全 文 ：-928· 中单嚆cMne辩TraditionalandHerbalDrugs第37卷第6期2006年6月
长受抑，黄芩苷的量也显著减低(5．76mg／g)。因
此，适宜的氮源浓度为60mmol／L(其中NH。+：
NO。为1：1)
2．6磷酸盐对黄芩愈伤组织生长和黄芩苷积累的
影响：见图5。可以看出，当KH。PO。在小于0．5
mmol／L时，生物量随着KH。PO。浓度的增加而明
显增大，在0．5～2．5mmo|／L时增加幅度不大。黄
芩苷的量在1．5mmol／I，时达到最大值(26．73mg／
g)。因此，KH。PO。的浓度不宜过高，以0．5～1．5
mmoi／L较为适宜。
宇
一
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KH2Pq的浓度／(ramolL1)
图5不同浓度的KHzPO一对墩伤组织生长和黄芩苷
■的影响
Fig．5EffectsofvariousconcentrationsofKH2P04
oncallusgrowthandbnicalin
3讨论
黄芩愈伤组织的生长和黄芩苷的积累并不同
步，而是先生长后合成。蔗糖对黄芩苷的合成具有明
显的调节作用，在小于3％时，能有效促进愈伤组织
的生长，但对黄芩苷的合成没有刺激作用，当蔗糖在
3％～8％时愈伤组织表现出明显的生长和次生代谢
功能，黄芩愈伤组织的生长及黄芩苷合成明显增加，
到8％时二者均达到最大值。黄芩是一种两年生的
中药，其黄芩苷的大量合成在次年进行，这可能与体
内光积累和蔗糖浓度有关，实验结果与天然状态下
黄芩苷的积累情况相似。另外，黄芩愈伤组织生长和
黄芩苷积累还受多种因子的调控作用，本研究结果
表明，黄芩愈伤组织生长和黄芩苷积累的优势培养
条件：在基本培养基MS中氮源浓度为60mmol／L
(NH。+：NOa为1：1)，KH2PO。浓度0．5～1．5
mmol／L时，附加80g／L蔗糖，0．3mg／LIAA、2
mg／L6-BA和200mg／L蛋白胨(25士1)℃，暗培
养。愈伤组织培养40d，生物量达28．7g／1，，黄芩苷
量167．4mg／g，明显高于野生黄芩的量。
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铁皮石斛根尖诱导丛生芽研究
詹忠根
(浙江经贸职业技术学院。浙江杭州310018)
摘要：目的探索铁皮石斛根尖再生丛生芽的适宜条件及类原球茎的起源。方法切取0．3～0．5cm的根尖为
外植体，以B5为基本培养基，附加不同种类和质量浓度的植物生长调节剂进行培养。结果诱导根尖形成了愈伤
组织、类原球茎或直接转化成芽且获得再生植株。通过细胞学观察认为铁皮石斛的类原球茎是单细胞起源的体细
胞胚。结论为铁皮石斛组织快繁建立新的体系。
关键词：铁皮石斛；禽伤组织；类原球茎；体细胞胚发生
箨薯晶羿：誓訾杂％l品1一)，男，浙江江山人，硕十研究生，主要从事组织培养研究
Tel：(0571)85919482Email：zhz99321@tonitom．
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第6期2006年6月·929·
中围分类号：R282．2 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)060928— 4
Clustershootsinductionfr mroot—tipsegmentsofDendrobiumofficinale
ZHANZhong—gett
(CollegeofZhejiangEconomicandTradePolytechnic，Hangzhou310018，China)
Keywords：Dendrobiumoffic naleKi uraetMigo；callus；protoeormlikebodies(PI，Bs)；somatic
embryogenesis
铁皮石斛Dendro&umfficinaleKimuraet
Migo是国家一级保护植物，具有益胃生津、滋阴清
热之功效。近年来，铁皮石斛的离体培养主要集中于
原球茎增殖及苗的分化，所用的外植体有种子、无菌
