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Tissue culture of medicinal plant Swertia mileensis

药用植物青叶胆的组织培养



全 文 :中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月·261·
个引物对40个番薯植物品种扩增出2071个ISSR
片段,其中62.2%的片段为多态性的。本研究也揭
示了ISSR标记的多态性。在10个地黄品种中,用
10个ISSR引物扩增110条带,多态性比率为
71.82%。仅用一个引物ISSR6可以鉴别出本实验
所用的10个怀区地黄品种。
总之,ISSR技术是一种鉴定怀地黄种质的有效
和实用的工具。它能够检测到较高的多态性。用它
所得到的多态带对同物异名、同名异物地黄品种的
识别,对地黄生产育种组合亲本的选择;对杜绝生产
中假冒伪劣品种造成危害,以及对重要地黄种质的
利用都有很大指导意义。
致谢:本研究在华美生物工程公司完成,由河南
温县农业科学研究所张宝华所长提供实验材料,得
到了华美生物工程公司各级领导和全体员工以及在
博士后工作站进行研究的研究生们的大力支持与热
情帮助。
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药用植物青叶胆的组织培养
黄衡宇
(湖南吉首大学生态研究所,湖南吉首416000)
摘要:目的针对青叶胆野生资源受到严重破坏的情况,系统地探讨了通过组织培养为手段进行人工繁殖的方
法。方法 以幼茎和老叶为外植体,在MS培养基上添加不同的激素配比,改变培养方式。结果在所有实验方案
中,对叶片来说,较适宜诱导愈伤组织的激素组合是Zt0.5mg/L+NAA0.1mg/L+IBA0.1mg/L或BA0.5
mg/L+2,4一D0.1mg/L+IBA0.1mg/L,对幼茎来说,较适宜的诱导愈伤组织的激素组合则是BA0.02mg/L+
Kt0.04mg/L+IBA0.05mg/L;对于芽的增殖,较适宜的激素组合是BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L或BA2.0
mg/L+IBA0.1mg/L;而根的诱导则在MS+Kt0.01mg/L+IBA0.5mg/L+NAA1.0mg/L培养基上进行。结
论采用组织培养方式可进行青叶胆的快速繁殖,为确保这一珍稀药用植物资源的保护和可持续利用提供有效
途径。
关键词:青叶胆;组织培养;愈伤组织;芽丛
中图分类号:R282.13 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2005)02—0261—05
收稿日期:2004一04—26
作者简介:黄衡宇(1970一),男,江苏无锡人,博士,湖南吉首大学生物系讲师,从事植物发育生物学研究。
万方数据
·262· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月
Tissuecultureofmedicinalpl ntSwertiam leensis
HUANGHeng—yu
(InstituteofEcologyofJishouUniversity,Jishou416000,China)
Abstract:ObiectiveInordertopreservethenaturalesourcesofSwertiam leensiswhichhasbeen
destroyedseriously,theme odofartificialpropagationbywayoftissueculturehasbeensystematically
studied.MethodsTheimmaturestemsandthematureleaveswerethebestmaterialexplantsinrapid
propagationinall fthexperiments.TheseexplantswereculturedonMSculturemediaby ddingdiffer—
entportionsofhormonesatvariousc lturalconditions.ResultsFortheeaves,thesuitablephytohor—
monecombinationtoinducecallusareZt0.5mg/L+NAA0.1mg/L+IBA0.1mg/LorBA0.5mg/L+
2,4一DO.1mg/L+IBA0.1mg/L;forthestems,theyareBA0.02mg/L+KtO.04mg/L+IBA0.05rag/
L;fortheadventitiousbuds,theyarBA2.0mg/L+NAA0.5mg/LorBA2.0mg/L+IBA0.1mg/L;
andfortheroots,theyarMS+KtO.Olmg/L+IBAO.5mg/L+NAA1.0mg/L.ConclusionTissue
cultureofS.mileensiscanmakeitspropagationrapid,itsre ourcespr erved,anditsutilizationlast.
Keywords:SwertiamileensisT.N.HoetW.L.Shih;tissueculture;callus;adventitiousbud
青叶胆Swertiam leensisT.N.HoetW.L.
