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Cluster shoots induction from root-tip segments of Dendrobium officinale

铁皮石斛根尖诱导丛生芽研究



全 文 :-928· 中单嚆cMne辩TraditionalandHerbalDrugs第37卷第6期2006年6月
长受抑,黄芩苷的量也显著减低(5.76mg/g)。因
此,适宜的氮源浓度为60mmol/L(其中NH。+:
NO。为1:1)
2.6磷酸盐对黄芩愈伤组织生长和黄芩苷积累的
影响:见图5。可以看出,当KH。PO。在小于0.5
mmol/L时,生物量随着KH。PO。浓度的增加而明
显增大,在0.5~2.5mmo|/L时增加幅度不大。黄
芩苷的量在1.5mmol/I,时达到最大值(26.73mg/
g)。因此,KH。PO。的浓度不宜过高,以0.5~1.5
mmoi/L较为适宜。


3





g



T


j缸

|j吁
KH2Pq的浓度/(ramolL1)
图5不同浓度的KHzPO一对墩伤组织生长和黄芩苷
■的影响
Fig.5EffectsofvariousconcentrationsofKH2P04
oncallusgrowthandbnicalin
3讨论
黄芩愈伤组织的生长和黄芩苷的积累并不同
步,而是先生长后合成。蔗糖对黄芩苷的合成具有明
显的调节作用,在小于3%时,能有效促进愈伤组织
的生长,但对黄芩苷的合成没有刺激作用,当蔗糖在
3%~8%时愈伤组织表现出明显的生长和次生代谢
功能,黄芩愈伤组织的生长及黄芩苷合成明显增加,
到8%时二者均达到最大值。黄芩是一种两年生的
中药,其黄芩苷的大量合成在次年进行,这可能与体
内光积累和蔗糖浓度有关,实验结果与天然状态下
黄芩苷的积累情况相似。另外,黄芩愈伤组织生长和
黄芩苷积累还受多种因子的调控作用,本研究结果
表明,黄芩愈伤组织生长和黄芩苷积累的优势培养
条件:在基本培养基MS中氮源浓度为60mmol/L
(NH。+:NOa为1:1),KH2PO。浓度0.5~1.5
mmol/L时,附加80g/L蔗糖,0.3mg/LIAA、2
mg/L6-BA和200mg/L蛋白胨(25士1)℃,暗培
养。愈伤组织培养40d,生物量达28.7g/1,,黄芩苷
量167.4mg/g,明显高于野生黄芩的量。
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铁皮石斛根尖诱导丛生芽研究
詹忠根
(浙江经贸职业技术学院。浙江杭州310018)
摘要:目的探索铁皮石斛根尖再生丛生芽的适宜条件及类原球茎的起源。方法切取0.3~0.5cm的根尖为
外植体,以B5为基本培养基,附加不同种类和质量浓度的植物生长调节剂进行培养。结果诱导根尖形成了愈伤
组织、类原球茎或直接转化成芽且获得再生植株。通过细胞学观察认为铁皮石斛的类原球茎是单细胞起源的体细
胞胚。结论为铁皮石斛组织快繁建立新的体系。
关键词:铁皮石斛;禽伤组织;类原球茎;体细胞胚发生
箨薯晶羿:誓訾杂%l品1一),男,浙江江山人,硕十研究生,主要从事组织培养研究
Tel:(0571)85919482Email:zhz99321@tonitom.
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第6期2006年6月·929·
中围分类号:R282.2 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2006)060928— 4
Clustershootsinductionfr mroot—tipsegmentsofDendrobiumofficinale
ZHANZhong—gett
(CollegeofZhejiangEconomicandTradePolytechnic,Hangzhou310018,China)
Keywords:Dendrobiumoffic naleKi uraetMigo;callus;protoeormlikebodies(PI,Bs);somatic
