全 文 ：·1072· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第7期2006年7月
药材与资源
中日当归属药用植物ITS序列分析
赵国平1，新关稔3，石川隆二3，钱三旗2，章群2，敖杰男1
(1．暨南大学医学院，广东广州 510632；2．暨南大学生命科学技术学院，广东广州510632；
3．日本弘前大学农学生命科学部，日本青森036—8561)
摘 要：目的 建立当归属药用植物功效的分子系统学基础，为当归属药用植物功效的差异性提供分子依据。方法
采用PCR技术与克隆技术相结合，获得ITS基因，进行测序，经Phylip软件统计分析和分支分析，建立系统发育
树，计算各类群间的遗传距离。结果 当归属药用植物中ITSl-5．8S—ITS2序列长度为600～629bp，去除序列长度
为165bp的5．8S，ITSl+ITS2排序后的长度为468个位点。系统树将当归属药用植物分为两组，以独活、白芷为
代表分别聚类，甘肃产岷当归Angelicasinensis不与上述任何一组聚类，却与欧当归Levisticumoffic nale遗传距离
相对较小。结论上述结果与当归属药用植物功效差异基本吻合，启示药用植物亲缘演化关系可能是研究药用植
物功效规律的一条重要途径。
关键词：当归属；基因转录间隔区；遗传距离；功效
中图分类号：R282．7 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)07—1072—05
ITSequenceanalysisofChineseandJapanesemedicinalpl ntsofAngelicaL．
ZHAOGuo—pin91，NIIZEKIMinoru3，ISHIGAWALiuni3，QIANSan—qi2，
ZHANGQun2，AOJie—nanl
(1．MedicalCol ege，JinanUniversity，Guangzhou510632，China；2．CollegeofLifeSci nceandTechnology，
JinanU iversity，Guangzhou510632，China；3．FacultyofAgriculturalandLifeScience，
HirosakiUn versity，Hirosaki036—8561，Japan)
Abstract：ObjectiveToes ablishthebaseofmolecularsystem—theoryonmedicinalpl ntsofAngeli—
caL．andtooffermoleculargistsforfindingthefficacydifferenceofthem．MethodsThePCRtechnique
wasutilizedtogetherwiththeclonet chniquetOgetheITSgeneandmeasureitsg nicsequence．Statisti-
calanalyzingandbranchanalyzingwerecarriedoutbyPhylipsoftwarendgeneticd stancedifferencein
everykindscanbecalculatedwithMEGA3．ResultsITSl—5．8S—ITS2，belongstO eofmedicinalpl nts
ofAngelicaL．，itsequencelengthextents600to629bp．Subtracting5．8S，itslengthis165bp，the
lengthofITSis468bp．Them dicinalpl ntsofAngelicaL．aredividedintotwogroupsbydendrogram．
Thegeneticd stanceofA．sinensisfromGansuProvinceisobviouslydifferentfromheothermedicinal
plantsofAngelicaL．。butthedistancedifferencecomparedwithLevisicumofficinaleissmaller．Conclu—
