全 文 ：6 倍量, 改良油水分离器中加 115% 醋酸乙酯, 蒸馏
提取 12 h, 醋酸乙酯及时萃取出蒸馏液中的挥发
油。川芎挥发油上硅胶柱 (≤15 ℃低温) , 以石油醚
(30～ 60 ℃) 2乙醚 (99∶1) 洗脱, 500 mL 为 1 个流
份, 以 TL C 荧光检查后, H PL C 测定, 纯的流份合
并, 低温 (≤30 ℃) 回收至少量, 分装于样品瓶内, 冷
冻干燥, 密闭 (≤- 10 ℃低温保存) , 得纯品。另外,
也可将川芎挥发油上中压柱 (≤15 ℃低温) , 以石油
醚 (30～ 60 ℃) 2乙醚 (99∶1) 洗脱, 250 mL 为 1 个
流份, 以 TL C 荧光检测后, H PL C 测定, 纯的流份合
并, 低温 (≤30 ℃) 回收至少量, 分装于样品瓶内, 冷
冻干燥, 密闭≤- 10 ℃低温保存) , 得纯品。
212　对照品的结构鉴定: 藁本内酯为无色油状物,
略有酯香味; ES I2M S: m öz 191 [M + 1 ]; IR Μm ax
cm
- 1
: 3 050、2 959、2 933、2 872、1 767 (CO )、
1 668、1 625、1 271、1 051、960、705。UV Μm ax nm :
207、282、294、323。1H 2NM R (CDC l3) : ∆ 0195 (3H ,
t 7 H z) , 1147 (2H , m , 7 H z) , 2136 (2H , dd, 7
H z) , 2145 (2H , m ) , 2162 (2H , dd, 613, 7 H z) ,
5126 (1H , t, 613, 7 H z) , 6101 (1H , m , 412, 7
H z) , 6124 ( 1H , dt, 7、211 H z) 1 13C2NM R: ∆
13141、18112、22106、22106、27180、112152、116153、
123151、129173、146188、148123、167113。鉴定为
(Z ) 2藁本内酯。
213　对照品的纯度检测
21311　对照品的杂质检查
　　按薄层色谱鉴别法分析: 取适量藁本内酯, 加甲醇
制成 2 m gömL 的溶液, 吸 5 ΛL 点样在硅胶 G 板上,
以石油醚2醋酸乙酯 (20∶3) 为展开剂, 展开, 晾干, 置
紫外光灯(365 nm )下检视。结果供试品为一个斑点。
　　高效液相色谱法分析: K rom asil C18 柱 ( 250
mm ×416 mm , 5 Λm ) , 甲醇2011% 三氟乙酸水溶液
(80∶20)、甲醇2011% 三氟乙酸水溶液 (70∶30)、甲
醇2011% 三氟乙酸水溶液 (58∶42) 为流动相分别测
定; 检测波长为 273 nm。结果表明, 对照品为一个主
峰, 保留时间分别为: 7193、12156、17132 m in。改变
流动相分析时未出现异常峰。
21312　面积归一化法纯度检查: K rom asil C18 (250
mm ×416 mm , 5 Λm ) 色谱柱, 甲醇2011% 三氟乙酸
水溶液 (70∶30) 为流动相测定, 检测波长为 273
nm , 对照品溶液质量浓度为 01418 4 m gömL , 采集
时间比保留时间延长 1 倍以上, 归一化法计算, 质量
分数为 98143%。
21313　不加校正因子的主成分自身对照法: 按照上
述高效液相色谱法测定, 对照品溶液质量浓度为
01418 4、01013 1 m gömL , 分别测定, 计算, 杂质质
量分数 1135% , 对照品质量分数 98145%。
3　讨论
　　川芎用水蒸气蒸馏提取挥发油时, 蒸馏液为油
水混合物, 不易分层, 经优选后, 在提取器中加入适
量醋酸乙酯, 可及时将蒸馏出的挥发油萃出, 使油水
混合物得到较好的分离。
　　醋酸乙酯为溶剂时, 可能会有残留, 因此提取过
程中, 采用气相色谱法跟踪了每次提取油的醋酸乙
酯残留量, 结果发现提取的挥发油经精制后, 醋酸乙
酯的残留量均低于 5×104 Λgög, 符合要求。
HPLC 法测定人血浆中的大黄酸
