全 文 ：中草115ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第8期2006年8月·1233·
药材与资源
黄连药材DNA提取及RAPD反应体系的优化
陈大霞1，李隆云1，钱敏1，鲁成2
(1．重庆市中药研究院，重庆400065；2．西南农业大学蚕桑学重点实验室，重庆400716)
摘要：目的 探索黄连药材DNA的提取并对其RAPD反应体系进行优化。方法采用目前较为流行的苯酚法、
CTAB法、高盐低pH值法，通过电泳、紫外分光光度仪检测及RAPD扩增效果确定黄连药材基因组DNA提取的
最佳方法。结果CTAB法为黄连药材基因组DNA提取的最佳方法，建立了适合黄连药材的RAPD反应体系：25
pL体系中内含1×PCRbuffer、2mmol／LMg”、100～150umol／LdNTP、20ng引物、40ng模板、1UTaq酶。结
论CTAB法及黄连药材的RAPD反应体系可以用于黄连药材的RAPD分析。
关键词：黄连药材；基因组DNA提取；RAPD；反应体系
中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)08—1233一05
DNAExtractionfr mRhizomaCoptidusandoptimizationofRAPDreactionsystem
CHENDa—xia，LILong—yunl，QIANMinl，LUChen92
(1．ChongqingAcademyofChineseMateriaMedica，Chongqing400065，China；2．TheKeySericulturalLaboratory
ofSouthwestAgriculturalUniversity，Chongqing400716，China)
Abstract：ObjectiveTostudythgenomicDNAextractionfr mRhizomaCoptidusandoptimization
ofRAPDreactionsystem．MethodsDifferentm thods，i．e．phenolmeth d，CTABmethod，10wpH
extractionmediumwithhighsalt．wereus dtogenomicDNAextractfromRhizomaCoptidus．TheDNA
samplesobtainedbytheabovemethodsweretestedbyagarosegelelectrophoresisandultraviolet
spectrometer．ResultsCTABMethodwasconsideredtob anoptimaltechnique．Basedontheg nomic
DNAextractedbyCTABmethod，areactionsystemsuitableforRhizomaCoptiduswaestablished，that
is，25肚Lamplificationreactionssystemcontaining1×PCRbuffer，2mmol／LM92+，100—150umol／L
dNTP，20ngprimer，40ngtemplateDNA，and1UTaqDNApolymerase．ConclusionCTABMethod
andRAPDreactionsystemcanbeusedtoRAPDanalysisinRhizomaCoptidus．
Keywords：RhizomaCoptidus；genomicDNAextraction；RAPD；reactionsystem
对于新鲜材料而言，DNA的提取已有较为成熟
的提取方法，而中药材在加工、炮制、贮藏过程中，药
材的DNA或多或少被降解，寻找一种从干品中药
材中提取DNA的比较简便、快捷、高效的方法，是
进行药材分子生物学研究非常关键的一步。本研究
拟采取目前较为流行的苯酚法、CTAB法、高盐低
pH值法进行比较探索。随机扩增多态性DNA
(randomamplifiedpolymorphicDNA，简称RAPD)
技术是1990年由Williams[13和Welsh[23两个研究