苗幼苗茎段、原球茎及人工种子等”1。本研究以根尖
分生组织为外植体，通过组织切片研究其愈伤组织
诱导和再生植株的细胞学过程，以期建立新的组织
快繁体系及遗传转化受体系统，为通过基因工程改
良铁皮石斛品系提供理论基础。
1材料和方法
1．1 外植体：选择生长健壮、根长为3cm左右的铁
皮石斛无菌苗，用刀片小心切除根冠后，取长约0．3～
0．5em的根尖分生组织平放于培养基中培养。
1．2培养条件：根尖诱导、不定芽增殖及生根的基
本培养基为B5，通过调整植物激素的组合与配比、
改变天然附加物及微量元素的量等方法研究根尖分
生组织在不同培养条件下的生长发育状况。以上所
有培养基中均加入蔗糖30g／L，琼脂6．1g／L，pH
5．8；培养条件为(25士1)℃，光照强度为800lx，持
续光照。
1．3组织切片与扫描电镜观察：冷冻切片：在37℃
下，材料先用4“的阿拉伯树胶浸泡9h，再移人
10％的阿拉伯树胶浸泡10h后进行切片；石蜡切
片：材料用FAA固定，常规切片，厚度为8pm，1％
番红染色；扫描电镜：材料用戊二醛固定，常规制样。
2结果与分析
2．1植物激素对根尖培养的影响：为r全面考察植
物生长调节剂的组台与配比、天然附加物及培养基
中微量元素的量等因素对根尖离体培养的影响，共
设计了20种培养基(表，8周后统计愈伤组织诱
导率、类原球茎诱导率及直接成芽率。
2．1．1愈伤组织的诱导：根尖在1～8号培养基中
培养后，其生长点细胞经多次分裂形成浅绿色、表面
较光滑的致密愈伤组织(图1—1)。通过比较根尖在
1～8号培养基中的生长状况，认为低质量浓度的2，
4一D(0．2～1．0mg／l，)能诱导愈伤组织的形成，只是
表1植物激素等因素对根尖形成愈伤组织及
原球茎的影响
Table1 Effectofplanthormonencallus
andPLBsofroottipformation
⋯素省黧蕊嚣
0．5
1 O
3 O
3 0
3 0
0 5
1 0
3 0
0
0
0
0
O
0
1C．4
25．3
4 6
5．9
4．8
8．8
106
l 3 9
i6 增力111倍 O 0 0
l7 鼢1／3 o 0 5 5
18 碱为1／3 1％芋头汁 o o 6 7
l 9 o 1 减为1／3 l“椰子汁 o 0 2 2
11 1：! 墅!!!!!!壁蔓!!!! 坐
诱导率较低(2．9％～16．2％)，若在培养基中添加适
当质量浓度的6-BA能明显提高愈伤组织的诱导
率，而加入NAA则促进根尖伸长，不利于愈伤组织
的诱导。从根尖在9～20号培养基中的生长情况可
知．2，4一D对于愈伤组织的诱导是必不町少的，在不
含2，4D的培养基中均未能诱导愈伤组织产生。
2．1．2类原球茎的形成：形成类原球茎的途径有两
条，一是通过愈伤组织分化得到。1～6号培养基中
诱导产生的愈伤组织生长缓慢，若继续在原培养基
中培养或继代到相同成分的新培养基中，则绝大多
数愈伤组织出现褐化现象，极少数幸存下来的愈伤
组织经多次继代后也未见分化出类原球茎。2，4D
表现出促进愈伤组织的生长而抑制类原球茎形成，
这种阶段效应可能是它在某种程度}破坏了内源生
长索的极性分布，从而抑制了胚胎的进一步发育和
O
0
D
0
O
0
L
i丑丑i
O
O
0
i
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O
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0
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0
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万方数据
·930· 中革前 ChineseTradlHonala dHerhalDrugs第37卷第6期2006年6月
成熟。若将愈伤组织转接到B5+NAA0，5rng／L+
6-BA3，0mg／L中培养或者根尖直接培养在7、8号
培养基中，则愈伤组织生长较快，其表层细胞会进行
平周分裂，内层细胞进行垂周分裂，致使整个组织形
