全 文 ：·1688· 中草喃ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月
理过程会增加HSPC的丢失，从而影响患者的造血
恢复；另一种是要求洗去冷冻保护剂后回输，认为冷
冻保护剂对人体可能有一定程度的副作用。本研究
提示；洗去冷冻保护剂和在体外与APS共培养的过
程，不但不会造成造血细胞数量的减少，还能提高
CD34+细胞的量。故认为回输时洗去冷冻保护剂并
在体外和适宜质量浓度的APS共同培养，可能更有
利于造血的恢复。
体外扩增是克服脐血干细胞数量不足，限制其
应用的主要途径[9’10。，联合多种HGFs选择适宜的
培养条件及扩增时间，可以在有效地扩增其数量的
同时保证其质量。APS能否和HGFs发挥协同作
用，增强脐血造血细胞冷冻后的扩增潜能，值得进一
步探讨。本实验以冷冻复苏的脐血MNC作为培养
的起始细胞，加入不同质量浓度的APS联合HGFs
组合(SCF+IL-3+GM—CSF+G—CSF+EPO)进
行体外扩增。实验结果说明适宜质量浓度的APS能
与HGFs组合发挥协同作用，促进冷冻复苏后的脐
血造血细胞的体外扩增。但CD34+细胞率增加不明
显。Gilmore等口1]认为，用SCF联合lL一3、IL一6、
GM—CSF等扩增脐血CD34+细胞，主要导致造血干
细胞发生分化，而不是增殖；APS在实验中可能和
以上细胞因子发生了协同作用，促进CD34+细胞发
生的分化效应强于增殖效应，从而导致CD34+细胞
率变化不显著；也可能是CD34+细胞的扩增和
MNC的扩增不同步，造成了CD34+细胞在MNC
的比例发生了不同步的变化，从而各个组CD34+细
胞率变化不明显。
综上所述，APS能促进冷冻脐血造血细胞的复
苏、增殖，提高脐血造血细胞冷冻损伤的可恢复性。
且能与HGFs协同，提高冷冻复苏的脐血造血细胞
的体外扩增潜力。但其作用机制有待进一步研究。
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龙葵碱对人肝癌HepG2细胞Ⅳ一乙酰基转移酶活性的影响
高世勇1”，季宇彬1’2
(1．哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心药物研究所博士后科研工作站，黑龙江哈尔滨150076}
2．国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，黑龙江哈尔滨 150076)
摘要：目的探讨龙葵碱对HepG2细胞Ⅳ一乙酰基转移酶(NAT)活性的影响。方法采用HPLC方法，以2一氨
基芴(2．AF)为底物，以2-AF被NAT乙酰化为2一乙酰氨基芴(2一AAF)的量来反应NAT的活性。结果龙葵
碱能显著降低HepG2完整细胞NAT的活性；龙葵碱能够降低HepG2细胞质内NAT的活性，作用具有剂量依赖
性。结论 龙葵碱通过抑制HepG2细胞NAT的活性发挥细胞毒作用。
关键词：龙葵碱；HepG2细胞IN-乙酰基转移酶(NAT)
中图分类号：R286．91 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)11—1688一04
收稿日期：2008—05—14
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30400591)-黑龙江省自然科学基金资助项目(D2004—13)，哈尔滨市青年基金资助项目
(2004AFQXJ035)
作者简介：高世勇(1975一)．男，博士．副研究员，研究方向为肿瘤药理学．Tell(0451)84800297E—mail：syga02002@163．com
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月· 689·
EffectofsolanineonN—acetyltransferaseactivityinH pG2cell
GA0Shi—yongh2，儿Yu—binh2
(1．PostdoctoralPr gramme，InstituteofMateriaMedica·CenterofResearchandDevelopmentollLifeSciences
