍1 ,陈剑华1 ,陈育民1 ,单保恩2 3
(11 河北工程大学医学院 ,河北 邯郸 　056002 ; 21 河北医科大学第四医院 科研中心 ,河北 石家庄 　050011)
摘 　要 :目的 　研究香加皮中宝藿苷2Ⅰ对人食管癌细胞 Eca2109 细胞周期的影响及其作用机制。方法 　采用
M T T 法分析不同质量浓度宝藿苷2Ⅰ(1215、25、50μg/ mL) 分别作用 24、48、72 h 后 ,对 Eca2109 细胞增殖的影响 ;
流式细胞术分析宝藿苷2Ⅰ对 Eca2109 细胞周期的影响 ; RT2PCR 技术检测宝藿苷2Ⅰ对 Eca2109 细胞 Cyclin B1
mRNA 表达的影响 ;Western blotting 方法检测宝藿苷2Ⅰ对 Eca2109 细胞 Cyclin B1 蛋白表达的影响。结果 　25、
50μg/ mL 宝藿苷2Ⅰ均可明显抑制 Eca2109 细胞的增殖 ( P < 0105) ,作用 48 h 的 IC50为 2418μg/ mL。25、50μg/ mL 宝
藿苷2Ⅰ作用 48 h 后 ,随宝藿苷2Ⅰ质量浓度的增加 ,Eca2109 细胞的 G0 / G1期细胞比例明显下降 , G2 / M 期细胞比例明显
提高 ,细胞的 Cyclin B1 蛋白及 mRNA 表达水平降低 ,与对照组相比均有显著性差异 ( P < 0101) 。结论　香加皮宝藿
苷2Ⅰ可抑制 Eca2109 细胞增殖 ,使细胞周期阻滞 ,该作用可能与下调细胞 Cyclin B1 表达有关。
关键词 :香加皮 ; 宝藿苷2Ⅰ; 食管癌 ; 细胞周期 ; Cyclin B1
中图分类号 :R286191 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 1021590204
Effect of baohuoside2Ⅰon proliferation and cell cycle of human
esophageal carcinoma cell Eca2109
L IU Xiao2xia1 , L IU Hong2zhen1 , CH EN Jian2hua1 , CH EN Yu2min1 , SHAN Bao2en2
(11 Medical College of Hebei University of Engineering , Handan 056002 , China ; 2. Research Center ,
Fourth Hospital of Hebei Medical University , Shijiazhuang 050011 , China)
Abstract : Objective 　Effect of baohuoside2Ⅰf rom Cortex Peri p locae on cell cycle of human esop hage2
al carcinoma cell Eca2109 and it s mechanism were st udied. Methods 　After t reat ment wit h baohuoside2Ⅰ
at different concent ration (12. 5 , 25 , and 50μg/ mL) for 24 , 48 , and 72 h , t he inhibitory effect on prolif2
eration of Eca2109 cells was analyzed by M T T met hod. After t reat ment wit h baohuoside2Ⅰunder different
concent ration (12. 5 , 25 , and 50μg/ mL) for 48 h , cell cycle of Eca2109 cells were measured wit h flow cy2
tomet ry ( FCM) ; The exp ression of Cyclin B1 mRNA was detected by R T2PCR technique. The expression
of Cyclin B1 protein was detected by Western blot ting. Results 　Baohuoside2Ⅰof 25 and 50μg/ mL inhibi2
ted t he proliferation of Eca2109 cells significantly in an effect2concent ration manner ( P < 0105) , t he IC50
was 24. 8μg/ mL . After t reatment wit h Baohuoside2Ⅰof 25 and 50μg/ mL for 48 h , wit h t he concent ra2
tion increased , t he cell cycles of Eca2109 cells were changed that G0 / G1 p hase were reduced and G2 / M
p hase were increased , t he expression level of Cyclin B1 p rotein and mRNA were decreased and bot h of
them were significant ( P < 0101) , compared wit h t he cont rol group . Conclusion 　Baohuoside2Ⅰof Cortex
Peri p locae could inhibit t he p roliferation and arrest t he cell cycles , which may associate with t he down2
regulation of Cyclin B1 mRNA expression.