sionItsuggeststhattheaboveresultbeidenticaltothefficacyofmedicinalpl ntsofAngelicaL．Itmay
beanimportantreasonofexplainingwhythefficacybetweenA．sinensisandothermedicinalpl ntsofAn—
gelicaL．isSOdifferent．
Keywords：AngelicaL．；internaltr nscribedspacer；geneticdis ance；efficacy
当归属植物在我国有26种5变种1变型，分布
于南北各地，主产东北、西北和西南地区。我国分布
的品种大部分可作药用，而诸如当归、白芷、独活等
则属于常用中药。当归能养血活血、调经止痛，治疗
血虚、月经不调等病证；独活祛风除湿，应用于风湿
痹痛等；白芷除与独活具有类似功效外，又能解表、
通窍、消肿排脓，用于风寒表证、鼻渊、痈疽疮疡等。
笔者推测，上述药物药性、功效的差异性应与植物间
收稿日期：2005—10—10
基金项目：国家自然科学基金项目资助(30271618)
作者简介：赵国平(1958一)，男，暨南大学医学院教授，博士，2002年赴日本弘前大学农学生命科学部作高级访问学者，主要从事药用植
物分子生物学、中药药性理论研究。Tel：(020)85225969(020)85228016Email：tgu0428@jnu．edu．cn
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第7期2006年7,El·1073·
亲缘关系和活性成分的差异性密切相关。在经典形
态分类系统中，由于当归属内没有再分组，难以揭示
药用植物亲缘演化与功效变化之间的相关性。
当归属药用植物的分子系统学研究，以往多在
伞形科、芹亚科等高级分类阶元上进行。Gregory
等[1]对伞形科、五加科、海桐花科等80个属的植物
进行了cpDNA的rbcL基因序列分析，认为五加科
和伞形科是两个姐妹群，与之较近的是海桐花科
(Pittosporum)。这一结果与伞形科来源于五加科的
传统分类认识并不一致。rbcL基因序列分析还显
示，伞形科天胡荽亚科处于伞形科与五加科的中间
位置，部分天胡荽亚科植物与五加科关系更近。此后
采用cpDNA的matK基因研究结果得出了同样结
论[2]。Stephen等运用rDNA的ITS(internaltran—
scribedspacer)序列，对芹亚科40种植物进行分子
系统学研究，ITS序列变化不支持依据芹亚科植物
形态学和解剖学特征而进行的分类。在芹亚科植物
系统发育过程中有一个大的遗传分隔区，所有墨西
哥和美国中部特有的种系与其他地区的种系亲缘演
化关系模糊[3]，上述植物cpDNA的rpoCl基因序
列分析也得出了同样结论[4]。此后，Stephen等又在
芹亚科选取126个代表种进行了ITS序列分析，并
在伞形科范围内选取了100个代表种进行了rpoCl
序列分析，得出的结论是：伞形科芹亚科为单系发
生，与变豆菜亚科构成姐妹群；伞形科天胡荽亚科为
多系发生，其中部分种系与五加科紧密结合在一起，
而另一部分则与伞形科芹亚科、变豆菜亚科聚在一
起。分子系统树中聚在一起的植物在经典分类系统
中可能属于不同的类群[5]。鉴于分子系统学研究资
料已经突破了芹亚科的传统分类，Stephen等将所
研究的分子系统学证据综合起来，试图建立芹亚科
新的分类系统，该实验将芹亚科分为七大世系：An—
gelicagroup(当归组)、Aegopodiumroup(羚角芹
组)、Apiumgroup(芹组)、Daueusgroup(胡萝卜
组)、Aciphyllagroup(尖叶芹组)、Oenanthegroup
(水芹组)，其中当归组最大[6]。
上述系列成果说明，经典的植物分类系统与植
物分子系统学研究结论之间存在着较大差异。在植
物系统与进化研究中，核酸分子量是最基本的进化
单位，能反映进化本质；核酸的基本序列是一元变化
的，通常为点突破，趋同效应极小，以核酸分子为指
标确定的系统化关系不受主观因素影响。据此笔者
认为，经典的植物分类系统可能在客观反映植物亲
缘演化关系方面存在着局限性。结合药用植物功效
的研究，大胆地推断：同一属药用植物，如果功效相