朱　伟1, 张　莉2, 王学美1Ξ
(11 北京大学第一医院中西医结合研究所, 北京　100034; 21 第四军医大学 化学教研室, 陕西 西安　710032)
　　大黄为我国最常用的中药之一, 始载于《神农本
草经》, 列为下品, 历代本草均有记载。目前世界上已
有 19 个国家的药典收载了大黄, 作为法定药物使
用, 因此大黄已经成为一种世界性的药物, 大黄酸是
大黄中最重要的活性成分之一。为适应临床治疗药
物监测的需要, 本实验建立了一种简单快速的高效
液相色谱对大黄酸定性、定量的方法, 为临床上合理
使用大黄提供依据。
1　材料
　　美国A gilen t 公司 1100 系列高效液相色谱仪,
包括真空脱气机、四元梯度泵、柱温箱、紫外检测器
和A gilen t Chem sta t ion fo r L C 色谱工作站; R heo2
·56·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2005203217
作者简介: 朱　伟 (1975—) , 男, 在读博士研究生, 主治医生, 主要从事中药临床药理研究工作。
T el: (010) 6655112223053　E2m ail: zww bx@ 1631com
dyne 7725i 手动进样器; 瑞士梅特勒- 托利多公司
A E—200 型万分之一电子分析天平; 梅特靳- 托利
多 (上海) 公司 320—S 型 pH 计; SHB—3 循环水多
用真空泵 (郑州杜甫仪器厂)。
　　大黄购于西安市药材公司, 经浙江医药高等专
科学校杨雄志副教授鉴定为蓼科植物药用大黄
R heum of f icina le Baill1 的干燥根茎及根, 样品凭证
标本存于我所中药标本室。
　　大黄酸、1, 82二羟基蒽醌对照品购自中国药品
生物制品检定所, 面积归一化法测定质量分数均>
99%。甲醇为进口色谱纯 (F isher 公司) , 冰醋酸为国
产分析纯; M illipo re 超纯水; 空白血浆来源于北京
大学第一医院血库。
2　方法与结果
211　色谱条件: 色谱柱为美国A gilen t 公司 Zo rbax
C 18柱 (150 mm ×416 mm , 5 Λm ) , 流动相为 1% 醋
酸水溶液2甲醇 (15∶85, pH = 5125) , 体积流量为
015 mL öm in, 柱温为 30 ℃, 检测波长 256 nm。
212　样本处理: 取待测血样 3 mL 置于含抗凝剂的
试管中, 4 ℃条件下冷冻离心 20 m in, 取血浆置- 20
℃冰箱保存, 分析前在暗处自然熔融。取血浆 015
mL , 加入 100 ΛgömL 内标溶液 8 ΛL , 混匀, 加入 2
mo löL 盐酸溶液 100 ΛL , 混匀。然后加入提取溶液
乙醚2环己烷 (4∶1) 3 mL , 涡旋 1 m in, 1 500×g 离
心 10 m in。取有机层置于一干净塑料试管中, 该过
程重复 1 次。合并 2 次提取液, 于 40 ℃水浴中用氮
气吹干, 残渣用 100 ΛL 甲醇溶解后, 取 20 ΛL 进样。
213　标准曲线的制作: 采用色谱峰保留时间和叠加
法进行定性分析。分别准确吸取空白血浆 015 mL
置于若干支 10 mL 塑料离心管中, 分别加入大黄酸
和内标对照液, 使各管中大黄酸的质量浓度分别为
012、014、018、116、312、614 ΛgömL , 内标的质量浓
度为 018 ΛgömL , 按“样本处理”项下操作。以大黄酸
与内标峰面积比值 (Y ) 和血浆中药物质量浓度 (X )
做线性回归计算, 大黄酸标准曲线的回归方程为:
Y = 01917 782 112 X + 01023 640 82, r= 01999 3,
表明大黄酸在 014～ 614 ΛgömL 具有良好的线性关
系。此色谱条件下, 大黄酸的检测限为 610 ΛgöL。
214　色谱适应性: 在本色谱条件下, 空白血浆对大黄
酸无干扰。空白血浆加对照品及健康志愿者口服大黄
后血浆的色谱图显示大黄酸与内标分离良好(图 1)。
215　专一性试验: 取空白血浆, 按“样本处理”项下