小组几乎同时发展起来的一项DNA多态检测技
术。该技术具有操作简便、灵敏快速、费用低廉、安全
等优点，已广泛应用于中药的鉴定[3]、分类[4]以及药
材的道地性[51等方面的研究。但RAPD易受各种因
素的干扰，其最佳扩增条件在不同物种各有不同，因
此在对黄连药材进行RAPD分析时，完全有必要对
各因子的反应条件进行优化，建立稳定的、最佳的反
应体系。
1材料和方法
1．1材料：黄连Coptisch nensisFranch．于2004
年11月采自四川、重庆、陕西、湖北等生产地，由本
院生药栽培室李隆云研究员鉴定，各地黄连均收集
生长了5年以上的。在成熟植株上选择当年萌发的
幼嫩叶片，低温下带回实验室，洗净晾干后，冻于一
80℃超低温冰箱中保存。黄连根部洗净后，置于50
℃烘箱内烘至完全干燥，最后密封保存于干燥室。
1．2仪器与试剂：TaKaRaPCRThermalCycler
DiceModelNo．TP600扩增仪(宝生物工程有限公
司)、SmartSpeeTM3000型分光光度计(BIo—RAD
收稿日期：2005一11—10
基金项目：国家科技攻关计划(2004BA721A32)；国家中医药管理局攻关项目(国中医药科2004ZX06—1)；重庆市科技计划项目(8847)
作者简介：陈大霞(1968一)，女，重庆人，助理研究员，硕士，主要从事药用植物分子生物学研究。
Tel：(023)89029190E—mail：17837@163．com
万方数据
·1234· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第8期2006年8月
公司)、DYCP一34A型琼脂糖水平电泳槽(北京市
六一仪器厂)、GelDoc2000凝胶成像系统(BIO—
RAD公司)、10mar随机引物(赛百盛)、Taq酶
(promega)、dNTPs(promega)、a-EcoTl41digest
DNAMarker(TakaRa)、CTAB(Amresco)、PVP
(Sigma)、p一疏基乙醇(Sigma)、琼脂糖(进品分装)，
其余均为国产分析纯试剂。
1．3 黄连基因组DNA提取方法的探索：分别称取
同一株黄连药材(去掉表面的老皮)0．5g，用下面3
种方法提取基因组DNA。
苯酚法：采用稍做改进的Sambrook[6]的方法。
高盐低pH值法：参照文献方法[71进行。CTAB法：
采用本院稍作改进的CTAB法[8]进行。黄连新鲜材
料基因组DNA提取方法：采用本院稍作改进的
CTAB法[81进行。
1．4 DNA扩增：参照常规的PCR反应中各成分的
量，将黄连药材RAPD优化的初始反应体系确定
为：反应总体积2s肛L，内含1×PCRbuffer、MgCl2
1．5mmol／L、dNTP200umol／L、引物40ng、模板
40ng、Taq酶1U。根据预实验的结果，以SBSC。为
引物，对黄连RAPD反应体系中5种主要成分
(M92+、dNTP、引物、模板、Taq酶)及牛血清白蛋白
(bovineserumalbumin，BSA)分别进行单因子实
验，每一个合适条件确定后作为后续研究的一个
条件。
扩增程序为94℃预变性5min，然后进行35个
循环：94℃变性30S、37℃复性1min、72℃延伸
1．5rain、循环结束后72℃延伸7rain，一4、C保存。
1．5 PCR产物的检测：扩增产物在1．5％琼脂糖凝
胶上电泳分离，电压不超过5V／cm。当溴酚蓝指示
剂距离琼脂糖凝胶前沿约2～3em时停止电泳，用
0．5／19／mLEB染色15～30min后，在凝胶成像系
统上检测、照相、记录。
2结果与分析
2．1 黄连药材基因组DNA提取方法比较：3种方
法所提DNA的颜色深浅不一：CTAB法所提DNA
为无色，苯酚法浅棕色，高盐低pH法颜色最深，为
棕色。从外观看，每种方法所提DNA所含的杂质量
是不同的。紫外分光光度仪检测结果：就DNA产率
而言，高盐低pH法最高，但A。。。／28。值1．942，可见该
法提出的DNA中RNA量较高；苯酚法的产率次于
高盐低pH法，但A：。。／28。值1．198，说明有蛋白质和
酚的污染；相对而言，CTAB法虽然产率低，但