Shih为龙胆科獐牙菜属(SwertiaL.)多枝组一年
生草本植物,又名青鱼胆、苦胆草、肝炎草等,其性
寒、味苦,有清热解毒、利胆健胃的功效,是我国的一
种珍稀药材[1]。在云南省民间青叶胆被广泛用来治
疗急性黄胆型肝炎、肺炎、扁桃体炎及妇科炎症等。
然而,青叶胆由于滥采过度,加之其生态环境的破
坏,现野生居群已不多见。云南省不少地方曾尝试进
行过人工引种栽培,但由于缺乏有关该种生活史、有
性生殖及无性繁殖等方面的资料,往往以失败告终。
为有效保护和利用这一我国特有的类群,有必要对
该类群进行繁殖生物学研究,特别是通过以组织培
养为手段进行人工繁殖的研究,以期对其保护生物
学、引种驯化及育种做出积极、有效的成绩。
1材料与方法
1.1 材料:云南省开远市小龙潭镇水淹凹村附近荒
坡地(东经103。07.705’,北纬23。45.487及附近,海
拔1470~1530m)采集野生植株(凭证标本:黄衡
宇179,存于吉首大学资源与环境科学学院生物系
标本室。经云南大学生命科学学院胡志浩教授鉴
定),带土移栽于吉首大学生态研究所试验地,2个
月后,选取生长健壮、无病虫害个体,剪取其嫩茎、叶
和带芽茎段作为外植体。
1.2方法:晴天取3种不同的外植体,按下列程序
进行消毒:取材一自来水粗洗一5%洗衣粉水溶液漂
洗5min一自来水冲洗30min--,75%乙醇擦洗表
面一o.1%升汞溶液消毒2min-,-2%次氯酸钠消
毒15min一无菌水冲洗4~6次,然后在无菌工作
台中将外植体切成0.5~1.0cm长的小段接种于
诱导培养基上,将培养出来的愈伤组织切成小块,接
种于增殖培养基上;最后将形成不定芽的块段移至
生根培养基上,以培养出完整的小植株。以7d为一
周期。记录不同处理的生长状况。
1.3培养基:基本培养基为MS,附加不同浓度的
2,4一D(2,4一二氯苯氧乙酸)、BA(6一苄基腺嘌呤)、
IBA(吲哚丁酸)、IAA(吲哚乙酸)、NAA(萘乙
酸)、KT(激动素)和Zt(玉米素)。蔗糖3%,琼脂
0.6%,用0.1mol/LNaOH和0.1mol/LHCl调
节pH值为5.8~6.0,在高压灭菌锅中(121℃)灭
菌20min。
2 结果
2.1愈伤组织的诱导:不同外植体对诱导愈伤组织
的影响:嫩茎、叶和带芽茎段3种外植体接种于不同
激素配比的MS培养基上培养10d后幼嫩茎尖切
口处开始肿胀并出现愈伤组织;14d后,带芽茎段
切口处肿胀,但在以后很长时间内并不出现愈伤组
织;22d后,叶片从叶脉周围处肿胀并出现大量愈
伤组织。这说明在青叶胆组织培养中外植体的部位
对愈伤组织的诱导有很大影响:叶片诱导愈伤组织
的能力最强,其次是幼嫩茎尖,最差的是带芽老茎
段,诱导率几乎为零。
不同激素组合对愈伤组织发生的影响:将青叶
胆的成熟叶片剪成小块,接种在附加不同比例激素
的培养基上:I.MS+BA1.0mg/L+Kt0.5rag/
L+IBA0.5mg/L;Ⅱ.MS+BA2.0mg/L+Kt
0.1mg/L+IAA0.1mg/L;Ⅲ.MS+BA0.01
mg/L+Kt0.05mg/L+IBA1.0mg/L;IV.MS+
BA1.0mg/L+2,4一D0.5mg/L+IBA0.05rag/
L;V.MS+BA0.5mg/L+2,4一D0.1mg/L+
IBA0.1mg/L;V1.MS+Zt1.0mg/L+NAA0.5
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月·263·
mg/L+IBA0.5mg/L;Ⅶ.MS+Zt0.5mg/L+
NAA0.1mg/L+IBAO.1mg/L;Ⅷ.MS+Zt0.1
mg/L+NAA0.05mg/L+IBA1.0mg/L;IX.
