全 文 ：RP-HPLC梯度洗脱测定叶下珠中没食子酸的含量
王伽伯1, 2 ,陈 雷3,王 玉4,肖小河2
( 1. 解放军第 302 医院,北京 100039; 2. 军事医学科学院, 北京 100850; 3. 锦州医学院,
辽宁 锦州 121001; 4. 长春中医学院, 吉林 长春 130117)
叶下珠 Phyl lanthus urinaria L. 为大戟科叶下
珠属植物叶下珠的干燥全草,具有平肝清热、利水解
毒的功效。现代药理实验证明,叶下珠具有抗乙肝病
毒、保肝等作用[ 1]。没食子酸为其有效成分之一,是
可水解鞣质的单体,具有抗病毒作用,在多种中药材
中存在。然而,已报道的没食子酸测定方法对杂质干
扰耐受力不强,重现性较差。没食子酸相对分子质量
小,结构中带有羟基和羧基, 极性很大,通常只适合
用正相键和柱分析,但是正相柱使用成本高,不及反
相柱普及率高,如何建立适合反相色谱柱分析的方
法尤显重要。在反相柱上测定没食子酸含量,关键是
增大流动相中水相比例,延长没食子酸出峰时间,同
时又能在较短时间内将样品中的低极性杂质干扰去
除,保证进样分析的连续性。梯度洗脱即可实现这一
目的。为此,笔者采用梯度洗脱技术测定没食子酸的
含量,方法简便、快速、准确、重现性好。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪:惠普 HP—1110四元梯度泵;
HP—1110 DAD检测器; HP Chemstat ion化学工作
站;甲醇为色谱纯; 磷酸等其他试剂均为分析纯;没
食子酸对照品( 0831-9501) (供含量测定用,中国药
品生物制品检定所) ;叶下珠药材由中国医学科学院
药用植物研究所西双版纳分所高海泉研究员提供。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件: Kromasil C18分析柱( 250 mm×4. 6
mm , 5 m) ; 检测波长: 280 nm ; 流动相: A 甲醇, B
0. 1% 磷酸水溶液; 梯度洗脱条件: 0～15 m in, A-B
( 15∶85) ; 15～17 min, A-B ( 90∶10) , 17～32
min, A-B ( 90∶10) ; 32～35 min, A -B( 15∶85) ;体
积流量: 0. 5 mL/ m in;柱温为室温。
2. 2 供试品溶液的制备: 取叶下珠药材粗粉,精密
称取0. 2 g ,置锥形瓶中, 精密加入甲醇 25 mL, 称定
质量, 冷浸 24 h [ 2] , 再称定质量, 用甲醇补足减失的
质量,摇匀,滤过, 取续滤液作为供试品溶液。
2. 3 对照品溶液的制备:精密称取经五氧化二磷减
压干燥 36 h 的没食子酸对照品适量, 加甲醇制成
0. 023 5 mg / mL 的溶液,即得。
2. 4 线性关系的考察:分别精密吸取没食子酸对照
品溶液 2、4、8、12、16、20 L, 依次注入高效液相色
谱仪,按上述色谱条件测定峰面积,以峰面积积分值
为纵坐标,没食子酸的量( g )为横坐标, 绘制标准
曲线, 回归方程为: Y = 4 879. 4 X - 34. 6, r =
0. 999 9 ( n = 6) , 结果表明没食子酸在 0. 047～
0. 470 g 呈线性关系, 可用外标一点法测定含量。
2. 5 稳定性试验:取供试品溶液,分别于配制后 0、
2、4、8、12、24 h, 依样品测定法测定, 其峰面积的
RSD= 0. 51%,供试品溶液在 24 h内基本稳定。
2. 6 精密度试验:精密吸取没食子酸对照品溶液 10
L,重复进样6次,测定其峰面积的RSD= 0. 37%。
2. 7 重复性试验:对同一样品取 6份, 平行测定, 以
外标法计算质量分数, 平均质量分数 1. 153 mg/ g ,
RSD= 0. 33%。
2. 8 加样回收率试验:精密称取已知含量的同一批
样品 0. 2 g, 精确加入没食子酸对照品溶液适量, 按
样品溶液的制备方法操作,测定其含量,并计算平均
回收率为 98. 05% , RSD= 1. 05% ( n= 6)。
2. 9 样品测定: 按样品测定方法测定 3 批药材样
品,测定结果见表 1。色谱图见图 1。
表 1 样品测定结果 ( n= 3)
Table 1 Determination results of samples ( n= 3)
批 号 没食子酸/ ( mg·g- 1)
1 1. 141
2 1. 159
3 1. 164
3 讨论
3. 1 流动相的选择:在 C18柱上用文献[ 2]报道的流
动相甲醇-水-磷酸( 4∶96∶0. 05)进行分离,没食子
酸峰形良好,但是大量极性相对较低的杂质吸附在
(下转第 131页)
·126· 中草药 Chinese T raditional and Herbal D rug s 第 36 卷第 1 期 2005年 1月
收稿日期: 2004-04-11作者简介:王伽伯( 1981—) ,男,现为军事医学科学院 2002级硕士研究生,研究方向药剂学。 E-m ail : hos owjb@ sohu . com
* 通讯作者 Tel: ( 010) 66933322 E-m ail : xiaoxh@ hotmail. com
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(上接第 126页)
图 1 没食子酸对照品(A)和叶下珠
药材(B)的 HPLC 图
Fig. 1 HPLC chromatograms of gallic acid (A)
and P. urinaria (B)
色谱柱上无法洗脱,严重影响后续的含量测定。所
以, 本实验采取梯度洗脱技术,去除大量杂质干扰,
保证了后续含量测定。
3. 2 色谱峰光谱一致性检测:应用二极管阵列检测
器和色谱工作站, 对对照品色谱中没食子酸峰与供
试品色谱中的相应峰进行光谱扫描, 结果两者光谱
吸收图谱基本一致。
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