A：。。／28。值1．60左右，与其他两种方法相比较，蛋白
质、RNA去除较干净。
1％琼脂糖电泳结果显示(图1)，3种方法所提
DNA均有大于20kb的主带，可以用于RAPD分
析。高盐低pH法背景最深，溴酚蓝下面还有一条明
显的RNA带。3种方法的上样量以高盐低pH法最
高(3700ng)、苯酚法次之(770ng)、CTAB法最低
(700ng)，但条带的亮度却正好相反。由此可见，
DNA的纯度、产率仅凭紫外分光光度仪检测是不够
准确的，应该与电泳结合起来确定。
l一新鲜样品 2-CTAB法3一苯
酚法4～高盐低pH法
1-freshsample2-CTABmethod
3-phenolmethod4-lowpH
extractionmediumwithhighsalt
图l不同提取方法电泳比较
Fig．1Comparisonofvariousextractionmethods
byeIectrophoresis
通过以上外部观测及紫外分光光度仪、电泳检
测，可以初步确定CTAB法是优于苯酚法和高盐低
pH法的。为进一步证实这点，笔者进行了RAPD扩
增效果的比较。从图2可以看出：CTAB法所提药材
DNA与鲜品DNA的扩增结果完全一致；苯酚法稍
差，能扩增出主带；高盐低pH法扩增效果最差，仅
得到一些小相对分子质量的条带。
1一苯酚法2-CTAB法
3一高盐低pH法4一改良高
盐低pH法5一新鲜样品
1一phenolmethod
2一CTABmethod3-low
pHextractionmediumwith
highsalt4-improvedlow
pHextractionmediumwith
highsalt5-freshsacpple
图2不同提取方法RAPD扩增效果比较
Fig．2ComparisonofRAPDamplificationbyvarious
extractionmethods
综合上述检测结果：将CTAB法确定为黄连药
材基因组DNA提取的最佳方法。
2．2黄连药材RAPD反应体系的优化
2．2．1M92十浓度：TaqDNA聚合酶是M92+依赖
性酶，对M92+浓度非常敏感，是影响PCR结果的重
要变量之一，因此选择合适的M92+浓度，对PCR反
应至关重要。本研究共设置了0．5～4mmol／L共7
个M92+梯度，结果如图3所示：M92+浓度在2．o～
万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第8期2006年8月·1235·
3．0mmol／L，扩增结果基本一致，但以2．0mmol／L
最佳；其他浓度下的扩增弱，0．5mmol／L时未得到
产物。
2．2．2dNTP浓度：底物dNTP浓度过高，会导致
聚合酶错误地掺入，浓度过低，又会影响合成效率，
甚至会因dNTP过早消耗而使产物单链化，影响扩
增效果。本实验设置了从20～600ktmol／L共9个
dNTP梯度，见图4。dNTP浓度过高(600p．mol／L)
无扩增产物；100、200／lmol／LdNTP得到的谱带一
致；其余浓度下，只能扩增出一些小相对分子质量的
条带。
图3 M92+浓度的影响
Fig．1InfluenceofMg”concentration
图4 dNTP浓度的影晌
Fig．4InfluenceofdNTPconcentration
2．2．3引物浓度：引物浓度不宜偏高，一般为0．1～
0．5／-mol／L，如图5所示。引物质量浓度过低(10
ng)，引物与模板的结合率低，扩增弱。引物在20～
80ng条带数基本一致，但可明显看出，随着引物浓
度的升高，非特异性扩增产物增加，造成背景模糊。
因此，综合考虑，引物以20～30ng较适宜。
2．2．4模板梯度：从本研究设置的lo个模板梯度
(1～480ng)可看出(图6)：RAPD—PCR对模板的要
求并不严格，模板质量浓度在一定范围内(10～240
ng)并不会影响扩增条带的增减。模板量过低(1ng)
或过高(360、480ng)，得到的扩增产物少或不稳定，
甚至无产物。本实验采用了40ng的模板量。
图5引物浓度的影响
Fig．5Influenceofprimerconcentration
1—1ng 2—5ng3—10ng 4—20ng5-40ng 6-80ng
