全 文 :·1772· 中草稿 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月
细脚拟青霉多糖PTPS一1的结构特征和抗肿瘤活性的初步研究
金丽琴1,左江成2,吕建新外,李宝剑2,李东2
(1.温州医学院临床医学部生物化学教研室,浙江温州325035;2.温州医学院细胞与分子医学研究所,
浙江温州 325035)
摘 要:目的 分析鉴定细脚拟青霉多糖PTPS一1的理化性质和结构特征,并观察其抗肿瘤活性。方法采用
DEAE一纤维素及SephadexG一100柱色谱分离纯化得到PTPS一1;利用HPI。C、GC、IR、部分酸水解及NMR分析
PTPs一1的相对分子质量、组成和结构特征;采用CCK一8检测观察PTPS一1对小鼠脾细胞和PTPS一1刺激培养的小
鼠腹腔巨噬细胞上清对Sp2/0细胞的增殖活性。结果PTPS一1的纯度为98.977%,平均相对分子质量为1.84×
104,由甘露糖和半乳糖组成,二者摩尔比为1.3:1,糖链结构中主链含有Ct一(1—6)、a一(1—2)和p-(1—3)连接的糖
苷键.支链含有Gal一(1—3)连接。PTPS一1可明显促进小鼠脾细胞的增殖(P
肿瘤活性的中性杂多糖。
关键词:细脚拟青霉;多糖类;抗肿瘤活性
中图分类号:R284.2 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2008)12—1772一05
StructuralcharactersandantitumoractivityofapolysaccharidePTPS-1
fromPaecilomycestenuipes
JINLi—qinl,ZUOJiang—chen92,LUJian—xin2,LIBao—jian2,LIDon92
(1.BiochemistrySection。DepartmentofClinicM dicine,WenzhouM dicalCo lege,Wenzhou325035,China;
2.InstituteofCellularandMolecularMedicine,WenzhouM dicalCo lege,Wenzhou325035,China)
Abstract:ObjectiveToinvestigatethephysicochemicalproperties,structuralcharactersandntitu—
motactivityofapolysaccharidePTPS一1fromPaecilomycestenutpe$.MethodsPTPS一1wasobtainedby
DEAE—celluloseandSephadexG一100chromatographycolumn.ThemethodsfHPLC,GC,IR,andNMR
wereusedtOinvestigatethemolecularweight,monosaccharidecomposition,andstructuralcharactersof
PTPS一1.TheCCK一8kitwasusedtodeterminetheproliferationofPTPS一1onmurinesplenocyteandthe
supernatantof hemurinemacrophagewithPTPS一1一stimulatedonSp2/Ocells.ResultsPTPS一1,whose
molecularweightwas1.84×104andpuritywas98.977%,containedm nnose(Man)andgalactogen
(Gal)asmonosaccharideconstituteinmolarratioof1.3:1.Itconsistedofabackboneofa一(1—’6),a一(1
—2),andp(1—3)linkage,whosebranc ew rmadebyGal一(1·3)linkage.PTPS-1significantly
stimulatedthemurinesplenocyteproliferationandthesupernatantofmacrophageinhibitedthgrowthof
Sp2/0cellsinvitro.ConclusionPTPS一1isa polysaccharidefromP.tenuipeswithimmunomodulatory
andantitumoractivity.
