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肉苁蓉组织培养研究进展及应用前景
杨 坤, 焦智浩, 张根发Ξ
(北京师范大学生命科学学院, 北京 100875)
摘 要: 肉苁蓉由于采挖过度而濒临灭绝, 组织培养是合理利用肉苁蓉, 防止其资源枯竭的有效方法。组织培养研
究较多的是荒漠肉苁蓉和盐生肉苁蓉, 分别对这两种肉苁蓉愈伤组织的诱导、培养基的优化和药用成分的诱导条
件等方面的研究进行综述, 介绍了应用组织培养生产肉苁蓉药用成分的经济价值和生态效益, 以及利用组织培养
进行肉苁蓉快速繁殖的实践意义, 浅析了肉苁蓉大规模细胞培养的产业化前景。
关键词: 肉苁蓉; 组织培养; 荒漠肉苁蓉; 盐生肉苁蓉; 苯乙醇苷类化合物
中图分类号: R 28212 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670 (2006) 01 0140 04
Research progress and appl ica tion prospect on tissue culture of H erba C is tanche
YAN G Kun, J IAO Zh i2hao , ZHAN G Gen2fa
(Schoo l of L ife Science, Beijing N o rm al U niversity, Beijing 100875, Ch ina)
Key words: H erba C istanche; t issue cu ltu re; C istanche d eserticola Y1 C1 M a; C istanche sa lsa (C1 A 1
M ey1) Ben th1 et Hook1 f1; phenylehano id glyco sides
肉苁蓉为列当科多年生寄生草本植物, 全球分布大约有
22 种[1 ], 我国共有 4 种和 1 变种[2 ] , 分别为荒漠肉苁蓉 C is2
tanche d eserticola Y1 C1 M a、盐生肉苁蓉 C 1 sa lsa (C1 A 1
M ey1 ) Ben th1 et Hook1 f1、管 花 肉 苁 蓉 C 1 tubu losa
(Schenk) R 1W igh t、沙苁蓉C 1 sinensis G1Beck 和白花盐苁
蓉C 1 sa lsa (C1 A 1M ey1) Ben th1 et Hook1 f1 var1 a lbif lo2
ra P1 F1 T u et Z1 L 1 L ou。肉苁蓉是中药复方中用量最大的
中药材之一, 特别是荒漠肉苁蓉、盐生肉苁蓉和管花肉苁蓉
被大量应用, 并且大量出口日本、韩国及东南亚地区。近年来
由于狂采滥挖, 肉苁蓉野生资源遭到严重破坏。目前, 虽然肉
苁蓉人工种植已取得重要进展, 但受各种条件的限制, 仍不
能满足市场需求。应用组织培养的方法, 可以在不受寄主和
季节气候等条件影响的情况下大量生产肉苁蓉细胞, 是解决
市场需求和保护野生资源的有效途径, 具有很高的经济价值
和生态效益。近年来研究人员在肉苁蓉愈伤组织的诱导、愈
伤组织最佳培养条件的探索和提高愈伤组织中药用成分等
方面进行了不少工作, 本文对相关的研究进行概述, 并指出
肉苁蓉大规模产业化的应用前景。
1 肉苁蓉组织培养的研究进展
肉苁蓉组织培养的主要目的是产业化生产肉苁蓉细胞
及其药用成分, 或者通过愈伤组织诱导植株再生为高产栽培
提供种质资源。通过大规模细胞培养生产愈伤组织, 从中提