7-120ng8-240ng 9-360ng，10—480ng
图6模板浓度的影响
Fig．6Influenceoftemplateconcentration
2．2．5不同提取方法与BSA浓度的关系：本实验
就BSA对RAPD的影响进行了探索。如图7所示，
BSA对苯酚法、CTAB法所提DNA的扩增结果影
响并不显著，相反高浓度的BSA还不利于扩增。但
对高盐低pH·值法所提DNA的扩增却有影响，加了
BSA的扩增条带数明显多于未加BSA的。此外，当
BSA浓度高于3ug／uL时，扩增产物较黏稠，电泳
l～5一苯酚法6～10一高盐低pH值法
1l～15-CTAB法BSA(O、1、2、3、4ug／pL)
l一5-phenolmethod6 10-lowpHextractionmediumwith
highsalt11—15-CTABmethodSA(O，1，2。3，and4ug／uL)
图7不同提取方法与BSA
Fig．7VariousextractionmethodsandBSA
万方数据
·1236· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第8期2006年8月
时溴酚蓝滞后，染色后可见条带宽度缩小变窄，点样
孔有EB吸收。
2．2．6黄连药材RAPD反应体系的建立：通过以
上对黄连RAPD反应体系中5种主要成分(Mg抖、
dNTP、引物、模板、乳g酶)及BSA单因子优化实
验，综合实验成本等因素考虑，建立了适合黄连药材
的RAPD反应体系：25弘L体系中内含1xPCR缓
冲液、2mmol／LMg”、100～150t￡mol／LdNTP、20
ng引物、40ng模板、1UTaq酶。
2．3扩增程序的优化：对扩增程序中的一些主要热
循环参数进行了探讨。94‘C下设置了30、40、60S共
3个时间梯度，结果表明：40、60S扩增的条带数均
少于30S，因此变性时间以30S为佳；退火温度设
置了34、37、39、45℃共4个梯度，34。C的退火温度
下，扩增的条带多而弱，随温度的升高，特异性增强，
但条带相对少～些，相比之下，37~C退火温度下扩
增的条带数及亮度均较适宜；37。C下退火时间设置
了30、60、120s共3个梯度，结果表明：带型基本一
致，本实验选用60S作为退火时间；72℃下延伸时间
从60～120S对条型无明显影响，本实验选用90S作
为延伸时间；循环数设置了30、35、40、45次，各循环
数下得到的条型基本一致，但30次的循环数扩增量
明显不足，40、45次扩增量显著提高，但非特异性增
强，背景加深，因此35次的循环数较适宜。见图8。
1～3—94CF变性时间30、40、60S 4～7～退火温度34、37、39、45C 8～10—37CF退火时I司30、60、120S
11～13—72C下延伸时间60、90、120S 14～17一循环数30、35、40、45次
1 3-denaturationtimeof30，40，and60Sin94℃4m7一annealingt mperatureof34，37，39，and45C 8--10一annealingtime
of30，60，and120S in37C 11--1S-extensiontimeof60，90，and120Sin72C 14—17一cyclesof30，35，40，and45times
图8扩增程序的优化
Fig．8Optimizationofamplifiedprogram
3讨论 药材基因组DNA浓度与纯度通常用紫外分光
对于新鲜幼嫩的材料而言，植物基因组DNA 光度仪进行测定，由于某些杂质在UV260nm处也
的提取已有较为行之有效的方法，而中药材样品来 有吸收峰，因此仅通过紫外吸收进行DNA的定量
源复杂，药用部位大多是老组织，含有大量的多酚和 偏差较大。从本研究结果看，应结合电泳检测、PCR
多糖物质，植物细胞在死亡过程中，也会产生一些影 扩增效果综合分析。笔者认为就中药材而言，PCR
响下一步分子生物学实验的次生物质。这些次生物 扩增检测更为重要，一是因为中药材品种繁多，化学
质与核酸形成复合物，DNA包埋在这种黏稠的胶状 成分各异，基因组DNA带有不同的杂质，RAPD对