操作, H PL C 法测定。结果在大黄酸、内标物相应的
保留时间没有色谱峰, 表明专一性良好。
12大黄酸　22内标 1, 82二羟基蒽醌
12rhein　22in ternal standard substance 1, 82dioxyan th raqu inone
图 1　空白血浆 (A)、空白血浆+ 大黄酸对照品+
内标 (B)和含药血浆 (C)的 HPLC 图
F ig11　HPLC chromatogram s of blank plasma (A) , 　
blank plasma + rhe in reference substance +
in terna l standard substance (B) , and
plasma with sample (C)
216　回收率和精密度试验: 在 015 mL 空白血浆中
加入高、中、低 3 种质量浓度的大黄酸对照品溶液,
按“样本处理”项下操作, 测得大黄酸的峰面积A 0。
同时取相应质量浓度的大黄酸对照品溶液置于若干
支 10 mL 离心管中, 于 40 ℃水浴中通氮气挥干, 同
法用甲醇溶解后进样分析, 记录大黄酸峰面积A 1,
按相对回收率= A 0öA 1×100% 计算。采用相应质量
浓度的大黄酸对照品溶液直接进样分析, 测得大黄
酸的峰面积A 2, 按绝对回收率= A 0öA 2×100% 计
算。取空白血浆 015 mL 置于若干支 10 mL 离心管
中, 分别加入大黄酸对照品溶液, 使大黄酸的质量浓
度分别为 014、116、418 ΛgömL , 按“样本处理”方法
操作, 分别于 1 d 内 5 个时间点及连续测定 5 d, 则
获得大黄酸高、中、低质量浓度的日内和日间R SD
及回收率试验结果 (表 1)。
表 1　大黄酸的回收率和精密度试验 (n= 5)
Table 1　Recovery and prec is ion test
of rhe in in plasma (n= 5)
加入质量浓度ö
(Λg·mL - 1) 检测质量浓度ö(Λg·mL - 1) 绝对回收率ö% 相对回收率ö% 日内R SD ö% 日间R SD ö%
014 01419 104169 67142 7104 5122
116 11678 104190 73196 3109 9135
418 41811 100123 74192 3187 4175
217　临床应用: 采用本法测定 2 名健康志愿者服用
大黄水提物后的血浆样本。健康志愿者A 为 30 岁
的男性, 体重 70 kg; 健康志愿者B 为 23 岁男性, 体
重 7215 g。试验前经询问病史、体格检查和实验室检
查, 血尿常规、肝肾功能、心率及血压均正常, 无心、
肝、肾和胃肠道等疾患。受试前 2 周及受试期间未服
用其他药物, 禁止烟酒及饮料。受试期间统一清淡饮
食, 正常饮水。试验前均签署知情同意书。受试者空
腹 14 h 后于第 2 天清晨按 50 m gökg (相当于生药
·66· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月
大黄 110 gökg)服用大黄水提物和 150 mL 水, 分别
于服药前及后 0、01083、015、1、115、2、3、4、5、7、10
h 从肘静脉取血 3 mL , 血样置于含有肝素的离心管
中, 1 500×g 离心 10 m in, 取血浆置- 20 ℃冰箱保
存待测。整个试验在医生监护下进行, 2 名健康志愿
者在试验期间未出现药物不良反应。
218　血药浓度2时间曲线: 以大黄酸血药浓度对时
间作图, 得到大黄酸的药时曲线, 见图 2。显示健康
志愿者服用大黄水提物后大黄酸的血药浓度随时间
变化的情况。可见, 人口服大黄水提物后, 大黄酸被
快速吸收入血, 大黄酸的最大血浆浓度 (Cm ax ) 分别
为 31877 和 31249 ΛgömL , 达峰时间 ( tm ax ) 分别为
115 和 1 h。由于受试者数量太少, 目前还不能得到
大黄酸在健康人体内的药动学参数。
图 2　志愿者A (A)和 B (B)口服大黄水提物后
大黄酸的药时曲线