取药用成分, 需要摸索诱导愈伤组织的培养条件、适宜愈伤
组织快速生长的培养条件和提高药用成分量的培养条件, 以
·041· 中草药 Ch inese T radit ional and H erbal D rugs 第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2005206220
基金项目: 国家教育部高等学校骨干教师资助计划项目; 北京师范大学本科生科研基金项目
作者简介: 杨 坤 (1984—) , 女, 山西运城人。 T el: (010) 58806496 E2m ail: yk19840405@ 163. com3 通讯作者 张根发 T el: (010) 58809453 E2m ail: gfzh@bnu. edu. cn
便获取最多的生物量和药用成分。作为另一个主要用途, 体
外培养种苗主要是通过组织培养的方法使种子在体外条件
下萌发, 再通过激素诱导愈伤组织发芽, 产生人工种苗。这种
方法可以提高种子的发芽率, 大大提高人工栽培生活能力。
苯乙醇苷类化合物 (phenylethano id glyco sides, PhGs) ,
是肉苁蓉的次生代谢产物, 也是其主要药效成分。肉苁蓉中
PhGs 的种类很多, 有松果菊苷、麦角甾苷、海胆苷、顺式麦角
甾苷、异麦角甾苷、乙酰基麦角甾苷、肉苁蓉苷等 [3 ]。目前组
织培养肉苁蓉的研究大多数都集中在提高 PhGs 产量方面。
近年来兴起的生物转化系统生产药用成分的研究在肉苁蓉
PhGs 的生产中也有应用。生物转化是利用生物体系, 将加入
到反应系统中的外源有机底物某一特定部位或功能基团进
行特异性的结构修饰, 以获得有价值的不同化学产物的工
艺[4 ]。这方面的研究对于产业化生产肉苁蓉药用成分具有重
要的意义。
不同种肉苁蓉的愈伤组织中 PhGs 的种类和质量分数
不同。在我国作为药用植物使用的主要有荒漠肉苁蓉、盐生
肉苁蓉和管花肉苁蓉。研究证明 3 种肉苁蓉均有补肾壮阳的
作用[5 ]。其中荒漠肉苁蓉是《中国药典》规定的正品肉苁蓉,
自古以来就作为药用植物大量使用。盐生肉苁蓉所含的
PhGs 与荒漠肉苁蓉类似, 而管花肉苁蓉中所含 PhGs 的种
类比前两种要少, 但某些成分的量却比荒漠肉苁蓉要高 [5 ] ,
总体药用功效与荒漠肉苁蓉类似。目前组织培养中使用的外
植体基本都来自荒漠肉苁蓉和盐生肉苁蓉。以下分别对这两
种肉苁蓉组织培养的研究现状进行概述。
111 荒漠肉苁蓉组织培养的研究进展: 目前已从荒漠肉苁
蓉的茎、幼芽、鳞片、花瓣、子房、雄蕊和种子等多种组织和器
官中诱导得到愈伤组织。对其诱导条件和继代培养条件进行
研究发现, 温度、培养基、激素配比、pH 值、光照和诱导子等
对愈伤组织的培养和 PhGs 的合成都有影响。利用高温处理
可以提高种子的愈伤组织诱导率并诱导其分化出芽 [6 ]。
11111 愈伤组织的诱导: 影响愈伤组织诱导率的主要因素
有外植体的种类和培养基、激素配比、温度、光照、pH 值等培
养条件。
不同外植体诱导愈伤组织时, 诱导率和诱导条件都不相
同。通过荒漠肉苁蓉茎、幼芽、鳞片、花瓣、子房、雄蕊和种子
等多种组织和器官的比较发现, 子房、茎无论在脱分化的时
间, 还是在愈伤组织的诱导率及生长状况上都比鳞片、幼芽
好[7 ] , 而用种子进行愈伤组织的诱导较难, 诱导率非常低 [8 ]。
这可能是由于肉苁蓉的寄生性造成的, 自然条件下肉苁蓉种
子具有一个近球形胚, 只有在宿主梭梭根穿入之后才能够萌
发[9 ] , 因此从种子中诱导出愈伤组织需要克服其对寄主的依
赖性。欧阳杰等研究了用荒漠肉苁蓉种子诱导愈伤组织的条