MS+BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L;x.MS+
BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L。接种后置于22℃
散射光下培养,30d后统计愈伤组织诱导率,结果
见表1(污染数除外)。试验结果表明,对于叶片来
说,较适宜诱导愈伤组织的激素组合是BA0.5
mg/L+2,4一D0.1mg/L+IBA0.1mg/L或Zt
0.5mg/L+NAA0.1mg/L+IBA0.1mg/L。
表1不同激素组合对叶片诱导愈伤组织的影响
Table1 Effectofdifferentphytohormonecombination
oncallusinductionforleaves
培养基培养数 愈伤组织形成数 出愈率/% 生长量
++
+++
+++
++
+++
++
+:少量;++:绿色,质地紧密;+++:大量,表面有白色霜状
组织层;一:无
+:afew;++:grassyandcompact;+++:mass,with
whitefrostedissuelayerinsurface;一:naught
同时也对幼嫩茎尖诱导愈伤组织的能力进行了
试验。与叶片试验类似,将幼嫩茎尖接种在不同比例
激素的培养基上:I.MS+BA1.0mg/L+Kt0.1
mg/L+IBA0.01mg/L; Ⅱ. MS+BA
0.05mg/L+Kt0.05mg/L+IBA0.05mg/L;Ⅲ.
MS+BA0.02mg/L+Kt0.04mg/L+IBA0.05
mg/L;N.MS+BA0.1mg/L+Zt0.05rng/L+
IBA0.01mg/L;V.MS+BA2.0mg/L+NAA
0.05mg/L;Ⅵ.MS+BA1.0mg/L+NAA1.0
mg/L。接种后置于22℃散射光下培养,30d后统
计愈伤组织诱导率,结果见表2(污染数除外)。试验
结果表明,幼嫩茎尖也能产生愈伤组织,但效果不如
叶片好。多种激素组合试验显示,较适宜诱导愈伤组
织的激素组合是BA0.02mg/L+Kt0.04mg/L+
IBA0.05mg/L,但由幼嫩茎诱导的愈伤组织随着
培养时间的延长易褐变、衰老,不易作为继代培养的
材料。青叶胆愈伤组织的生长情况见图1—1、2。
此外,带芽老茎段同样也能少量地产生愈伤组
织,但生长势小,几乎不分化出丛苗。但它的侧芽却
表2不同激素组合对幼嫩茎诱导愈伤组织的影响
Table2 Effectofdifferentphytohormoneco bination
oncallusinductionfortenderstems
培养基培养数 愈伤组织形成数 出愈率/% 生长量
++
+++
++
++
+:少量;++:长势较旺盛,浅黄色,质地疏松;+++:大量,长
势旺盛,淡白色,较紧密;一:无
+:afew;++:vigorousrowth,loose,andpaleyellow;
十++:mass,withvigorousgrowth,morec mpact,andlight{
一:naught
能够生长,可以以类似“扦插”的方式进行繁殖。
2.2继代培养:将不同外植体诱导出的愈伤组织转
移到继代培养基中培养,发现不同的情况:由叶片诱
导的愈伤组织很快就分化出不定芽,且长势旺盛;由
带芽茎段生长出来的侧芽进行培养,虽无丛苗,但长
势也较旺盛;而由幼嫩茎尖诱导出的愈伤组织在转
接后不久便逐渐褐化死亡。将小块愈伤组织接种在
以下附加不同激素的培养基上培养,I.MS+BA
1.0mg/L+NAA0.05mg/L;Ⅱ.MS+BA1.0
mg/L+NAA0.1mg/L; m. MS+BA
2.0mg/L+NAA0。5mg/L;N.MS+BA1.0
mg/L+IBA0.5mg/L;V.MS+BA2.0mg/L+
IBA0.1mg/L;I/I.MS+BA1.0mg/L+IBA0.1
mg/L+NAA0.1mg/L。接种后置于22℃散射光
下培养,30d后统计不定芽及不定根的诱导率,结
果见表3。试验结果表明,不同激素组合对继代培养
的影响也较大。在BA低浓度培养基中生长量较小,
但不定根分化率较高;在BA高浓度培养基中生长
量较大,且不定根的分化率较低。最佳的激素组合为
BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L或BA
2.0mg/L+IBA0.1mg/L,在这两种组合的培养
基中,生长量和增殖率均大,而几乎不产生不定根,
这十分有利于继代培养(图1—3、4)。
袭3不同激素组合对愈伤组织幼苗分化的影响
Table3 Effectofdifferentphytohormoneco bination
oncallusseedingdifferentiation
鸲钾蛆档∞弘●ⅡⅢⅣVⅥ
珀髂姐铊鲫踮卯o
0%”踮∞趴四黔∞蛎船●ⅡⅢⅣVⅥⅦⅢⅨX
万方数据
·264· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月
2.3生根:将诱导发生的不定芽接种在以下附加不
同激素的培养基上:I.MS+BA0.5mg/L+IBA
1.0mg/L+NAA0.5mg/L;Ⅱ.MS+BA0.1
mg/L+IBA1.0mg/L+NAA1.0mg/L;Ⅲ.