Key words : baohuoside2Ⅰ; human esop hageal carcinoma ; cell cycles ; Cyclin B1
　　随着调控细胞周期分子机制的阐明 ,越来越多
的研究表明 ,肿瘤是一类细胞周期疾病。细胞周期
异常 ,最终导致细胞生长失控 ,表现出恶性生物学行
为。而细胞周期蛋白 Cyclin B1 的异常表达对细胞
周期产生重要影响。
中药香加皮 ( Cortex Peri p locae) 为萝藦科植
物杠柳 Peri ploca se pi um Bunge 的干燥根皮[ 1 ] ,含
有强心苷类、萜类等多种化学成分 ,具有抗炎、强心、
促进神经生长、兴奋神经系统抗肿瘤等药理作
用[2～4 ] 。本课题组前期研究结果显示 ,香加皮水提
·0951· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
3 收稿日期 :2009202224　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30772752)
作者简介 :刘晓霞 (1976 —) ,女 ,河北省永年县人 ,讲师 ,硕士 ,研究方向为肿瘤免疫学。
Tel : (0310) 3115952 　E2mail : givesunny @163. com3 通讯作者　单保恩　E2mail : baoenshan @yahoo. com. cn
取物和杠柳苷等成分对多种肿瘤细胞都有较强的抑
制作用[5 ,6 ] 。同时 ,研究也发现香加皮中也含有黄
酮类成分 ,经鉴定为宝藿苷2Ⅰ,而茶多酚[7 ] 、槲皮
素[ 8 ] 、葛根素[9 ] 、黄芩素[10 ] 等多种黄酮类化合物均
已证实对肿瘤细胞有抑制作用。但是关于宝藿
苷2Ⅰ对肿瘤细胞的作用 ,还未见报道。因此 ,本实验
研究香加皮宝藿苷2Ⅰ对人食管癌细胞 Eca2109 的增
殖、细胞周期及细胞周期蛋白 Cyclin B1 表达的影响 ,
同时也为香加皮的进一步开发提供理论依据。
1 　材料与方法
111 　受试物与试剂 :香加皮购买于河北省中医院中
药房 ,经河北医科大学药学院药理室聂凤褆教授鉴
定。香加皮正丁醇相提取物宝藿苷2Ⅰ由华北制药
集团新药研究开发中心提取 (黄色粉末 ,质量分数 >
96 %) ,用 DMSO 溶解 , RPMI 1640 培养基稀释
(DMSO 终体积分数小于 011 %) 。RPMI 1640、Tr2
izol 及 R T2PCR 酶混合物为美国 Gibco 公司产品。
M T T、碘化丙啶 ( PI) 、DMSO 及兔抗人 Cyclin B1
单克隆抗体、羊抗兔 Ig G2PE 二抗为美国 Sigma 公
司产品 ,Cyclin B1 及β2actin 引物由上海生物工程
技术服务有限公司合成 ,顺铂为山东齐鲁制药厂产
品 (批号 7120191DB) 。
112 　细胞株及其培养 :人食管癌细胞 Eca2109 由河
北医科大学第四医院科研中心提供。用含 10 % 胎
牛血清、100 U/ mL 青霉素和 100 U/ mL 链霉素的
RPMI 1640 完全培养基 ,置于 37 ℃、5 % CO2 和饱
和湿度条件下培养。
113 　M T T 法检测宝藿苷2Ⅰ对 Eca2109 细胞增殖
的影响 :取对数生长期 Eca2109 细胞 ,调整细胞浓度
为 1 ×105 / mL ,接种于 96 孔培养板 ,每孔 100μL
(含细胞数为 1 ×104 ) 。实验组加入含不同质量浓
度宝藿苷2Ⅰ(1215、25、50 μg/ mL ) 的培养基 100
μL ,阴性对照组加入 RPMI 1640 培养基 9916μL
和 DMSO 014μL ,阳性对照组加入含顺铂 (30μg/
mL) 的培养基 100μL ,每组均设 3 个复孔 ,置饱和
湿度、37 ℃、5 % CO2 培养箱中分别培养 24、48、72
h ,每天用倒置显微镜观察细胞形态学变化 ,实验终
止前每孔加入 M T T (5 mg/ mL) 20μL ,继续培养
4 h ,弃上清液 ,每孔加入 150 μL DMSO ,振荡 10
min ,待结晶溶解后 ,用酶标仪于 570 nm 波长测定
吸光度 ( A ) 值。并按下式计算细胞生长抑制率
(inhibitory rate , IR) ,用 POMS 软件计算半数抑制
浓度 ( IC50 ) 。
IR = (1 - 实验组平均 A 值/ 对照组平均 A 值) ×100 %