件, 发现在接种前剥去种皮并进行热处理可以明显提高诱导
率, 最佳的处理方法是 50 ℃处理 1 h, 此时愈伤组织的诱导
率可达 25% [10 ]。
培养条件对愈伤组织的诱导率和生长状况也非常重要。
通常高盐离子浓度的M S 培养基和B 5 培养基诱导愈伤组织
的效果比较好。在诱导过程中, 激素的种类和浓度很关键, 需
要设置多个梯度进行对比选择最佳条件, 实验中采用正交设
计是较科学的一种方法。pH 值过低不利于愈伤组织的生长,
过高会使培养基凝结成块, 不利于营养成分的吸收, 需要设置
多个梯度选择最佳 pH 值。温度和光照等对诱导效果的影响
不是很大[10 ] , 目前的研究大都采用 25 ℃暗培养的条件[7, 8 ]。
对荒漠肉苁蓉幼芽、种子和鳞片的研究发现, B 5 + CH
500 m göL 为基本培养基, 添加 IAA 0. 58 m göL + KT 2m gö
L , pH 值为 6. 0 诱导效果最好[8 ]; 若采用M S+ 2, 42D 2 m gö
L + NAA 1 m göL , 配方简单, 同时对各种愈伤组织也都能达
到较好的诱导效果[7 ]。采用正交设计研究其种子的诱导发
现, 最佳诱导条件为去除种皮, 添加 2, 42D 2 m göL、KT 0. 5
m göL 和 GA 3 1 m göL , pH 值为 6. 0[10 ]; 此实验对各影响因子
的分析非常科学, 但设置激素水平未设置 0 水平, 即默认了
3 种激素必须同时存在。若多设置 1~ 2 个激素水平 (包括 0
水平)将会获得更佳的培养条件。
11112 适宜愈伤组织快速生长的培养条件: 对温度、基本培
养基、植物激素的浓度、蔗糖浓度、水解酪蛋白的浓度以及光
照进行多梯度比较发现, 25 ℃, 固体B 5 培养基, pH 值 5. 5~
6. 5, 添加 62BA 0. 5 m göL、赤霉素 10 m göL、蔗糖 20 göL、水
解酪蛋白 800 m göL , 每天光照 16 h, 光照强度为 24 Λmo lö
(m 2 · s) , 最有利于 PhGs 的合成, 其量比外植体中高了
42%~ 127% [11 ]。方差分析表明光照对 PhGs 合成和积累的
影响非常显著, 这可能是由于愈伤组织的生长和 PhGs 的合
成与光形态发生作用有关。通过研究光照强度和光谱特定性
对于愈伤组织生长和 PhGs 产生和积累的影响, 发现 435 nm
蓝光强度为 24 Λmo lö(m 2·s) 时, 愈伤组织干重和 PhGs 达
到最高值, 分别比白光照射下提高了 19% 和 41% [12 ]。同时
分别测定了 PhGs 合成途径中的限速酶——苯丙氨酸解氨
酶 (PAL )的活性在蓝光和白光照射下随时间的变化, 发现蓝
光照射下 PAL 的活性明显高于白光照射下的水平, 推测光
照对 PhGs 合成的影响可能是由于光受体被蓝光激活后提
高了植物体内 PAL 的活性, 促进了 PhGs 合成和积累的
增加[12 ]。
11113 添加诱导子提高愈伤组织中的药用成分: 由于促进
肉苁蓉愈伤组织生长与促进次生代谢产物大量合成、积累的
培养条件并不相同, 因此肉苁蓉大规模细胞培养可以采用两
步培养法, 第 1 步先在生长培养基上使细胞快速增殖, 再将
处于对数生长期的细胞到诱导培养基上增行第 2 步培养, 以
便获得最多的药用成分。探索第 2 步培养中最适宜药用成分
合成并大量积累的条件是研究中最为关键的问题。利用生物
转化的方法生产药用成分是一条有效的途径, 这种方法是将
愈伤组织作为生物转化系统, 通过前体饲喂和添加诱导子,