embryogenesis
铁皮石斛Dendro&umfficinaleKimuraet
Migo是国家一级保护植物,具有益胃生津、滋阴清
热之功效。近年来,铁皮石斛的离体培养主要集中于
原球茎增殖及苗的分化,所用的外植体有种子、无菌
苗幼苗茎段、原球茎及人工种子等”1。本研究以根尖
分生组织为外植体,通过组织切片研究其愈伤组织
诱导和再生植株的细胞学过程,以期建立新的组织
快繁体系及遗传转化受体系统,为通过基因工程改
良铁皮石斛品系提供理论基础。
1材料和方法
1.1 外植体:选择生长健壮、根长为3cm左右的铁
皮石斛无菌苗,用刀片小心切除根冠后,取长约0.3~
0.5em的根尖分生组织平放于培养基中培养。
1.2培养条件:根尖诱导、不定芽增殖及生根的基
本培养基为B5,通过调整植物激素的组合与配比、
改变天然附加物及微量元素的量等方法研究根尖分
生组织在不同培养条件下的生长发育状况。以上所
有培养基中均加入蔗糖30g/L,琼脂6.1g/L,pH
5.8;培养条件为(25士1)℃,光照强度为800lx,持
续光照。
1.3组织切片与扫描电镜观察:冷冻切片:在37℃
下,材料先用4“的阿拉伯树胶浸泡9h,再移人
10%的阿拉伯树胶浸泡10h后进行切片;石蜡切
片:材料用FAA固定,常规切片,厚度为8pm,1%
番红染色;扫描电镜:材料用戊二醛固定,常规制样。
2结果与分析
2.1植物激素对根尖培养的影响:为r全面考察植
物生长调节剂的组台与配比、天然附加物及培养基
中微量元素的量等因素对根尖离体培养的影响,共
设计了20种培养基(表,8周后统计愈伤组织诱
导率、类原球茎诱导率及直接成芽率。
2.1.1愈伤组织的诱导:根尖在1~8号培养基中
培养后,其生长点细胞经多次分裂形成浅绿色、表面
较光滑的致密愈伤组织(图1—1)。通过比较根尖在
1~8号培养基中的生长状况,认为低质量浓度的2,
4一D(0.2~1.0mg/l,)能诱导愈伤组织的形成,只是
表1植物激素等因素对根尖形成愈伤组织及
原球茎的影响
Table1 Effectofplanthormonencallus
andPLBsofroottipformation
⋯素省黧蕊嚣
0.5
1 O
3 O
3 0
3 0
0 5
1 0
3 0
0
0
0
0
O
0
1C.4
25.3
4 6
5.9
4.8
8.8
106
l 3 9
i6 增力111倍 O 0 0
l7 鼢1/3 o 0 5 5
18 碱为1/3 1%芋头汁 o o 6 7
l 9 o 1 减为1/3 l“椰子汁 o 0 2 2
11 1:! 墅!!!!!!壁蔓!!!! 坐
诱导率较低(2.9%~16.2%),若在培养基中添加适
当质量浓度的6-BA能明显提高愈伤组织的诱导
率,而加入NAA则促进根尖伸长,不利于愈伤组织
的诱导。从根尖在9~20号培养基中的生长情况可
知.2,4一D对于愈伤组织的诱导是必不町少的,在不
含2,4D的培养基中均未能诱导愈伤组织产生。
2.1.2类原球茎的形成:形成类原球茎的途径有两
条,一是通过愈伤组织分化得到。1~6号培养基中
诱导产生的愈伤组织生长缓慢,若继续在原培养基
中培养或继代到相同成分的新培养基中,则绝大多
数愈伤组织出现褐化现象,极少数幸存下来的愈伤
组织经多次继代后也未见分化出类原球茎。2,4D
表现出促进愈伤组织的生长而抑制类原球茎形成,
这种阶段效应可能是它在某种程度}破坏了内源生
长索的极性分布,从而抑制了胚胎的进一步发育和
O
0
D
0
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0
L
i丑丑i
O
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0
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万方数据
·930· 中革前 ChineseTradlHonala dHerhalDrugs第37卷第6期2006年6月
成熟。若将愈伤组织转接到B5+NAA0,5rng/L+
6-BA3,0mg/L中培养或者根尖直接培养在7、8号
培养基中,则愈伤组织生长较快,其表层细胞会进行
平周分裂,内层细胞进行垂周分裂,致使整个组织形