114 　流式细胞术测定细胞周期 :收集经不同质量浓
度宝藿苷2Ⅰ(12. 5、25、50μg/ mL ) 作用 48 h 后的
Eca2109 细胞 ,1 000 r/ min ,离心 5 min ,PBS 洗涤 3
次 ,1 000 r/ min ,每次离心 5 min ,然后将细胞于
70 % 乙醇中 ,4 ℃固定 2 h ,37 ℃RNA 酶处理1 h ,
与 PI 室温反应 10 min ,行 PI 染色 ,流式细胞仪分
析细胞周期 ,每个质量浓度样本均重复 3 次。
115 　R T2PCR 检测 Cyclin B1 mRNA 表达 :收集经
不同质量浓度宝藿苷2Ⅰ(12. 5、25、50μg/ mL) 作用
48 h 后的 Eca2109 细胞 ,按 Trizol 试剂说明常规提
取各组细胞总 RNA ,进行 R T2PCR 扩增 ,扩增产物
在 115 % 琼脂糖凝胶中 ,恒压 80 V 电泳 30 min
后 ,用凝胶成像系统观察电泳结果 ,扩增的 Cyclin
B1 基因产物的量与内参照基因 (β2actin) 应用 gel2
pro 凝胶分析软件对电泳谱带进行分析 ,用校正值
(Cyclin B1/β2actin) 表示 mRNA 水平。重复 3 次。
引物序列及扩增条件见表 1。
表 1 　Cyclin B1 及β2actin PCR 引物序列及扩增条件
Table 1 　Primer sequences and amplif ication conditions
of PCR for Cyclin B1 andβ2actin
基因名称 引物序列
退火温
度/ ℃
产物长
度/ bp
Cyclin B1 5′2AA GGCGAA GA TCAACA TGGC23′ 55 687
5′2A GTCACCAA TTTCTGGA GGG23′
β2actin 5′2A TCTGGCACCACACCTTCTACAA TGA GCTGCG23′ 55 838
5′2CGTCA TACTCCTGCTTGCTGA TCCACA TCTGC23′
116 　Western blot ting 方法检测 Cyclin B1 蛋白表
达 :收集经不同质量浓度宝藿苷2Ⅰ (1215、25、50
μg/ mL) 作用 48 h 后的 Eca2109 细胞 ,常规提取细
胞蛋白 ,Lowry 法蛋白定量。取蛋白 50μg 与 SDS2
PA GE 凝胶电泳加样缓冲液均匀混合 ,100 ℃水浴
5 min ,1 000 r/ min 离心 ,取上清液进行 SDS2PA GE
电泳 ,电泳完毕后电转法印 PVDF 膜 ,丽春红染色
10 min ,以确定目的蛋白转膜情况。加入 2 mL 5 %
脱脂牛奶封闭 1 h 后 ,加兔抗人 Cyclin B1 和β2
actin 单克隆抗体 ,4 ℃静置过夜 ,加辣根过氧化物
酶 ( HRP)2羊抗兔 Ig G ,37 ℃孵育 1 h , PBST 漂
洗 ,DAB 显色 ,分析蛋白条带 ,结果以测定蛋白条带
与β2actin 的积分吸光度比值表示 Cyclin B1 蛋白的
相对表达水平。每个质量浓度均重复 3 次。
117 　统计学处理 :应用 SPSS 1115 软件对所有数据
进行统计学处理 ,结果以 x ±s 表示 ,两组间均数比较
用 t 检验 ,多组间均数比较采用单因素方差分析。
2 　结果
211 　宝藿苷2Ⅰ对 Eca2109 细胞增殖的抑制作用 :
·1951·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
1215、25、50μg/ mL 的宝藿苷2Ⅰ均可抑制 Eca2109
细胞增殖 ,且随宝藿苷2Ⅰ质量浓度的增加和作用时
间的延长抑制作用增强 , 50 μg/ mL 宝藿苷作用
48 h 时抑制率最高达 96186 % ,25、50μg/ mL 组与
阴性对照组相比差异均有统计学意义 ( P < 0105) 。
宝藿苷2Ⅰ作用 Eca2109 细胞 48 h 的 IC50 为 2418
μg/ mL (图 1) 。
与对照组比较 : 3 P < 01053 P < 0105 vs cont rol group
图 1 　宝藿苷2Ⅰ对 Eca2109 细胞增殖的影响 ( x ±s , n = 3)
Fig. 1 　Effect of baohuoside2Ⅰon proliferation
of Eca2109 cells ( x ±s , n = 3)
212 　宝藿苷2Ⅰ对 Eca2109 细胞周期的影响 :经不