Keywords:Paecilomycestenuip (Peck)Samson;polysaccharides;antitumoractivity
细脚拟青霉Paecilomycestenuipe5(Peck)
Samson是一种寄生在蛾蛹体和幼虫上的真菌,为虫
草属真菌的无性型阶段Ⅲ,与名贵中药材冬虫夏草
的无性型——中国拟青霉为同属真菌,两者的化学
成分十分相似。冬虫夏草及其多糖的研究报道很多,
但对细脚拟青霉及其多糖的研究报道还很少。研究
表明,细脚拟青霉能够增加小鼠常压耐缺氧能力,具
镇痛、镇静作用,可以改善机体的营养状况,促进生
收稿日期:2008—05一16
基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(301036)
作者简介:金丽琴(1963~).女.浙江温州人.教授,硕士生导师,从事生化免疫药理学研究。
Tel:(0577)86689889E—mail:liqinjin@126.com
*通讯作者吕建新Tel/Fax:(0577)86689805E—mail:fix@wzmc.net
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月·1773·
长,逆转免疫抑制作用,增强机体的免疫功能以及加
快体内自由基代谢[2~5]。而细脚拟青霉中的多糖是
发挥免疫调节的主要成分之一,这已得到国内外学
者的共识。细脚拟青霉多糖(Paecilomycestenuipes
polysaeeharide,PTPS)能够激活巨噬细胞和单核细
胞,增强机体新陈代谢、促进人外周血单个核细胞的
增殖和肿瘤坏死因子一a(TNF—a)的表达,增强肠系
膜淋巴细胞产生白细胞介素一2(IL一2)、了一干扰素
(IFN一7)、粒一单核细胞集落刺激因子(GM—CSF)和
白细胞介素一10(IL一10)E6~8]。鉴于多糖的生物学活
性与其相对分子质量、单糖组成和化学结构有关,本
实验从细脚拟青霉菌丝体中分离纯化出单一的多糖
组分PTPS一1,分析其结构特征,观察其抗肿瘤活
性,为进一步深入研究多糖结构与活性之间的关系
打下基础。
1材料
1.1仪器:RSZ—i00自动部分收集器(上海青浦沪
西仪器厂),冷冻干燥机(北京四环医学仪器厂),
DU800型可见紫外分光光度计(Coulter公司),高
效液相色谱仪(ShimadzuLC210AD),气相色谱仪
(AgilentTee公司),670FT—IR红外光谱仪(Nicolet
公司),BrukerAvanee一300核磁共振仪(Bruker公
司),FormaseriesⅡ隔水式C02培养箱(Thermo
公司),酶标仪(Dialab公司)。
1.2主要试剂:鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半
乳糖、葡萄糖和葡聚糖对照品(Fluka产品),RPMI
1640培养基(Gibeo产品),CellCountingKit一8
(CCK一8,日本同仁化学研究所)。
2实验方法
2.1 PTPS一1制备:细脚拟青霉粗多糖的提取参考
文献方法[6]。粗多糖经DEAE纤维素52阴离子柱
(30cm×2.6cm)色谱,O~0.5mol/I。的NaHC03梯
度洗脱,收集主要吸收峰;合并收集的样品再经
SephadexG一100凝胶柱(100cmX3.4cm和
100am×1.6cm)色谱纯化,以0.1mol/L的NaCI
洗脱得纯的细脚拟青霉多糖单一组分PTPS一1,冷
冻干燥备用。
2.2纯度和相对分子质量测定:PTPS一1和相对分
子质量分别为25000、800 0、2700 0和670000的
葡聚糖的对照品分别经高效凝胶渗透色谱检测。色
谱柱为PhenomenexBiosep—SEC一$4000(300mlTlX
7.8ram),流动相双蒸水,柱温25C,示差检测器监
测。以对照葡聚糖的相对分子质量(M)的对数值与
保留时间(Rt)求得标准曲线:lgM一8.47877—
0.33031Rt(R2—0.9992),再由标准曲线求得样品
的平均相对分子质量,纯度由峰面积比可知。
2.3紫外光谱分析:将一定量PTPS一1超纯水配制
成1g/L溶液,在紫外可见光谱仪上扫描分析,波长
范围为200~400nm。
2.4单糖组成分析:取多糖PTPS一125mg,制备糖
醇乙酸酯衍生物口]。气相色谱条件为:HP一5色谱柱
(30ITI×0.32mm,液膜0.25pm);氮气:1mL/
min,氢气:40mL/min,空气:450mL/min;柱温220