使廉价的前体转化为价值很高的药用成分。
诱导子是一类能引起植物细胞代谢强度改变或代谢途
径改变的物质, 包括生物诱导子和非生物诱导子两类。生物
诱导子又分内源性和外源性两类, 内源诱导子来源于植物本
身, 如降解细胞壁的酶类、细胞壁碎片和寡聚糖等; 外源诱导
·141·中草药 Ch inese T radit ional and H erbal D rugs 第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月
子多来源于微生物, 包括经处理的菌丝、微生物机体浸提物
及产物等。非生物诱导子常用辐射、金属离子等。近年来研究
发现稀土元素化合物是一类诱导活性很高的诱导子 [15 ]。在
药用植物愈伤组织培养的第 2 步, 加入诱导子往往能够刺激
细胞的次生代谢、提高药用成分的量, 对于降低工业化生产
的成本有重要的影响。目前已有研究表明加入真菌诱导子茄
病镰孢 F usarium solan i 或非生物诱导子稀土元素都可以提
高肉苁蓉愈伤组织的生物量和其中 PhGs 的量。
李森等用从梭梭根系及肉苁蓉植物株内分离出的真菌
镰刀菌属茄病菌菌丝作为诱导子, 研究其对荒漠肉苁蓉愈伤
组织中氨基酸量的影响。结果证明, 7 种人体必需氨基酸 (除
苏氨酸略低外) 均高于野生植株, 其中苯丙氨酸的量是野生
植株 10 倍以上[13 ]。鲁翠涛等采用同样的真菌诱导子茄病菌
研究其对荒漠肉苁蓉 PhGs 量的影响。用不同剂量 (碳水化
合物当量) 的诱导子诱导液体培养的愈伤组织, 经过 27 d 后
测得剂量为 20 m göL 时 PhGs 的总产量最高, 比不加诱导子
时提高了近 100% [14 ]。这可能与植物遇到微生物侵袭时的防
御机制有关。当植物遭到有害物质威胁的情况下, 倾向于合
成抗病的次生代谢产物。
欧阳杰等用稀土元素作为诱导子研究其对荒漠肉苁蓉
愈伤组织生长和 PhGs 合成的影响, 发现稀土元素钕 (N d)、
镧 (L a)、铈 (Ce) 都可在适当的浓度范围对愈伤组织生长和
PhGs 合成有促进作用, 一种稀土元素的混合物 (M ER ,
L a2O 3 ∶CeO 2 ∶P r6O 11 ∶Sm 2O 3 = 225∶175∶3∶ 1, mo lö
mo l)表现出最强烈的促进作用。经过 30 d 的培养, 加入 0. 02
mo löL M ER 的愈伤组织中 PhGs 的量和总产量都提高最
多, 分别是 20. 8% 和 1. 6 göL , 比对照 (没有加入稀土元素)
提高 104% 和 167% [5 ]。原因可能跟稀土元素的化学结构类
似于Ca 有关。低浓度的稀土元素与 Ca2+ 、Fe3+ 竞争细胞膜
上的受体, 从而影响了营养物质的吸收、利用和转化。同时根
据实验研究组织培养不同时间的苯丙氨酸解氨酶 (PAL ) 的
活性变化, 推测可能 Ce4+ 影响了 PAL 的活性, 从而影响
PhGs 的合成[15 ]。
112 盐生肉苁蓉组织培养的研究: 对于盐生肉苁蓉的研究较
荒漠肉苁蓉要少, 主要研究集中在确定适合愈伤组织生长和
药用成分合成的培养基、生长素、激素配比、温度和光照等培
养条件。对肉苁蓉愈伤组织进行前体饲喂, 可以定向的提高某
种 PhGs 成分的质量分数, 并明显缩短培养周期。目前这方面
已有一项组织培养的专利[16 ]和一项生物转化的专利[17 ]。
11211 愈伤组织的诱导: 研究表明, 盐生肉苁蓉茎段、子房
在添加 2, 42D 的培养基上诱导愈伤组织分别成块状、颗粒
状, 都为白色; 而在添加 KT 的培养基上诱导的愈伤组织都