同质量浓度 (1215、25、50μg/ mL ) 宝藿苷2Ⅰ处理
48 h 后 , Eca2109 细胞的 G0 / G1 期细胞分别为
56151 %、38111 %、29133 % , 对 照 组 细 胞 为
57162 %。实验组 G2 / M 期的细胞分别为 16163 %、
20153 %、27155 % ,对照组细胞为 12187 %。随宝藿
苷2Ⅰ质量浓度增加 , G0 / G1 期的细胞比例明显降
低 , G2 / M 期的比例明显增高 ,25、50μg/ mL 处理组
细胞与对照组相比差异有统计学意义 ( P < 0101) ,
而 1215μg/ mL 处理组与对照组相比较差异无统计
学意义 ( P > 0105) 。实验组和对照组 S 期细胞的比
例未见显著差异 ( P > 0105) 。见表 2。
213 　宝藿苷2Ⅰ对 Eca2109 细胞 Cyclin B1 mRNA
表 2 　宝藿苷2Ⅰ对 Eca2109 细胞细胞周期的影响
( x ±s , n = 3)
Table 2 　Effect of baohuoside2Ⅰon cell cycle
of Eca2109 cells ( x ±s , n = 3)
宝藿苷2Ⅰ
(μg ·mL - 1)
细胞周期/ %
G0/ G1 S G2/ M
0 (对照) 571 60 ±5141 35193 ±01 94 121 87 ±11 51
121 5 561 50 ±3199 29153 ±41 67 161 63 ±11 81
25 381 10 ±1146 3 3 25160 ±51 20 201 53 ±11 66 3 3
50 291 33 ±0175 3 3 23183 ±01 95 271 55 ±31 24 3 3
　　与对照组比较 : 3 3 P < 0101
　　3 3 P < 01 01 vs cont rol group
表达的影响 :经不同质量浓度宝藿苷2Ⅰ处理 48 h
后。25、50μg/ mL 处理组 Eca2109 细胞 Cyclin B1
mRNA 表达水平[校正值 (Cyclin B1/β2actin) 分别
为 01473 ±0102、01280 ±0104 ]显著低于对照组 [校
正值 (01508 ±0103) ] ( P < 0101 , n = 3) ,1215μg/
mL 处理组 [校正值 (01175 ±0103 , n = 3) ]与对照
组间差异无统计学意义 ( P > 0105 , n = 3) ,见图 2。
图 2 　宝藿苷2Ⅰ对 Eca2109 细胞 Cyclin B1 mRNA
表达的影响
Fig. 2 　Effect of baohuoside2Ⅰon expression
of Cyclin B1 mRNA in Eca2109 cells
214 　宝藿苷2Ⅰ对 Eca2109 细胞 Cyclin B1 蛋白表
达的影响 :经不同质量浓度的宝藿苷2Ⅰ处理 48 h
后 ,25、50μg/ mL 处理组 Eca2109 细胞 Cyclin B1
蛋白表达水平分别为 01163 ±01021、01042 ±
01005 ,显著低于对照组 ( 01362 ±01014) ( P <
0101 , n = 3) ,1215μg/ mL 处理组 (01329 ±01009)
与对照组间差异无统计学意义 ( P > 0105 , n = 3) 。
随着宝藿苷2Ⅰ质量浓度的增加 , Eca2109 细胞 Cyc2
lin B1 蛋白表达逐渐降低 ( P < 0101 , n = 3) ,见图 3。
图 3 　宝藿苷2Ⅰ对 Eca2109 细胞 Cyclin B1
蛋白表达的影响
Fig. 3 　Effect of baohuoside2Ⅰon expression
of Cyclin B1 protein in Eca2109 cells
3 　讨论
　　中药香加皮又名北五加皮、杠柳皮 ,主产于河
北、河南、山东、山西等地[1 ,2 ] ,性温 ,味辛、苦 ,本课
题组对其水提物及其杠柳苷成分的抗肿瘤活性已有
报道[ 4 ,5 ] ,但尚未见不同香加皮提取物对食管癌作
·2951· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
用及其机制的研究报道。本实验研究了香加皮正丁
醇相提取物宝藿苷2Ⅰ成分对人食管癌细胞 Eca2109
细胞周期及周期蛋白 Cyclin B1 表达的影响。