似，可能分子系统学证据可以证明其亲缘关系较近；
如果功效差异性大，分子系统学证据可以证明其亲
缘关系较远。根据这种设想，选择了功效差异性较大
的当归属药用植物作为研究对象。在基因片段选择
方面，ITS是目前分子系统学研究应用最多的一种，
因ITS进化速率较编码区快，一般用于研究植物较
低分类等级(如属、种、居群)的亲缘关系，并且已被
证明这一区域的DNA特征可以作为被子植物系统
学研究的一个非常有用的性状[7]。因此，笔者选择
rDNA的ITS序列作为研究中日当归属及其近缘属
药用植物种间和种下类群亲缘关系的基因片段。
1材料与方法
1．1材料来源：见表1，所有材料均来自野外，用硅
胶快速干燥的新鲜叶片，国内品种分别经中国科学院
江苏省植物研究所标本室刘启新研究员、本校药用植
物教研室谈献和教授、洪恂教授鉴定；日本品种经日
本弘前大学农学生命科学部原田幸雄教授鉴定。
表1材料来源
Table1 Resourcesofm dicinalpl ntsofAngelicaL．
样品号 名 称 来源 鉴定人
1．2总DNA的提取、ITS区的扩增：分别取各个
种的新鲜叶片0．2g左右，采用改良的CTAB法[8]
提取总DNA，并以0．8％的琼脂糖，1×TBE缓冲液
电泳检测。
用White等D3描述的引物进行ITS区的扩增。
上游引物为1TS一5F：5-GGAAGGAGAAGTCG—
TAA—CAAGG一3’；下游引物为ITS一4R：57一TC—
CTTCCGC—TTATTGATATGC一37。聚合酶链式反
万方数据
·1074· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第7期2006年7,El
应(PCR)在PERKINLMER9600型PCR仪上进
行。反应体系为60肛L，其中ITS一5F和ITS一4R各3
／_￡L(2pmol／L)，0．3弘LTaq酶(5U／uL)，6弘L10×
buffer，3．6弘LMgCl2(25mmol／L)，6pLdNTP(25
mmol／L)，模板DNA25ng，加水至60弘L。PCR程
序为：94℃预变性30S，94℃变性1rain，53℃退火
1rain，72℃延伸1rain。35个循环后72℃延伸10
rain。4℃保存。
1．3 ITS区的克隆、纯化、测序：上述PCR产物直
接测序效果不好，而经过大肠杆菌克隆以后测序效
果良好。在DNA连接酶的作用下，将药用植物ITS
区PCR产物与载体基因PBluescriptⅡSK(+／一)
溶液相混合，在16C恒温箱中水浴12h以上，与经
前培养的大肠杆菌相混合，在掺有氨苄青霉素的培
养皿中37。C培养18h以上，白色菌落再在掺有氨
苄青霉素的液体培养液中37℃振荡培养18h以
上。采用QIAkit分离、纯化质粒DNA。
测序反应依据双脱氧终止法原理[1⋯，在上述
PCR仪上进行。反应体系10弘L，测序引物为
M13IRD800forward和reverse。反应程序为95+C
预变性5rain，95、C变性30S，5 ‘C退火30S，70℃
延伸1rain。30个循环后4℃保存。测序采用手动测
序法，在LIC一4000测序仪上进行。每个样品正向、
反向测序各两次，将4次所测结果进行认真校对。
1．4数据分析及系统树构建：本实验将获得的碱基
序列经Clustalx排序，用MEGA3软件基于Kimura
2-parameter模型计算遗传距离，并采用近邻归群法
分枝的置信度自举检测(bootstrap)1000次。
2结果与讨论q
2．1 ITS长度与G+C的量：本实验测得21种样品
的ITS区(包括5．8SrDNA)序列的长度范围为
600～629bp。其中ITSl长度为214～226bp，ITS2
长度为218～237bp。所有种的ITS2长度均比ITSl
长。而5．8SrDNA则高度一致，均为165bp，无碱基
差异。将ITS区中5．8SrDNA去除，ITSl与ITS2
连接，Gap做为缺失处理时，ITSl+ITS2排序后的长
度为468个位点，其中有139个变异位点，36个为系
统发育信息位点，分别占29．7％和7．7％。其各类群
ITSl+ITS2长度和序列中的G+C质量分数见表2。
表2各类群ITS长度和G+C的■