℃,气化室温度和检测器温度均为250℃;上样量1
弘L。另取标准单糖混合物同上衍生化,作单糖气相
色谱标准。
2.5高碘酸氧化:称取多糖PTPS一1样品28mg溶
解于28mL的15mmol/L的NaIO。溶液中,避光4
℃反应。按4、12、24、48、72h⋯⋯间隔取样1弘L,以
250倍蒸馏水稀释,用紫外分光光度计在223nm测
吸光度(A),至吸光度达一稳定值后,加乙二醇终止
反应。用标定为4.798mmol/I。的NaoH滴定,测定
NaIo。的消耗量和甲酸的生成量。
2.6红外光谱分析:取1mg干燥的多糖PTPS一1,
经KBr压片,在700~400cm_1中红外区扫描,记
录红外光谱图。 /
2.7 PTPS一1的部分酸水解:取PTPS一1150mg溶
解于0.05mol/L的三氟乙酸,100‘C反应1h,减压
蒸发去除三氟乙酸,置透析袋于蒸馏水透析48h,
袋内多糖部分减压浓缩。浓缩液于SephadexG一100
凝胶色谱柱纯化后冷冻干燥备用。
2.8核磁共振:称取PTPS一170mg和部分酸水解
后的PTPS一135mg分别溶解于0.5mLD20
(99。8%)进行核磁共振1H—NMR和13C—NMR分析。
2.9小鼠脾细胞悬液的制备:取8周龄BAI。B/C
小鼠(18~22g),无菌条件下取脾脏制备单个脾细
胞悬液。用0.8%NH。CI溶解红细胞后用RPMI
1640液清洗2次,以含10%胎牛血清的RPMI1640
培养液调整脾细胞浓度为1×107/mL。
2.10不同浓度PTPS一1对小鼠脾细胞增殖活性的
影响:将上述脾细胞悬液按100弘L/孔接种到96孔
培养板。设置5组,每组设3个重复孑L。对照组不含
PTPS一1,I、I、噩、N组分别加入不同质量浓度的
PTPS一1,得到各组PTPS一1的终质量浓度分别为
0、100、300、500mg/L。每组设4个复孑L,将细胞培
养于37。C、5%Co。培养箱中48h后,每个实验孔
加10肛LCCK一8试剂再培养,4h后取出培养板于
酶标仪上450nm处测A值,计算增殖率。
万方数据
·1774· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月
增殖率=垡塑垒塑磊蔫莪}竿产×·o。%
2.11不同质量浓度PTPS一1刺激培养小鼠腹腔巨
噬细胞上清的获取:常规方法取小鼠腹腔巨噬细胞,
用含10%胎牛血清的RPMI1640液调节细胞浓度
为2×106/mL,按200/LL/孑L接种于96孔培养板,
分别加入不同质量浓度的PTPS一1,得到各组
PTPS一1的终质量浓度分别为0、30、100、300、500
mg/L。每组设4个复孔,将细胞培养于37℃、5%
Co。培养箱中48h,收集各组上清备用。
2.12不同质量浓度PTPS一1刺激培养小鼠巨噬细
胞上清的抗肿瘤实验:取对数生长期的Sp2/0细
胞,调节细胞浓度为1×105/mL,按70弘L/孔加到
96孔培养板,设置①对照组:加30肛L上述未经
PTPS—l刺激培养的小鼠巨噬细胞上清;②PTPS一1
刺激培养小鼠巨噬细胞的上清各组即I、Ⅱ、Ⅲ、N
组:分别加入30弘L上述经不同质量浓度PTPS一1
刺激培养的小鼠巨噬细胞上清,每组设4个复孔。将
细胞培养于37C、5%CO。培养箱中48h后,每个
实验孔加10弘LCCK一8试剂再培养,2h后取出培
养板于酶标仪上450nm处测A值,以A值判定细
胞的生长状况,计算抑制率。
抑制率一Q型塑望{导譬看弓茜产×,oo%
2.13统计学处理:数据用z士s表示,用SPSS11.5
软件的单因素方差分析(One—wayANOVA)作总体
差异显著性检验,各组间两两比较采用LSD法。
3结果
3.1多糖的理化性质与结构特征
3.1.1多糖的提取与纯化:从菌丝体中提取的多糖
经DEAE一纤维素一52柱色谱纯化,得到f。、f。和f。3
个组分。f,再经SephadexG—100柱色谱多次纯化
后,色谱图峰形对称,无杂峰和拖尾,说明f,为纯
品。收集后经透析、冷冻干燥,样品性状为白色、易溶
于水的结晶体,命名为PTPS一1。
3.1.2PTPS一1质量分数和相对分子质量:PTPS一1
的高效液相分析可知,从PTPS—l所占的峰面积比
确定PTPS一1的质量分数为98.977%,根据系列标
准葡聚糖的相对分子质量和对应保留时间的标准曲
线,由PTPS一1的保留时间12.758min,计算出
PTPS一】的相对分子质量为1.84×104。
3.1.3 紫外光谱分析:PTPS一1的水溶液经紫外扫