MS+Kt0.01mg/L+IBA0.5mg/L+NAA1.0
mg/L;Ⅳ.MS+IBA1.0mg/L+NAA1.0mg/
L;V.MS+NAA2.0mg/L。接种后置于22℃散
射光下培养,30d后统计生长量及不定根的诱导
率,结果见表4(污染数除外)。
表4不同激素组合对根系分化的影响
Table4 Effectofdifferentphytohormoneco bination
onrootdifferentiation
+:少量,生长缓慢;++:较多,生长迅速;+++:大量,生长
旺盛
+:afewithslowerg owth;++:morewithrapidgrowth;
+++:mass,withvigorousgrowth
从试验结果得到了适宜的生根培养基配方为
MS+Kt0.01mg/L+IBAO.5mg/L+NAA1.0
mg/L。生根情况见图1—5、6。
1、2一诱导苗的生长情况 3、4-增殖苗的生长情况5、6-生根苗
的生长情况
1,2-growthfinducementsprouts3,4-growthfproliferous
sprouts5,6-growthfrootingsprouts
图1青叶胆的组织培养
Fig.1TissuecultureofS.mileensis
2.4试管苗移栽:当不定芽长够一定量时,将长至
3~4cm的丛芽切成单芽转至生根培养基中。25~
30d后,苗壮根粗时,将瓶盖打开,置于自然光下24
h,然后取出生根苗,小心洗尽残余培养基后移栽到
经0.1%甲醛消毒的细河沙中,保温保湿培养25d
(温度20~25℃,湿度70%左右),再移入沙土中
培养,待小苗长出4~5片新叶便可移栽至大田。
3讨论
3.1 组织培养基中通常以茎尖或茎段作为外植体
进行愈伤组织的诱导[2~5],但从青叶胆的培养看,与
其同科属近缘种植物川东獐牙菜相似[6],叶片是最好
的诱导材料。不仅材料易得,而且培养效率也较高。
3.2 诱导愈伤组织是植物组织培养中的一个关键。
一般来说,愈伤组织的诱导需要较高水平的生长素,
其中,2,4一D和Zt是最普遍使用而有效的生长素。本
研究结果表明诱导青叶胆愈伤组织,培养基内添加生
长素是必要的,而且以使用2,4一D和Zt的诱导效果
较好。从青叶胆不同激素组合的诱导培养基配方中可
以看出,Zt和2,4一D在外植体愈伤组织的诱导中是
必不可少的,但单独使用效果也不理想。对于叶片来
说,较适宜诱导愈伤组织的激素组合是Zt
0.5mg/L+NAA0.1mg/L+IBA0.1mg/L或
BA0.5mg/L+2,4一D0.1mg/L+IBA0.1mg/L,
对幼茎来说,较适宜的诱导愈伤组织的激素组合则是
BA0.02mg/L+Kt0.04mg/L+IBA0.05mg/L。
3.3在青叶胆的继代培养中,从结构和生长特点可
以将愈伤组织分为两类:一类是由叶片诱导出的愈
伤组织,其质地紧密,表面有白色霜状的组织层,易
分化出不定芽,是理想的继代材料;另一类是由幼嫩
茎尖诱导出的愈伤组织,其结构较致密,生长很慢,
不易分化出不定芽,而且随着培养时间的延长易褐
变、死亡,不能做为继代培养的材料。此外,与上述两
种材料不同,带芽老茎段培养生长出的侧芽在继代
中可以采用“扦插”的方式进行培养,繁殖系数也较
高,这也与其近缘种川东獐牙菜类似[6]。继代培养试
验表明,适宜的激素组合是BA2.0mg/L+NAA
0.5mg/L或BA2.0mg/L+IBA0.1mg/L。
3.4对生根培养来说,添加Kt比仅用生长素的效
果好得多。这表明Kt在川东獐牙菜的培养中不仅
对愈伤组织的诱导有用,而且对根的分化也起作用,
这与许多植物根分化的诱导不同[7’8],其生理、生化
机制还有待于进一步研究。生根培养试验表明:适宜
的激素组合是Kt0.01mg/L+IBA0.5mg/L+
NAA1.0mg/L。
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月·265·
3.5本研究为青叶胆的无性繁殖提供了一种方法,
有助于短期内提供大量的试管苗,通过人工栽培扩
大资源,确保青叶胆资源的保持和可持续利用。
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长春花叶片中吲哚生物碱增产的研究
张秀省1’3,张荣涛2,聂莉莉2,郭玉海1,翟志席1
(1.中国农业大学农学与生物技术学院,北京100094;2.南开大学生命科学学院,
天津300071;3.聊城大学农学院,山东聊城252000)
摘要:目的探讨乙烯利、乙酰水杨酸、色氨酸3种试剂对长春花植株中药用成分积累的影响。方法用不同质
量浓度的3种试剂溶液分别处理温室盆栽长春花植株,2d后,测定叶片中的总吲哚生物碱含量,并采用RP—HPLC
法测定长春碱和长春质碱的含量。结果 3种试剂处理后吲哚总碱、长春碱、长春质碱的积累均有明显的提高,并确
定了最适的处理质量浓度。结论3种试剂对长春花植物中吲哚生物碱的产生有明显的促进作用。
关键词:长春花;长春碱;乙烯利;乙酰水杨酸;色氨酸
中圈分类号:R282.13 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2005)02—0265—03