物中难以溶解或产生不同程度的褐变。因此药材基 模板的纯度要求不严，少量的杂质并不影响扩增的结
因组的提取较新鲜材料困难得多。虽然药材DNA 果；二是因为药材的特殊性，特别是一些贮藏时间较
的提取方法已有一些报道[9]，但目前还没有一种较 长的药材，提取的产物中含有基因组DNA，只是由于
通用的方法。因此在中药材分子生物学研究过程中， 量太少，用紫外分光光度仪和电泳往往检测不到，但
针对不同药材进行DNA提取方法的摸索是完全有 足以用于PCR的扩增。因此，在前两种方法检测效果
必要的。从本研究结果看，无论是电泳检测还是 不好的情况下，可以用PCR扩增作为补充手段。
PCR扩增效果，CTAB法所提药材DNA与鲜品在影响RAPD扩增效果的主要因素中，M92+
DNA的结果完全一致，这可能与本文黄连药材的快 与dNTP之间的浓度关系至关重要，需要通过实验
速干燥、保存时间相对较短有一定关系，至于贮存时 来确定。RAPD对模板的纯度要求不高，因此，在本
间长短对RAPD的影响尚有待进一步探讨。 实验中，CTAB法、苯酚法所提DNA尽管有杂质，
万方数据
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但并不影响扩增结果，但高盐低pH法所提DNA呈
棕色，含有较多抑制酶活性的多酚类物质。为消除多
酚类物质对扩增的影响，本研究参照其他研究者的
经验，在RAPD反应体系中添加BSA，用于减少内
源抑制物的干扰作用[1州。结果证实，对于杂质多的
样品，添加BSA是可以改善扩增效果的。据报道
BSA的一个可能作用机制是作用于多酚体系，通过
其上富含赖氨酸的阳离子与多酚化合物的阴离子相
互作用而消除内源的多酚类化合物，阻止它们与
Taq酶结合，从而提高酶的活性，改善扩增效果[1“。
致谢：本研究分子生物学实验在西南农业大学
蚕桑学重点实验室完成。
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宋玉霞1，郭生虎1，张芦燕3，李苗1，马洪爱1，牛东玲1’2，郑国琦1’2，王英华3
(1．宁夏农业生物技术重点试验室，宁夏银川750002；2．宁夏大学生命科学学院，宁夏银川750021，
3．宁夏药品检验所，宁夏银川 750004)
摘 要：目的 为扩大和提高肉苁蓉Cistanchedes rticola资源的利用效率。方法以肉苁蓉肉质茎的不同组织部
位作为外植体，采用正交实验方法，筛选诱导愈伤组织产生的不同培养基和培养条件，并继代培养。应用HPLC方
法对愈伤组织培养物中松果菊苷和洋丁香苷(毛蕊花糖苷)的量进行测定。结果 肉苁蓉肉质茎的维管组织部分是
诱导愈伤组织的最适外植体，鳞片叶次之，髓组织部分诱导效果较差。在暗培养、25～27℃条件下以B5为基本培
养基附加6-BA(0．5～2mg／L)与IAA(o．5～1．5mg／L)诱导愈伤组织效果最佳；在半光照(光培养10h／d，暗培
养14h／d)条件下，愈伤组织生长正常，最佳继代时间为25～30d。愈伤组织培养物中松果菊苷和洋丁香苷(毛蕊花
糖苷)达4．37％。结论筛选出了适宜的肉苁蓉愈伤组织培养方法，且培养物中主要药用有效成分松果菊苷和洋丁
香苷(毛蕊花糖苷)的量达到并超过了《中国药典》要求(o．3％)的标准。
关键词：肉苁蓉；肉质茎；愈伤组织；洋丁香苷(毛蕊花糖苷)；松果菊苷
中图分类号：R282．1；R282．6文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)08～1237—05
CalluscultureofCistanchedeserticolaandits cteosidecontent
SONGYu—xial，GUOSheng—hul，ZHANGLu—yan3，LIMia01，MAHong—ail，
NIUDong—lin92．ZHENGGuo—qi2，WANGYing—hua3
(1．NingxiaAgriculturalBiotechnologicalKeyLaboratory，Yinchuan750002，China；2．SchoolofLifeScience，