呈颗粒状, 黄绿色; 添加 KT、NAA 的M T 培养基诱导效果
最好[18 ]。
11212 促进愈伤组织快速生长的培养条件: 郭志刚等将盐
生肉苁蓉愈伤组织在 20~ 25 ℃避光的条件下培养 10~ 20
d, 培养出悬浮单细胞系, 并从中筛选高产单细胞系 [16 ]。用驯
化筛选的快速生长细胞系为材料, 进行培养基、生长素、激素
配比、温度和光照等条件的筛选, 结果表明用改良M iller 或
改良M S 培养基、25 ℃暗培养、激素配比为 IAA 1 m gömL
或BA 0. 5 m gömL、IAA 3 m gömL 最有利于愈伤组织的生
长[19 ]。用高效液相色谱法比较愈伤组织与野生盐生肉苁蓉
的主要成分, 发现二者的活性成分基本相同, 其中主要药用
成分的质量分数所培养的愈伤组织比野生肉苁蓉要高 [19 ]。
松果菊苷、洋丁香酚苷和 2’2乙酰基洋丁香酚苷 3 种主要
PhGs 物质的总量可达到 95. 7 m gög, 是野生盐生肉苁蓉的
1. 4 倍, 是药材酒苁蓉的 10. 1 倍[20 ]。
11213 适宜 PhGs 合成的培养条件: 通过研究碳源、生长素
和培养条件对细胞中松果菊苷、洋丁香酚苷 (类叶升麻苷) 和
2’2乙酰基洋丁香酚苷 3 种 PhGs 合成的影响, 发现添加葡萄
糖比蔗糖更有利于 3 种 PhGs 的合成。但不利于细胞的增
殖, 最后 PhGs 总的产量反而低于蔗糖培养基中的产量; 添
加 2, 42D、15 ℃暗培养或 25 ℃光照培养都可以促进松果菊
苷和洋丁香酚苷的合成; 在 IAA 2 m göL 与 62BA 1 m göL、
25 ℃暗培养时, 3 种 PhGs 的总量最高, 达 1 937. 7 m göL ; 通
过比较, 愈伤组织中的主要成分与肉苁蓉药材基本相同, 但
3 种 PhGs 的量远远高于天然肉苁蓉[21 ]。
11214 通过前体饲喂缩短 PhGs 合成周期: 前体是目的产
物合成途径中的中间代谢物。肉苁蓉组织培养生产 PhGs
时, 通过前体饲喂可以定向的提高某种 PhGs 的量, 并大大
缩短培养周期。通过加入放射性同位素标记的前体, 可以确
定 PhGs 的活性位点是由哪个前体的活性基团转化而来, 这
种方法对于研究 PhGs 的生物合成途径具有重要的意义。
目前尚无这方面的研究报道, 但一项肉苁蓉生物转化的
专利显示, 在培养基中添加氨基酸前体 (苯丙氨酸和ö或酪氨
酸)、黄瓜汁前体或咖啡酸前体, 可以大大缩短 PhGs 的合成
周期, 在 25 ℃避光振荡培养一周后即可获得 PhGs[17 ]。
2 肉苁蓉组织培养的应用前景
211 利用组织培养生产肉苁蓉药用成分的价值
21111 经济价值: 肉苁蓉是我国的传统中药, 有“沙漠人参”
之称, 应用历史已有 1 800 余年。肉苁蓉具有补肾阳、益精
血、润肠通便、延缓衰老、提高免疫力等多种功效, 在中药复
方中被广泛的应用。现代医学研究发现其主要药效成分
PhGs 具有增强记忆力、抗衰老等重要功效 [17 ]。国内外已经
开发了多种以肉苁蓉作为主要成分的保健食品, 如御苁蓉口
服液。日本将从肉苁蓉中提出的肉苁蓉苷作为应激性机能障
碍的改善剂或治疗剂, 用于治疗各种机能性障碍, 特别是性
机能障碍和健忘症, 并认为其对心身疾病也具有预防或治疗
作用。在欧洲专利局数据库所收录的 51 个国家的专利中, 有
280 余项是有关肉苁蓉的药理学作用或用其作为药用成分
生产药物、保健品等。
肉苁蓉被大量出口到日本、韩国以及东南亚地区, 美国
也已将其作为食品添加剂大量使用 [22 ]。国内外市场对肉苁