成不规则的突起(图12)。而后,靠近表层的部分愈
伤组织细胞体积增大、细胞质变浓、细胞壁加厚,与
周围细胞形成明显的界限,即部分愈伤组织细胞开
始转变为胚性细胞。胚性细胞经多次分裂后可形成
球形细胞团,并进一步发育成绿色的类原球茎(图
1~3~5)。二是由根尖分生组织直接分化产生(图1—
6)。培养在9~14号培养基中的根尖,其生长点细胞
能直接转变成胚性细胞。通过冰冻切片可观察到这
些细胞的第1次分裂是不均等的,即先分裂成1个
基细胞和1个顶细胞,继而发育成类似于胚胎发育
或胚状体形成时的早期原胚期阶段的球形细胞团。
随着发育的继续,这种胚性细胞团的基部细胞开始
伸长、增大,逐渐失去分生能力,而顶端的细胞分裂
能力仍很活跃,致使整个组织形成不规则的突起,这
些突起逐渐长成卵圆形后形成类原球茎。可见,铁皮
石斛的类原球茎是单细胞起源的体细胞胚。实验表
明,NAA和6BA在类原球茎的形成过程中,不仅
可诱导愈伤组织分化为类原球茎,也可以诱导根尖
不经过愈伤组织阶段而直接产生类原球茎,这可能
是由于内源细胞分裂素的积累导致IAA与Cks的
比例下降引起的“。
2.1.3根尖直接再生芽:培养在9~11号培养基中
的根尖,除产生一定比例的类原球茎外,还出现根尖
分生组织直接分化成芽的现象(图17),由于高等
植物根和芽的分生组织是分别由高度决定的细胞所
构成的,在胚胎时期,甚至在整个生命过程中都有明
显不同,所以根芽之间的转化非常困难,转化的频率
相当低口“]。在实验中发现降低微量元素的质量浓度
(15~17号培养基),同时低质量浓度的芋头汁
(18~20号培养基)能在一定程度上提高直接再生
芽的比率。若在培养基中添加NAA则不仅使成芽
的比率下降也使成芽的时间大大延长(9~11号培
养基),而在同时含有NAA和6一BA的培养基中根
尖分生组织只分化成类原球茎而不能直接再生芽。
I一根尖分生组织诱导产生愈伤组织2愈伤组纵表面产生突起3一愈伤组织分化成类原球茎4一荚原埭茎
5娄原球茎纵切 6根尖分生组织直接分化成类原球茎 7离体根直接再生芽
1 calluswereinducedfromrootID2 tuberf omcallus‘surface3 PLBsdifferentiationfromcallus4~PLBs
5一longitudinalsect|0nofPLBs6一PLI±sfromroott】pdirectly7一regenerationbudfromisolateduool—npdirectly
图l铁皮石斛根尖诱导丛生芽
Fig.1Clustershootsinductionfr mroot—tipsegmentsofD-officinale
2.2植株再生:将类原球茎转接到B5+NAA0.5 体细胞胚发生途径再生植株,发生方式有两种:一是
mg/L+】0%椰子汁的培养基中进行培养,类原球茎间接发生途径,即通过脱分化形成愈伤组织后,由愈
逐渐变长,其顶端分生组织先分化出芽,然后叶原基 伤组织的某些细胞转化为胚性细胞并继续分裂形成
进一步发育成幼叶。稍后,在其基部出现根原基,根 多细胞原胚以及不同发育时期的体细胞胚。适宜培
原基细胞分裂延伸为根,内部分化出维管束,最后形 养基是B5+2,4一D0.5mg/L+NAA0.5mg/L+
成完整的幼苗。类原球茎在分化的同时,也会不断增 6-BA3.0mg/L;二是直接发生途径.即直接从外植
殖,产生许多新的类原球茎,最后逐渐形成丛生小 体某些部位的特定细胞诱导分化出体细胞胚,适宜
芽。两种不同途径产生的类原球茎的分化能力有明 培养基是B5+NAA0.5mg/L+6-BA3.0mg/L。
显不同,由根尖直接产生的类原球茎在分化培养基 另外,根尖也可以经器官发生途径再生植株,即根尖
中绝大多数都能分化成小苗,而由愈伤组织分化而 分生组织经培养后直接形成芽。进而发育成完整的
来的类原球茎分化能力很弱,大多数最终褐化死亡。 植株,适宜培养基是B5(微量元素减为1/3倍)+
3结论 1%芋头汁。虽然用根尖诱导生产类原球茎的频率还
本研究以根尖为外植体进行铁皮石斛的组织快 有待进一步提高,但由于铁皮石斛类原球茎的增殖
繁研究。实验表明,在不同的培养条件下,根尖可经 与分化频率很高,相应技术也已相当成熟,所以一邑