Table2 LengthandG+CcontentsofITSl
andITS2oftaxa
片段
片段长度
(G+c)／片段
片段长度
(G+c)／
(ITSl+ (ITSl+
编号ITs2)／bp
％
编号ITS2)／bp
％
1 445 52．6 12 435 50．3
2 441 53．7 13 436 53．5
3 441 、53．5 14 436 53．3
4 438 51．1 15 435 53．1
5 437 49．0 16 437 53．5
6 440 50．9 17 433 50．7
7 435 50．1 18 434 52．9
8 434 49．8 19 434 52．6
9 436 50．3 20 438 52．2
10 434 50．4 2l 438 50．1
11 435 49．8
2．2各类群闻的遗传距离：当归属21种植物相互
间的遗传距离见表3。基于ITS序列的当归属植物
(Neighbor—Joining，NJ)构建系统发育树，系统树各系统发育树见图1。
表3当归属类群间的遗传距离
Table3 Geneticd stanceamongtaxaofAng砒aL．
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第7期2006年7月·1075·
，，缶嚣归一L—蕊。
I r—一圆当归
一管鞘当归
63L——一拐芹
广祈白芷
100L狭叶当归
广————一川白芷
100
i黑水当归
一峨嵋当归i兴安白芷
广一杭臼芷
98L一白芷i岷当归
一欧当归
图中数字表示各分枝自举检测的置信度，标尺表不遗传距离
Numbersabovebranchespresentconfidencevaluesfromboot—
straptest，ascalebarindicatesgeneticd stance
图1基于ITS序列的当归属植物系统发育树
Fig．1DendrogramofplantsofAngelicaL．
basedonITSsequences
3讨论
3．1 实验数据的分类学意义：DNA是由G与C、A
与T的氢键结合而形成的双螺旋结构，A与T、G
与C之间的摩尔数相等，利用G与C或A与T中
的任意一对碱基组成即可反映该DNA序列的碱基
特征[11|。DNA序列中经常会发生插入／缺失
(indels)现象[12|，故DNA序列长度也能部分反映
DNA序列特征。但DNA链是一个整体结构，即使
A与T、G与C的量和长度相同的基因片段，由于
碱基对之间的排列组合、先后顺序不同，各植物之间
的遗传距离也会出现较大差异。在长期的系统演化
过程中，更多地会发生单核苷酸多态性(singlenu—
cleotidepolymorphismSNP)和点突变(mutation)、
倒位与重排(invertionandrearrangment)等现
象[13|，因此，选择适当的软件对获得的基因序列计
算分析，计算遗传距离，建立系统树，是分子系统学
研究的主要途径。从本次实验可以看出，G+C的量
和序列长度相似的ITS基因片段(如兴安白芷与岷
当归)系统树中并未聚在一起，遗传距离也较远。
3．2当归属分组与功效的关系分析：由图1可知，
当归属植物分为两组。重齿当归、A．ursina、A．
edulis、紫花前胡、白花前胡、骨缘当归、圆当归、A．
acutilobasubsp．iwatensis等8种植物为一组；杭白
芷、白芷、兴安白芷、峨嵋当归、黑水当归、川白芷、管
鞘当归、毛当归、拐芹、祈白芷、狭叶当归等11种植
物为另一组。岷当归不与上述两组聚类，而与外类群
欧当归相对较近。通过Blasta进行相同性检索，本
实验所测相关品种如圆当归、拐芹、白芷、紫花前胡
等与Stephen等Is,4]所测相关品种的ITS序列基本
一致。
在第一组，重齿当归首先与A．ursine、A．
edulis两个日本品种聚在一起，然后再与紫花前胡、
白花前胡、骨缘当归相聚，经两次聚合后与圆当归、
A．acutilobasu sp．iwawensis相聚。从有关文献记
载来看，除紫花前胡、白花前胡和3个日本品种外，
其余第1组品种都具有一定的祛风除湿、镇痛作用，
用于治疗风湿痹痛[1“。在第2组，首先聚在一起的
是白芷、杭白芷、兴安白芷，然后与黑水当归、峨嵋当
归聚合，经2次聚合后与川白芷聚合，经3次聚合后