F ig12　Rhe in concen tration - time curve in hea lthy male
volun teer A (A) and B (B) ora lly adm in istered
by R. of f icina le water extract
3　讨论
　　有研究者认为当前中医药学面临两个难题: 1)
中药中的何种成分被吸收入血, 它们的药动学特征
如何; 2) 吸收入体内的中药成分有什么样的生物效
应以及这些生物学效应和临床疗效之间有何种联
系; 要回答这些问题大多数学者认为首先必须在人
的体液中检测出微量的来源于中药的化学成
分[1～ 4 ]。本实验在人口服大黄水提物后的血浆中只
检测出大黄酸, 这和以往的文献报道[6 ]一致。说明以
大黄酸为大黄的指标成分进行临床治疗药物监测有
合理性, 这也说明建立一种简单快速高效液相色谱
测定人血浆中大黄酸方法十分必要。
　　本实验采用内标法定量测定, 可减少由仪器系
统或操作过程带来的误差, 从而提高分析的准确度。
筛选了大量的内标物, 结果发现以 1, 82二羟基蒽醌
为内标物与大黄酸同属蒽醌类衍生物, 两者分子骨
架相同, 亦微溶于水, 溶于乙醇。在所选的色谱条件
下, 两者均为单一峰, 分离度好 (R > 115) , 测定时不
受干扰, 保留时间适宜, 因此完全符合内标要求。
　　萃取条件的选择: 参考文献先后考察了甲醇、乙
醚、环己烷2己酸酯2正丁醇 (3∶2∶015)、三氯甲烷 6
mL 的提取效果。结果表明甲醇沉淀蛋白, 浓缩后残
渣杂质较多, 干扰大, 且甲醇的毒性较大。采用环己
烷2己酸己酯2正丁醇 (3∶2∶015)、三氯甲烷作为提
取剂则大黄酸提不出来。单纯乙醚提取血浆样品, 不
易乳化, 但提取率太低, 加入适量的环己烷后大黄酸
提取率高, 无杂质峰干扰, 而且乙醚易挥发, 易挥干
富集。此外大黄酸为弱酸性, 在酸性环境下其溶解度
较高。比较了 015、110、210 mo löL 盐酸溶液酸化血
浆样本后对大黄酸提取效率的影响, 结果发现当用
015、110 mo löL 盐酸溶液酸化血浆样本时, 不但大
黄酸的提取率低, 而且残渣杂质多损耗色谱柱, 采用
210 mo löL 盐酸溶液酸化血浆样本则情况大为改
善。本实验的样本预处理方法操作简单, 不需要特殊
的仪器设备。
　　色谱柱的选择: 选择了W aters 公司的 Spher2
so rb、N ova Pak 柱、A gilen t 公司的 Zo rbax 柱以及
大连物理化学研究所的 K rom asil 柱进行试验, 但结
果均不满意。试验证明在本实验条件下,A gilen t 公
司的 Zo rbax 色谱柱为最佳选择。
　　目前文献报道了多种H PL C 测定动物样本中
大黄酸的方法, 但这些方法经笔者预实验证明均不
适用于对人血浆的检测, 而H PL C 测定人血浆中大
黄酸的方法只有 3 种[5～ 7 ] , 但也存在或需要放射性
核素标记, 操作复杂; 或缺乏内标定量不准; 或检测
浓度范围较高等缺点。本实验所建立的人血清中大
黄酸的 H PL C 测定法经临床应用证明具有灵敏度
高、专属性强、准确、精密等优点, 最低定量质量浓度
为 20 ΛgöL , 充分满足人体内大黄酸的治疗药物监
测的要求。
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HPLC 法测定三七及其制剂中三七素
付春梅, 朱　静, 刘三康, 李章万Ξ
(四川大学华西药学院, 四川 成都　610041)
　　三七为五加科植物三七 P anax notog inseng
(Bu rk. ) F1H 1 Chen 的干燥根, 其中所含三七素
(dencich ine, Β2草酰基2L 2Α, Β2二氨基丙酸) 具有止
血作用[1, 2 ] , 因此三七在祖国传统医药中广泛用于跌
打损伤的治疗。研究进一步证明三七素具有止血、增
加血小板数的药理活性[3 ]。目前, 三七素的测定主要
采用的是氨基酸自动分析仪[4, 5 ] , 该法具有分析结果
准确的优点, 但仪器价格昂贵, 且不能应用于其他成
分的分析。也有将三七素进行荧光衍生化后, 采用薄