andEnvironmentSciencesofHarbinUniversityofCommerce，Harbin150076，China；2．MOEEngineering
ResearchCenterofNaturalAnticancerDrugs，HarbinUniversityofCommerce，Harbin150076，China)
Abstract：ObjectiveToexploretheffectofsolanineo Ⅳ一acetyltransferase(NAT)activityin
HepG2cell．MethodsEmployingHPLC，using2一AFassubstrate，takingconce trationof2一AFas
concentrationofsubstrate，inintactHepG2cellsandtheircytoplasm，takingthespeedof2一AFbeing
acetylatedto2一AFFbvNATastheactivityofNAT．ResultsTheresultsshowthatsolaninecouldinhibit
theactivityofNATinintaceH pG2cellandthecytoplasm．ConclusionSolanineactstocytotoxicityto
HepG2eellbyinhibitingtheNATactivity．
Keywords：solanine；HegIG2c ll，N—acetyltransferase(NAT)
流行病学调查表明人类70％的肿瘤来源于环境
中的危险因素，而在众多的环境危险因素中化学类
致癌物占70％～90％，这些化学致癌物中芳香胺类
化合物是重要代表。芳香胺类化合物大多本身并没
有致癌活性，而是在机体内被Ⅳ一乙酰基转移酶(Ⅳ一
acetyltransferase，NAT)等相关酶活化为致癌物，
并且NAT是这些芳香胺类化合物活化反应的第一
步，也是限速步骤。NAT属于I相代谢酶，能够将
乙酰辅酶A的乙酰基转移至芳香胺类化合物上，而
将芳香胺类化合物活化为致癌物质。NAT在人体
内活性的大小与肿瘤的易感性密切相关。目前对
NAT活性相关研究主要集中在肠癌和膀胱癌，而
对肝癌的发生与NAT的相关研究相对较少。前期
研究表明龙葵碱具有明显的抗肿瘤作用[1~3]，且对
人肝癌HepG2细胞有细胞毒作用[‘]。本实验研究龙
葵碱对NAT活性的影响，探讨龙葵碱对HepG2的
细胞毒作用机制。
l材料
1．1 细胞株：HepG2人肝癌细胞株购自美国
ATCC(AmericanTypeCultureCollection)，由黑
龙江省肿瘤医院肿瘤研究所保种提供。
1．2 药品与试剂：龙葵碱(质量分数99．9％)由黑
龙江省药品检验所提供。2一乙酰氨基芴(2一AAF)、
Tris、亮抑酶肽、乙酰脯酶A(AcCoA)、BSA、
DTNB购自美国Sigma公司；2一氨基芴(2一AF)、乙
酰肉毒碱、肉毒碱乙酰转移酶购自美国Fluka公
司；DTT购自国药集团化学试剂有限公司；PMSF
购自美国Amresco公司；RPMI一1640细胞培养液购
自美国Hyclone公司f胰酶购自美国Gibco公司；胎
牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。
1．3仪器：Waters高效液相色谱仪(美国Waters
公司)；超净工作台(苏州净化设备厂)；二氧化碳培
养箱(美国NBS公司)；超声波提取器(天津奥特
赛恩斯仪器有限公司)；台式冷冻离心机(美国
Beckman—Coulter公司)。
2方法
2．1 细胞培养及给药：HepG2细胞在含10％胎牛
血清的RPMI一1640培养基中，5％C02、37℃条件
下培养，3～4d传代1次。当细胞生长状态稳定，呈
对数生长期时，0．25％胰酶消化细胞后用含10％
胎牛血清的RPMI一1640培养基调整细胞浓度为
5×105／mL，将细胞悬液加入100mL培养瓶中培
养。实验分龙葵碱10、2、0．4、0．08、0．016弘g／mL组
及阴性对照组。放入5％CO。、37℃培养箱培养24
h后，龙葵碱组分别加入不同质量浓度的龙葵碱，阴
性对照组加入等体积熔媒，放入5％CO。、37℃培
养箱继续培养。
．2龙葵碱对HepG2细胞NAT活性的影响