实验结果显示 ,25、50μg/ mL 宝藿苷2Ⅰ可明显
抑制 Eca2109 细胞的增殖 ,作用 48 h 的 IC50 为
2418μg/ mL 。Eca2109 细胞经 25、50μg/ mL 宝藿
苷2Ⅰ处理 48 h 后 , G0 / G1 期细胞比例明显减少 ,
G2 / M 期细胞逐渐增多 ,S 期细胞减少 (但变化不明
显 ,可能与宝藿苷2Ⅰ抑制 Eca2109 细胞增殖无关) ,
细胞周期被阻滞在 G2 / M 期。这可能是其抑制
Eca2109 细胞增殖的原因之一。另外 ,经 25、50μg/
mL 宝藿苷2Ⅰ处理 48 h 后 , Eca2109 细胞中 Cyclin
B1 mRNA 表达随宝藿苷2Ⅰ质量浓度的增加而降
低 ,同样 ,Cyclin B1 蛋白表达水平也随宝藿苷2Ⅰ质
量浓度的增加而降低。提示宝藿苷2Ⅰ可能是通过
降低 Cyclin B1 表达 ,减少 Cyclin B12CD K1 复合物
的形成 ,阻止细胞从 G2期进入 M 期 ,同时也阻止 M
期过程 ,从而将细胞周期阻滞在 G2 / M 期。
以上实验结果表明 ,香加皮宝藿苷2Ⅰ可显著抑
制 Eca2109 细胞增殖。该作用可能与下调细胞周期
蛋白 Cyclin B1 的表达 ,从而引起细胞周期阻滞有
关。这些作用的进一步研究 ,可为香加皮抗肿瘤作
用的开发和利用奠定基础。
参考文献 :
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白果内酯对谷氨酸兴奋毒性致神经损害的保护作用
徐　静1 ,孙长凯2 3 ,王冬梅1 ,徐 　红1 ,张 　健2 ,张玉梅2 ,马 　辉2 ,王 　禄2 ,吴兰香2
(11 大连医科大学 机能学实验室 ,辽宁 大连 　116044 ; 21 大连医科大学脑疾病研究所 ,辽宁 大连 　116044)
摘 　要 :目的 　观察不同剂量白果内酯对谷氨酸致海马神经元损害的影响 ,以探讨白果内酯在抗兴奋毒性神经损
害中的应用价值。方法 　原代培养新生 SD 大鼠海马神经元 ,建立谷氨酸诱导的兴奋毒性模型 ;采用台盼蓝染色、
TUN EL 染色凋亡神经元测定及乳酸脱氢酶 (LD H) 活性测定的方法观察不同剂量白果内酯的神经保护作用 ,并
与谷氨酸 NMDA ( N2甲基2D2天门冬氨酸盐) 受体非竞争性拮抗剂 M K2801 的神经保护作用相比较。结果 　在一
定剂量范围内 ,白果内酯可提高谷氨酸损伤的海马神经元细胞的存活率、降低细胞凋亡率、减少细胞中 LD H 的漏
出 ,具有剂量依赖性 ,于 100μmol/ L 剂量下呈现最佳神经保护效果 ,但弱于 M K2801 (浓度为 10μmol/ L) 。结论
白果内酯对谷氨酸诱导的兴奋毒性神经损害具有保护作用。
关键词 :白果内酯 ; 谷氨酸 ; 海马神经元
中图分类号 :R28611 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 1021593205
Neuroprotective effect of bilobalide against neuronal damage by glutamate2induced excitotoxicity
XU Jing1 , SUN Chang2kai2 , WAN G Dong2mei1 , XU Hong1 , ZHAN G Jian2 ,
ZHAN G Yu2mei2 , MA Hui2 , WAN G L u2 , WU Lan2xiang2
(11 Functional Laboratory , Dalian Medical University , Dalian 116044 , China ; 2. Institude for Brain Disorders ,
Dalian Medical University , Dalian 116044 , China )
·3951·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
3 收稿日期 :2008212205　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30400143)
作者简介 :徐　静 (1977 —) ,女 ,辽宁省大连市人 ,硕士 ,于大连医科大学机能学实验室从事教学、科研工作 ,研究方向为神经生理。
Tel : 13940950516 　E2mail : jingjingflash @163. com