成不规则的突起(图12)。而后，靠近表层的部分愈
伤组织细胞体积增大、细胞质变浓、细胞壁加厚，与
周围细胞形成明显的界限，即部分愈伤组织细胞开
始转变为胚性细胞。胚性细胞经多次分裂后可形成
球形细胞团，并进一步发育成绿色的类原球茎(图
1～3～5)。二是由根尖分生组织直接分化产生(图1—
6)。培养在9～14号培养基中的根尖，其生长点细胞
能直接转变成胚性细胞。通过冰冻切片可观察到这
些细胞的第1次分裂是不均等的，即先分裂成1个
基细胞和1个顶细胞，继而发育成类似于胚胎发育
或胚状体形成时的早期原胚期阶段的球形细胞团。
随着发育的继续，这种胚性细胞团的基部细胞开始
伸长、增大，逐渐失去分生能力，而顶端的细胞分裂
能力仍很活跃，致使整个组织形成不规则的突起，这
些突起逐渐长成卵圆形后形成类原球茎。可见，铁皮
石斛的类原球茎是单细胞起源的体细胞胚。实验表
明，NAA和6BA在类原球茎的形成过程中，不仅
可诱导愈伤组织分化为类原球茎，也可以诱导根尖
不经过愈伤组织阶段而直接产生类原球茎，这可能
是由于内源细胞分裂素的积累导致IAA与Cks的
比例下降引起的“。
2．1．3根尖直接再生芽：培养在9～11号培养基中
的根尖，除产生一定比例的类原球茎外，还出现根尖
分生组织直接分化成芽的现象(图17)，由于高等
植物根和芽的分生组织是分别由高度决定的细胞所
构成的，在胚胎时期，甚至在整个生命过程中都有明
显不同，所以根芽之间的转化非常困难，转化的频率
相当低口“]。在实验中发现降低微量元素的质量浓度
(15～17号培养基)，同时低质量浓度的芋头汁
(18～20号培养基)能在一定程度上提高直接再生
芽的比率。若在培养基中添加NAA则不仅使成芽
的比率下降也使成芽的时间大大延长(9～11号培
养基)，而在同时含有NAA和6一BA的培养基中根
尖分生组织只分化成类原球茎而不能直接再生芽。
I一根尖分生组织诱导产生愈伤组织2愈伤组纵表面产生突起3一愈伤组织分化成类原球茎4一荚原埭茎
5娄原球茎纵切 6根尖分生组织直接分化成类原球茎 7离体根直接再生芽
1 calluswereinducedfromrootID2 tuberf omcallus‘surface3 PLBsdifferentiationfromcallus4～PLBs
5一longitudinalsect|0nofPLBs6一PLI±sfromroott】pdirectly7一regenerationbudfromisolateduool—npdirectly
图l铁皮石斛根尖诱导丛生芽
Fig．1Clustershootsinductionfr mroot—tipsegmentsofD-officinale
2．2植株再生：将类原球茎转接到B5+NAA0．5 体细胞胚发生途径再生植株，发生方式有两种：一是
mg／L+】0％椰子汁的培养基中进行培养，类原球茎间接发生途径，即通过脱分化形成愈伤组织后，由愈
逐渐变长，其顶端分生组织先分化出芽，然后叶原基 伤组织的某些细胞转化为胚性细胞并继续分裂形成
进一步发育成幼叶。稍后，在其基部出现根原基，根 多细胞原胚以及不同发育时期的体细胞胚。适宜培
原基细胞分裂延伸为根，内部分化出维管束，最后形 养基是B5+2，4一D0．5mg／L+NAA0．5mg／L+
成完整的幼苗。类原球茎在分化的同时，也会不断增 6-BA3．0mg／L；二是直接发生途径．即直接从外植
殖，产生许多新的类原球茎，最后逐渐形成丛生小 体某些部位的特定细胞诱导分化出体细胞胚，适宜
芽。两种不同途径产生的类原球茎的分化能力有明 培养基是B5+NAA0．5mg／L+6-BA3．0mg／L。
显不同，由根尖直接产生的类原球茎在分化培养基 另外，根尖也可以经器官发生途径再生植株，即根尖
中绝大多数都能分化成小苗，而由愈伤组织分化而 分生组织经培养后直接形成芽。进而发育成完整的
来的类原球茎分化能力很弱，大多数最终褐化死亡。 植株，适宜培养基是B5(微量元素减为1／3倍)+
3结论 1％芋头汁。虽然用根尖诱导生产类原球茎的频率还
本研究以根尖为外植体进行铁皮石斛的组织快 有待进一步提高，但由于铁皮石斛类原球茎的增殖
繁研究。实验表明，在不同的培养条件下，根尖可经 与分化频率很高，相应技术也已相当成熟，所以一邑