万方数据
中草黄ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第6期2006年6月-931·
诱导成功,就可通过扩增用于大规模生产。
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甘草愈伤组织培养中激素优化组合的研究
刘 颖,魏景芳,李冬杰
(河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄050018)
摘要:目的选择甘草愈伤组织诱导和继代培养的最佳激素组合。方法 以甘草无菌苗的胚根为外植体设计正
交试验考察不同浓度的激素组合对愈伤组织诱导和继代的影响。结果 以诱导率为指标.NAA对甘草细胞脱分化
影响最显著;以相对生长速率为指标.6一BA、2,4一D、NAA对甘草细胞生长分裂影响最显著。结论甘草愈伤组织诱
导及继代的最佳激素组合为2,d—D1.0mg/L+NAA1.0mg/L+6BA1.0mg/I。IKT0.3mg/L。
关键词:tj草;愈伤组织;正交试验法;激素组合
中圈分类号:R28:2 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2006)06一093l—03
OptimumcombinationsofplanthormoneincalluscultureofGlycyrrhizauralensis
Lit]Ying.WEIJing—fang.L1Dongjie
(CollegeofBiosciencea dBioengineering。HebeiU iversity。fScienceandTechnology-Shijiazhuang050018,China)
Keywords:G如cyrrhizauralensisFisch.;callus;orthogonaltest;hormonecombinations
甘草GlycyrrhizauralensisFisch.为豆科多年
生草本植物,其根和根茎为常用中药,具有补气健
脾、清热解毒、润肺止咳、缓急止痛,调和药性之功
效。这些年来,甘草自然生产量逐年锐减,因此,利用
组织培养技术对甘草进行无性快繁,加快甘草次生
代谢活性物质的提取已迫在眉睫。目前,有一些关于
甘草组织培养方面的报道“J,但在这些研究中,所用
培养基中植物激素的组合是否最佳难以比较。本研
究采用正交试验设计法考察2,4D、NAA、6BA、
KT4种植物激素对甘草愈伤组织诱导和生长产生
的影响,确立最佳的激素组合,为进一步稳定培养物
的有效生长速率和提高其中含有效成分的量,建立
稳定高产的甘草次生代谢产物牛产体系奠定实验
基础。
1材料与方法
新疆甘草无菌苗的胚根切成1cm长的小段。均
匀接种在培养基表面。所用基本培养基为MS
(120℃,0.1MPa,灭菌20min),培养条件采用暗
培养,(25士】)‘C。
1.1 愈伤组织诱导及继代培养:本试验采用正交设
计考察植物激素对甘草愈伤组织诱导及生长的影
响。综合分析了生长素和细胞分裂素对愈伤组织诱
导的影响‘⋯,在MS基本培养基中添加2,4D、
NAA、6BA、KT4种不同质量浓度的激素,I。(44)
试验设计见表L
表1因素水平
Table1 Factorsandlevels
外植体接种7d,胚根肿胀、膨大,20d胚根表
面产生分散的愈伤组织.颜色淡黄色、质地疏松,统
计不同浓度的激素组合对甘草胚根愈伤组织诱导率
鉴鍪品皙:霈驻署葑强技术研究与发展计划项目(。。。。;5.:D)
作者简介:刘Tel:颍(03“11吣)8。8—63k2河167北鼍要盘i嚣击玉零裂i裹黧用植物次生代谢产物的研究工作
万方数据
铁皮石斛根尖诱导丛生芽研究
作者: 詹忠根, ZHAN Zhong-gen
作者单位: 浙江经贸职业技术学院,浙江,杭州,310018
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2006,37(6)
被引用次数: 13次

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