层扫描的方法测定[6 ] , 但衍生化产物不稳定, 扫描定
量中引起误差的因素较多, 准确度不高。本实验采用
离子对反相液相色谱法对三七素进行分离测定, 灵
敏、快速、准确, 可用于三七药材及其复方制剂中三
七素的测定。
1　仪器与试药
　　日本岛津L C—10A 高效液相色谱仪, SPD—
10AV P 紫外检测器, CTO —6A 柱温箱, SEPU 3000
色谱工作站 (杭州普惠科学仪器有限公司)。三七素
对照品 (四川大学华西药学院药化教研室提供, 质量
分数大于 99% ) , 三七药材 (产地: 云南文山) 经四川
大学华西药学院生药教研室张浩教授鉴定为五加科
植物三七的干燥根, 三七制剂为市售; 实验用水为超
纯水, 甲醇为色谱纯, 其他试剂均为分析纯。
2　方法与结果
211　色谱条件: 迪马D iamon silTM C 18色谱柱 (200
mm ×416 mm , 5 Λm ) , 自填国产 CYW C 18保护柱
(10 mm ×415 mm , 5 Λm ) , 流动相为含 315 mmo lö
L 磷酸二氢钠的甲醇20103% 四丁基氢氧化胺 (20∶
80, 磷酸调pH 为 318) , 体积流量为 1 mL öm in, 柱温
40 ℃, 检测波长为 220 nm , 进样量为 20 ΛL。
212　对照品溶液的制备: 取三七素对照品约 5 m g,
精密称定, 用流动相溶解制成 011 m gömL 溶液作为
对照品溶液。
213　供试品溶液的制备: 取粉碎的三七根粉 1 g, 精
密称定, 置 50 mL 烧瓶中, 加硼砂缓冲液 (pH 9118)
25 mL , 水浴回流 1 h, 提取液转移至 50 mL 量瓶中,
残渣加硼砂缓冲液 15 mL 回流提取 015 h, 提取液
转移至 50 mL 量瓶中, 残渣用硼砂缓冲液洗涤, 合
并提取液与洗涤液, 用硼砂缓冲液定容至 50100
mL , 混匀, 滤过, 即得。
214　线性及范围: 配制不同质量浓度对照品溶液,
注入液相色谱仪测定。以三七素峰面积对进样量进
行线性回归, 回归方程为 Y = - 2112×104+ 6198×
105 X , r= 01999 7, 线性范围为 01202～ 4104 Λg。
215　精密度试验: 同一供试品溶液重复进样 5 次,
三七素峰面积积分值的R SD 为 0185%。
216　重现性试验: 同一批样品平行测定 5 份, 测得
其平均质量分数为 5161 m gög, R SD 为 111%。
217　稳定性试验: 在 4 个不同日期测定同一批供试
品, R SD 为 115%。
218　加样回收率试验: 精密称取三七粉末 (含三七
素 5161 m gög) 适量 (014、015、016 g) , 分别加入三
七素对照品 (212、218、314 m g) , 按供试品溶液制备
方法制成高、中、低 3 种质量浓度溶液各 3 份, 测定。
结果平均加样回收率为 9818% , R SD 为 117%。
　　按制剂处方配制空白样品 (不含三七) , 按供试
品溶液的制备方法制备空白溶液并测定, 结果 3 种
制剂空白均不干扰三七素测定。冠心丹参片、复方三
七胶囊、复方丹参片的高、中、低 3 种质量浓度空白
加样平均回收率分别为 9812% (R SD 为 211% , n=
·86· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 37 卷第 1 期 2006 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2005203223
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30271535)
作者简介: 付春梅 (1971—) , 女, 讲师, 硕士, 主要从事药物分析教学及科研工作。T el: (028) 85503272　Fax: (028) 85501634
E2m ail: lizhangw anlab@ 1631com3 通讯作者　李章万　E2m ail: lizhangw anlab@ 1631com