蓉的需求量不断增长, 到 2002 年, 国内市场对肉苁蓉的年需
求量大约在 3 500 t, 国际市场的需求量约为 1 000 t [23 ]。
在需求快速增长的同时, 肉苁蓉野生资源因被大量采挖
·241· 中草药 Ch inese T radit ional and H erbal D rugs 第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月
而日益减少, 乃至濒临灭绝。1989 年调查表明全国肉苁蓉的
蕴藏量仅为 2 000 t, 1989—2002 年实际采挖量为年约
209 t [23 ] , 远不能满足市场需求。人工栽培虽已取得重要进
展, 但由于受到寄主数量、分布与根系发育情况等的限制, 仍
难以满足市场的大量需求。研究表明, 人工种植管花肉苁蓉
的主要药用成分松果菊苷的量还不到野生肉苁蓉的一半 [24 ],
故产品质量的提高还有待进一步研究。而组织培养肉苁蓉愈
伤组织具有药用成分量高、培养成本低等优点, 可以全年不
间断的大量生产高质量的肉苁蓉药用成分。大规模肉苁蓉组
织培养技术的产业化推广, 能够有效缓解肉苁蓉市场供不应
求的状况。
21112 生态效益: 1984 年肉苁蓉就被列为国家二级保护植
物, 在 2000 年 4 月召开的第 11 届“濒危野生动植物种国际
贸易公约”缔约国大会上肉苁蓉被列于附录Ê。肉苁蓉的寄
主梭梭也属国家珍稀濒危保护植物 (渐危 3 级)。梭梭林具有
防风固沙的作用, 对于沙生环境的维持也非常重要。近年来
由于乱采滥挖, 肉苁蓉野生资源遭到严重破坏, 梭梭资源也
由于根系被破坏而受到损害 [22 ]。即使通过人工种植肉苁蓉,
对梭梭的生长也有一定的影响, 研究表明被寄生后的梭梭树
高、地径和冠幅都普遍小于未被寄生个体, 总生物量也减少
了 49. 29% [25 ]。因此通过组织培养方法生产肉苁蓉细胞, 替
代天然肉苁蓉, 作为药品或保健品的原料, 成为保护野生肉
苁蓉资源及其寄主梭梭的重要途径, 对沙生环境也能起到有
效的保护作用, 具有很高的生态效益。
212 利用组织培养生产肉苁蓉快繁种苗的价值: 通过愈伤组织
培养和植株再生进行肉苁蓉的快速无性繁殖, 可以为肉苁蓉的
人工栽培提供充足的种苗。人工栽培肉苁蓉受到寄主数量、分布
与根系发育情况等的限制, 通过愈伤组织诱导植株再生技术 [6 ],
使种子克服对寄主的依赖而萌发, 可以为人工栽培提供种苗, 提
高栽培的成功率。这样可以解决目前人工栽培发芽率低、发芽时
间长等缺点, 有助于提高人工栽培的产量。
213 大规模产业化生产的前景展望: 扩大细胞培养的规模
可以降低培养成本, 提高经济效益。在生物反应器中进行植
物细胞培养生产次生代谢物的方法可用于多种细胞体系, 常
与大规模相关的 3 种细胞体系是悬浮培养、固定化培养和发
状根培养。适合于肉苁蓉组织培养的细胞体系主要是悬浮培
养和固定化培养, 目前悬浮培养在摇瓶中已经获得了成功,
但规模扩大中的一些技术问题还有待解决; 固定化培养肉苁
蓉愈伤组织已经获得了成功。随着工程技术的进一步成熟,
通过组织培养的方法大规模生产肉苁蓉愈伤组织, 提取药用
成分具有广阔的应用前景。
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·341·中草药 Ch inese T radit ional and H erbal D rugs 第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月