2．2．1标准曲线的绘制：用甲醇配制2一AAF标准
品溶液，质量浓度分别为0．00625、0．0125、0．025、
0．05、0．1、0．15、0．2、0．25、0．3、0．35mg／mL，依次
进样，进样量1弘L。Waters液相色谱条件：
SymmetryShieldC18色谱柱(250mm×4．6mm，
5弘m)，流动相为20mmol／LKH2P04(pH．5)一
CH3CN(53：47)，检测波长288nm，柱温(25士
5)℃。峰面积由Empower工作站软件自动积分，采
用Excell软件以对照品质量浓度和峰面积分别为
横纵坐标做标准曲线，并计算相关系数，给出标准曲
线方程。
2．2．2不同质量浓度龙葵碱对HepG2完整细胞
NAT活性的影响：取生长良好处于对数生长期的
HepG2细胞，胰酶消化后，用含10％胎牛血清的
RPMI一1640细胞培养液调整细胞至适当的浓度，分
装至7个100mL细胞培养瓶中，细胞浓度为5×
万方数据
·1690· 中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs39卷第11期2008年11月
105／mL，放人37℃、5％CO。培养箱中培养24h
后，加入底物2-AF45／umol／L及不同质量浓度的
龙葵碱(终质量浓度0．016、0．08、0．4、2、10弘g／
mL)，阴性对照组不加龙葵碱，37℃、5％CO：培养
箱中培养24h。吸出培养液，3500×g离心10rain，
上清液立即以等体积醋酸乙酯一甲醇(95：5)萃取2
次，萃取液挥干后，将残渣溶于2mL甲醇中混合均
匀，Waters高效液相色谱(HPLC)自动进样20pL
进行检测，色谱条件同2．2．1项。保留时间2一AAF
约为13．5rain，2-AF约为17min。经由HPLC分
析2一AAF的量来反应NAT的活性。NAT的活性
用1×106细胞对应的乙酰化底物(nm01)表示。
2．2．3龙葵碱作用不同时间对HepG2完整细胞
中NAT活性的影响：细胞按2．2．2项方法消化后，
放入37℃、5％CO：培养箱中培养24h，加入2一AF
45／lmol／L及终质量浓度2弘g／mL的龙葵碱，阴性
对照组给等体积溶媒，37℃、5％CO：培养箱中培养
12、24、36、48h后，将细胞及培养基移取离心，按
2．2．2项实验步骤操作测定。
2．2．4龙葵碱对HepG2细胞质中NAT活性的影
响：取处于对数生长期的HepG2细胞1×107个，胰
酶消化后，PBS洗两遍，沉淀的细胞悬浮在2mL的
裂解液[20mmol／LTris—HCl(4℃、pH7．5)，1
mmol／LDTT，1mmol／LEDTA，50／umol／L
PMSF，10／比mol／L亮抑酶肽]中。接下来的步骤均
在4℃下进行，悬液用超声波破碎20min，先以
9000×g离心1rain，上清液100 0×g离心60
rain，取上清液置于冰浴中备用，测定NAT活性和
蛋白的量，蛋白定量测定采用Bradford方法，BSA
作为蛋白标准。活性测定实验中通过测定被乙酰辅
酶A依赖的NAT乙酰化的2-AF的量，即2一AAF
生成的量，来反应细胞质中NAT的活性。实验分7
组，分别为阴性对照组，空白对照组，0．016、0．08、
0．4、2、10／比g／mL龙葵碱组。反应混合液总体积550
弘L：包括250弘L的细胞质液，10弘L乙酰辅酶A循
环混合液，加入一定量的2一AF及不同量的龙葵碱，
使 -AF终浓度为0．04mmol／L，龙葵碱终质量浓
度分别为0．016、0．08、0．4、2、10pg／mL，37℃温
育5rain，加入200弘L1 mg／mL的乙酰辅酶A开始
反应。空白对照组不加乙酰辅酶A而加入等量的双
蒸水。乙酰辅酶A终浓度为0．45mmol／L。将混合
液于37℃温育6h，取出后加入900pL乙腈终止
反应。混合液经滤膜滤过后，HPLC测定2一AAF的
量，条件同2．2．2项，观察龙葵碱对细胞质液中
NAT活性的影响。
2．3数据处理：数据采用Exeell进行统计处理，结
果以．27士s表示。
3 结果
3．1 龙葵碱对NAT活性的影响
3．1．1标准曲线的绘制：2-AAF在287．8nm有最
大紫外吸收，故在HPLC测定过程中，选取288nm
作为最大吸收。以2-AAF对照品溶液的质量浓度