EnhancingaccumulationofindolealkaloidsinCatharanthusroseleaves
ZHANGXiu—shen91“,ZHANGRong—ta02,NIELi—li2,GU0Yu—hail,ZHAIZhi—Xi
(1.CollegeofAgronomyandBiotechnology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China;
2.CollegeofLifeScience,NankaiUniversity,Tianjin300071,China;3.College
ofAgronomy,LiaochengUniversity,Liaocheng252000,China)
Abstract:ObjectiveTos udytheffectofthreekindsofreagent:ethrel,Aspirin,tryptophanon
theaccumulationofmedicinalcomponentinCatharanthusrose sleaves.MethodsTotreatthesepotplants
ofC.roseusingreenhousewiththethreer agentsindifferentconcentrations,respectively.Then,tWO
dayslater,thecontentsofcatharanthineandvinblastineinleavesweredeterminedbyRP—HPLC.
ResultsThethreer agentscanobviouslyimprovetheaccumulationofindolealkaloids,includingcatha—
ranthinea dvinblastineinC.roseusleaves.Theiroptimumtreatmentco centrationw sfinallycorn—
firmed.ConclusionThesethreekindsofreagentapparentlypromotetheaccumulationof otalindole
alkoloidsintheleavesofC.roseus.
Keywords:Catharanthusroseus(L.)G.Don;vinblastine;ethrel;Aspirin;tryptophan
长春花Catharanthusroseus(L.)G.Don是一
种备受人们喜爱的观赏花卉,也是一种人们熟悉的
药材。中医临床可全株入药,有利尿止血、镇定安神、
平肝降压等功效。20世纪50年代以来,人们发现长
春花的次生代谢产物对急性白血病、恶性淋巴肿瘤
等具有很好的疗效‘川,从而对其产生了浓厚的兴趣。
收稿日期:2004—04—12
作者简介:张秀省(1960一),男,山东聊城人,聊城大学农学院教授。Tel:(0635)8239956
万方数据
药用植物青叶胆的组织培养
作者: 黄衡宇, HUANG Heng-yu
作者单位: 湖南吉首大学生态研究所,湖南,吉首,416000
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2005,36(2)
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8.Huang H Y;Li L;Yang S H Tissue culture of Gerbera jamesonii Bolus[期刊论文]-吉首大学学报·自然科学
版 2001(01)

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4. 马艳.肖娅萍.胡雅琴 苦皮藤组织培养与植株再生[期刊论文]-中草药2003,34(10)
5. 刘丽莎.张西玲.王岚.张延红.LIU Li-sha.ZHANG Xi-ling.WANG Lan.ZHANG Yan-hong 麻花秦艽组织培养及植株
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6. 颜茜.王昆林.沙育年.高弘.YAN Qian.WANG Kun-lin.SHA Yu-nian.GAO Hong 彝药金沙青叶胆的傅里叶变换红外
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7. 张瑞贤.张卫.ZHANG Rui-xian.ZHANG Wei 文革期间开门办科研与中草药运动[期刊论文]-江西中医学院学报
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10. 字敏.刘国祥.李永明.张慧萍.刘玲 红河青叶胆中苦味甙化学成分的研究[会议论文]-2000

引证文献(3条)
1.钱丽华 三叶青的离体快速繁殖[期刊论文]-植物生理学通讯 2008(1)
2.甄莉 青叶胆愈伤组织的诱导与液体继代培养[期刊论文]-亚热带植物科学 2010(3)
3.龙华.黄衡宇 湖北双蝴蝶的组织培养研究[期刊论文]-广西植物 2009(1)

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