万方数据
中草黄ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第6期2006年6月-931·
诱导成功，就可通过扩增用于大规模生产。
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甘草愈伤组织培养中激素优化组合的研究
刘 颖，魏景芳，李冬杰
(河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018)
摘要：目的选择甘草愈伤组织诱导和继代培养的最佳激素组合。方法 以甘草无菌苗的胚根为外植体设计正
交试验考察不同浓度的激素组合对愈伤组织诱导和继代的影响。结果 以诱导率为指标．NAA对甘草细胞脱分化
影响最显著；以相对生长速率为指标．6一BA、2，4一D、NAA对甘草细胞生长分裂影响最显著。结论甘草愈伤组织诱
导及继代的最佳激素组合为2，d—D1．0mg／L+NAA1．0mg／L+6BA1．0mg／I。IKT0．3mg／L。
关键词：tj草；愈伤组织；正交试验法；激素组合
中圈分类号：R28：2 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)06一093l—03
OptimumcombinationsofplanthormoneincalluscultureofGlycyrrhizauralensis
Lit]Ying．WEIJing—fang．L1Dongjie
(CollegeofBiosciencea dBioengineering。HebeiU iversity。fScienceandTechnology-Shijiazhuang050018，China)
Keywords：G如cyrrhizauralensisFisch．；callus；orthogonaltest；hormonecombinations
甘草GlycyrrhizauralensisFisch．为豆科多年
生草本植物，其根和根茎为常用中药，具有补气健
脾、清热解毒、润肺止咳、缓急止痛，调和药性之功
效。这些年来，甘草自然生产量逐年锐减，因此，利用
组织培养技术对甘草进行无性快繁，加快甘草次生
代谢活性物质的提取已迫在眉睫。目前，有一些关于
甘草组织培养方面的报道“J，但在这些研究中，所用
培养基中植物激素的组合是否最佳难以比较。本研
究采用正交试验设计法考察2，4D、NAA、6BA、
KT4种植物激素对甘草愈伤组织诱导和生长产生
的影响，确立最佳的激素组合，为进一步稳定培养物
的有效生长速率和提高其中含有效成分的量，建立
稳定高产的甘草次生代谢产物牛产体系奠定实验
基础。
1材料与方法
新疆甘草无菌苗的胚根切成1cm长的小段。均
匀接种在培养基表面。所用基本培养基为MS
(120℃，0．1MPa，灭菌20min)，培养条件采用暗
培养，(25士】)‘C。
1．1 愈伤组织诱导及继代培养：本试验采用正交设
计考察植物激素对甘草愈伤组织诱导及生长的影
响。综合分析了生长素和细胞分裂素对愈伤组织诱
导的影响‘⋯，在MS基本培养基中添加2，4D、
NAA、6BA、KT4种不同质量浓度的激素，I。(44)
试验设计见表L
表1因素水平
Table1 Factorsandlevels
外植体接种7d，胚根肿胀、膨大，20d胚根表
面产生分散的愈伤组织．颜色淡黄色、质地疏松，统
计不同浓度的激素组合对甘草胚根愈伤组织诱导率
鉴鍪品皙：霈驻署葑强技术研究与发展计划项目(。。。。；5．：D)
作者简介：刘Tel：颍(03“11吣)8。8—63k2河167北鼍要盘i嚣击玉零裂i裹黧用植物次生代谢产物的研究工作
万方数据
铁皮石斛根尖诱导丛生芽研究
作者： 詹忠根， ZHAN Zhong-gen
作者单位： 浙江经贸职业技术学院,浙江,杭州,310018
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(6)
被引用次数： 13次

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