与管鞘当归、毛当归、拐芹聚合。经4次聚合后与祈
白芷、狭叶当归聚合。白芷及其种下类群都具有相似
的功效，管鞘当归、拐芹、黑水当归、峨嵋当归祛风除
湿，活血调经，与白芷及其种下群的功效同中有异。
从表3可以看出，作为当归道地药材的岷当归与当
归属中其他所有植物都有较大的遗传距离，而与欧
当归遗传距离相对较近；从图1可以看出，岷当归不
与当归属两组植物聚合，是当归属中一个特殊类群。
当归是养血调经的常用药，与独活、白芷、拐芹等药
物的功效差异性较大，而欧当归能活血调经，治疗月
经不调、痛经等病，与岷当归功效有更多的相似性。
3．3植物分子系统学研究的初步体会：首先是取样
问题。在同一分类阶元上，所取样本越丰富，越能准
确反映该类群的分类情况，如果一个属只选一个代
表种，有的种并不能真实代表该属植物与他属植物
之间的亲缘演化关系，得出的结论可能是不准确的，
如本次研究中当归就是一个特殊类群。即使是同一
品种，在居群之间也有一定差异。在进行中国药用植
物的分子系统学研究时，应尽可能在同一分类阶元
内多采一些品种，甚至采到种下类群。其次是基因片
段选择问题。一般根据不同的研究目的选择不同的
基因区域。rDNA的ITS序列目前广泛用于研究被
子植物科内，尤其是近缘属内及种间关系，均取得了
预期的成果[】卜17]。到目前为止，当归属中国特有种
的ITS序列资料并不多，本课题所选当归属20个
样品，中国特有种15个，Et本品种5个，可以补充当
归属ITS研究资料的不足。适宜于较低分类阶元亲
缘关系研究的还有matK基因等[18|，由于matK序
列变异较为均一，在构建系统树时不必对不同类群
的变异进行加权，增强了分子系统树的可靠性。本课
万方数据
·1076· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第7期2006年7月
题将结合matK基因作进一步研究。再次是测序与
克隆技术问题，国内普遍采用的是PCR产物直接测
序，由于PCR产物浓度低，易受污染，给测序反应和
读序工作造成了一定困难。本课题将经PCR获得的
目的基因用大肠杆菌克隆后分离、净化，得到的目的
基因不仅浓度高，而且污染少，测序、读序效果好，成
功率显著提高，为目前日本、欧美等国家普遍采用的
方法‘19]，值得推广。
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(1．楚雄师范学院，云南楚雄675000；2．北京大学生命科学院蛋白质工程及基因工程国家重点
实验室，北京100871；3．楚雄农业学校，云南楚雄675000)
摘 要：目的 获得具有较强抗虫抗真菌的转基因灯盏花植株。方法 通过PCR聚合酶链式反应得到目的基因
RBBl2—3，通过中间载体PBS及植物载体YY46，得到带有目的基因的质粒，用基因枪轰击法进行遗传转化。对基因
枪轰击受体、轰击压力、抗生素庆大霉素(Gent．)的敏感性进行对照实验。结果用灯盏花的真叶作为基因枪轰击
收稿日期：2005—09—25
作者简介：邱璐(1965一)，女，四川人，硕士，副教授，主要从事植物转基因及植物组织培养研究。
*通讯作者王波(1961一)，男，本科，副教授，主要从事分析化学及化工研究。
万方数据
中日当归属药用植物ITS序列分析
作者： 赵国平， 新关稔， 石川隆二， 钱三旗， 章群， 敖杰男， ZHAO Guo-ping， NIIZEKI
Minoru， ISHIGAWA Liuni， QIAN San-qi， ZHANG Qun， AO Jie-nan
作者单位： 赵国平,敖杰男,ZHAO Guo-ping,AO Jie-nan(暨南大学医学院,广东,广州,510632)， 新关稔
,石川隆二,NIIZEKI Minoru,ISHIGAWA Liuni(日本弘前大学农学生命科学部,日本,青森
,036-8561)， 钱三旗,章群,QIAN San-qi,ZHANG Qun(暨南大学生命科学技术学院,广东,广
州,510632)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(7)
被引用次数： 16次

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