NingxiaUniversity，Yinchuan750021，China；3．NingxiaInstituteforDrugControl，Yinchuan750004，China)
收稿日期：2005—11-10
基金项目：国家自然科学基金项目(30260008)；国家科技部攻关西部专项(2002BA901A32)；宁夏自然科学基金项目(NZ0522)
作者简介：宋玉霞(1963一)，女，硕士，研究员，主要从事结构植物学和药用植物资源方面的研究。E—mail：songyx666@163．com
万方数据
黄连药材DNA提取及RAPD反应体系的优化
作者： 陈大霞， 李隆云， 钱敏， 鲁成， CHEN Da-xia， LI Long-yun， QIAN Min， LU Cheng
作者单位： 陈大霞,李隆云,钱敏,CHEN Da-xia,LI Long-yun,QIAN Min(重庆市中药研究院,重庆
,400065)， 鲁成,LU Cheng(西南农业大学,蚕桑学重点实验室,重庆,400716)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(8)
被引用次数： 13次

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6. 刘兴地.郑楷.郑学勤.LIU Xing-di.ZHENG Kai.ZHENG Xue-qin Noni基因组DNA提取及RAPD分析[期刊论文]-广东
农业科学2008(5)
7. 胡松梅.洪亚辉.胡雄贵.HU Song-mei.HONG Ya-hui.HU Xiong-gui 石刁柏辐射诱变的遗传学分析与RAPD研究[期
刊论文]-广东农业科学2011,38(1)
8. 朱剑云.叶耀雄.叶永昌.刘成明.傅嘉欣.李果惠.黄卫国 8份树菠萝种质资源的RAPD分析[期刊论文]-广东农业科
学2005(6)
9. 谭雪.张继栋.乔爱民.李莲芳.郑少薇 应用RAPD技术对菜心种质资源分类研究初报[期刊论文]-广东农业科学
2009(10)
10. 曹水良.胡开林.王得元.CAO Shui-liang.HU Kai-lin.WANG De-yuan RAPD标记构建辣椒分子连锁图谱研究初报
[期刊论文]-广东农业科学2005(2)

引证文献(13条)
1.肖冰梅.周小江.罗京 玄参总DNA提取方法的比较研究[期刊论文]-湖南中医药大学学报 2008(2)
2.邵敏.周鹤峰.唐历波.刘银花.李官成 沉香随机扩增多态性DNA反应体系的建立[期刊论文]-时珍国医国药
2009(1)
3.贾静波.李维林.吴文龙.闾连飞.郭巧生 悬钩子属植物的RAPD分析[期刊论文]-植物资源与环境学报 2008(3)
4.曾群.米丽华.宋强 连翘干叶片和鲜叶片DNA提取方法和质量比较研究[期刊论文]-光明中医 2011(7)
5.胡裕清.赵树进 RAPD技术及其在植物研究中的应用[期刊论文]-生物技术通报 2010(5)
6.徐芳.王丽萍.陈波.姚守拙 改良SDS法快速提取赤芍干叶片DNA的研究[期刊论文]-中草药 2009(4)
7.李雄英.罗育.吴耀生.蒋军富.赵瑞强.蓝秀万 RAPD技术在药用植物绞股蓝鉴别中的初步研究[期刊论文]-武汉植
物学研究 2008(3)
8.南晓洁.郝媛媛.赵艮贵.韩榕.秦雪梅 柴胡药材干根DNA提取及RAPD分析[期刊论文]-中草药 2009(3)
9.王谦博.张维君.刘丽芳.仲昭庆.王振月 黑龙江省不同产地满山红遗传多样性的RAPD分析[期刊论文]-中医药学报
2012(2)
10.李隆云.陈大霞.钟国跃.李泉森 我国仙茅属植物遗传关系的RAPD分析[期刊论文]-中草药 2011(5)
11.王婷.李爱贤.郭庆梅.李佳.韩琳娜.周凤琴 忍冬叶片基因组DNA的提取与分析[期刊论文]-山东中医药大学学报
2008(3)
12.陈大霞.彭锐.李隆云.崔广林.吴叶宽 我国黄花蒿天然群体遗传多样性的SRAP分析[期刊论文]-中草药 2011(8)
13.王超.李荣钦.关法春.王彦杰.李静.许静.陶雷 草莓RAPD反应体系的优化[期刊论文]-东北农业大学学报
2011(4)


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