为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归
方程为Y=8×106X--4010．6，，．=0．9999。
3．1．2不同质量浓度龙葵碱对HepG2完整细胞
NAT活性的影响：结果见表1。与阴性对照组比较，
龙葵碱能够减少2-AAF生成的量，并且随着龙葵
碱质量浓度的增加，2一AAF生成的量逐渐减少。
3．1．3龙葵碱作用不同时间对HepG2完整细胞
NAT活性的影响：结果见表2。2Pg／mL龙葵碱
衷1不同质量浓度龙葵碱对HepC2完整细胞NAT活性的
影响Q士s。一=6)
Table1 EffectofsolanlneInvariousconcentr鱼tIOn
onNATactivityinIntactHepG2cells
(；士$，一一6)
与阴性对照组比较：～P<0．01
‘。P<0．01wnegativecontrolgroup
表2龙葵碱作用不同时问对HepG2完整细胞NAT活性的影响(；士s，一=6)
Table2 EffectofsolanineoNATactivityinintactHepG2cellsatdifferenttimes
followingitsadministration(；士s，n--6)
与阴性对照组比较：一P<0．01
”P<0．01讲negativecontrolgroup
万方数据
中革焉ChineseTraditionalandlterbalDrugs第39卷第11期2008年11月· 691·
分别作用于HepG2细胞12、24、36、48h，随着作用
时间的增加，2-AAF生成的量逐渐增多，但龙葵碱
组与同一时段的阴性对照组比较，能够显著减少2一
AAF生成的量。
3．1．4龙葵碱对HepG2细胞质中NAT活性的影
响：结果见表3。不同质量浓度龙葵碱作用于
HepG2，与阴性对照组比较，能够降低2一AAF生成
的量，即降低细胞质中的NAT活性。
哀3不同质量浓度龙葵碱对Hel，G2细胞质中NAT
活性的影响G士s，露=6)
Table3 Effectofsolanineinvariousconcentration
onNATactivityincytoplasmofHepG2
cells(i士s，露=6)
胞和细胞质内NAT酶都有一定的影响：龙葵碱能
够降低HepG2完整细胞和细胞质内2-AAF生成
的量，并且具有剂量相关性；随着作用时间的延长，
2一AAF生成的量逐渐增多，但在相同作用时间下龙
葵碱均能够降低2一AAF的生成。因此，龙葵碱是一
种NAT的抑制剂，龙葵碱对HepG2细胞的抑制作
用与其抑制NAT活性有一定关系，作为NAT抑
制剂，分为非竞争性抑制、竞争性抑制和反竞争性抑
制剂。龙葵碱是通过哪种方式抑制NAT活性的，这
与龙葵碱抑制NAT的进一步作用机制密切相关，
还有待于进一步的实验研究。
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幻
胡
们
胡
阳
刀
叩
们
阳
妇
幻
钉
幻
钉
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0
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口
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口
口
口
口
口
万方数据
龙葵碱对人肝癌HepG2细胞N-乙酰基转移酶活性的影响
作者： 高世勇， 季字彬， GAO Shi-yong， JI Yu-bin
作者单位： 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心,药物研究所博士后科研工作站,黑龙江,哈尔
滨,150076;国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心,黑龙江,哈尔滨,150076
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(11)
被引用次数： 7次

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