描在260nm和280nm处没有吸收峰,表明PTPS一
1不含蛋白和核酸。
3.1.4单糖组成分析:PTPS一1经糖醇衍生化后的
气相色谱图只有2个峰,保留时间分别为7.340,
7.621min,与标准单糖气相色谱中甘露糖和半乳糖
的保留时间7.364、7.650rain极为相近,因此,
PTPS一1由甘露糖和半乳糖组成,二者经校正的摩
尔比为1.3:1。
3.1.5红外光谱分析:红外光谱图上每一个吸收峰
都对应于分子中原子或官能团振动情况。多糖
PTPS一1在3368.3cm_1处为O—H的伸缩振动,
2 933.2cm.1处为C—H的伸缩振动,1646.7cm_1
处为C=O的伸缩振动,1418cm叫和1380am叫处
为C—H的变角振动,1035.8am_1处的强吸收峰显
示此处为吡喃环的C—o的伸缩振动,890am叫处表
明糖残基中有为p构型的糖苷键,820am_1处的吸
收峰说明多糖中含有甘露糖。
3.1.6高碘酸氧化:PTPS一1经高碘酸氧化一个糖
残基分子消耗1.089分子高碘酸同时生成0.48分
子甲酸,高碘酸消耗量稍大于甲酸生成量的2倍,由
此可推知多糖分子中存在较多的l一2或1—6连接
的糖苷键,高碘酸消耗量及甲酸生成量说明分子中
可氧化糖基占60.9%,而不可氧化的占39.1%,说
明糖分子中存在l一3或1—3,6键型。
3.1.7核磁共振谱分析:PTPS一1水解前后氢谱分
析,H1质子峰的化学位移分布在艿4.8~5.3,大于
艿5.0的吸收峰为a构型的糖苷键,另有部分H1质
子峰的化学位移小于艿5.0,则说明PTPS-1中还存
在部分p构型糖苷键。PTPS一1水解前后异头碳区域
化学位移大于艿103的异头碳,可确定是p半乳糖
残基C一1的信号;化学位移艿81.3~87.4的吸收峰
为半乳糖C一3化学位移值,其仅在水解前出现,说明
PTPS一1的支链为半乳糖1—3连接,化学位移艿
78.4、78.7处的吸收峰为甘露糖C一2化学位移值,
其水解前后均出现,说明PTPS一1的主链含有甘露
糖1—2连接,PTPS一1水解前后在C一6取代区均存
在艿67.0和68.7的峰,表明PTPS一1主链中有1—
6连接的糖苷键。
3.2 PTPS一1的生物学活性
3.2.1 不同质量浓度PTPS一1对小鼠脾细胞增殖
活性的影响:结果见表1,以A值表示细胞的增殖程
度。脾细胞在不同质量浓度PTPS一1的刺激下,均有
不同程度的增殖,脾细胞的增殖活性随PTPS-1剂
量的增加而增加。与对照组比较,PTPS一1在100~
500mg/L均能显著促进小鼠脾细胞的增殖活性
(P
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月·1775·
质量浓度下具有剂量依赖效应。
表1 PTPS—l对小鼠脾细胞增殖活性的影响(i土s,矗=3)
Table1 EffectofPTPS一1onproliferationofmurine
splenocytes(;±s,捍一3)
与对照组比较:**P<0.Ol
**P
巨噬细胞的上清对Sp2/0细胞增殖活性的影响:结
果见表2,以A值表示细胞的增殖程度。500mg/L
PTPS一1刺激培养小鼠巨噬细胞的上清对Sp2/O的
抑制作用显著强于对照组(P
0.05),提示一定质量浓度的PTPS一1能通过巨噬细
胞介导而发挥抗肿瘤作用。
表2 PTPS一1刺激小鼠巨噬细胞上清对Sp2/0细胞增殖
活性的影响(j士s,n一4)
Table2 ProliferationofSp2/0cellsbysupernatant
ofPTPS··1--stimulatedmurinmacrophages
G士s,n=4)
与对照组比较:**P
4讨论
本实验通过离子交换和凝胶色谱的方法,从细
脚拟青霉粗多糖中纯化出一种易溶于水的单一多糖
组分PTPS一1,气相色谱分析表明PTPS一1由甘露糖
和半乳糖组成,红外光谱也反映PTPS一1中含有甘
露糖。核磁共振图谱解析[1”15],PTPS一1存在a和B
构型的糖苷键,主链由甘露糖和半乳糖以1—6、1—
2和1—3连接,支链主要为半乳糖1—3连接,该结
果与高碘酸氧化分析的结果一致。
由于脾细胞中主要含T、B淋巴细胞,而T、B
淋巴细胞在机体的免疫反应中发挥重要作用,如产
生细胞因子,抗体等。本实验中,PTPS一1单独能刺
激脾细胞增殖的实验结果表明:PTPS一1具有多克
隆刺激剂的功能,提示PTPS一1可通过刺激T、B淋
巴细胞调节免疫系统的功能,可见该多糖对细胞免
疫和体液免疫均有增强作用,并可能通过免疫调节
抑制肿瘤细胞增殖。由于PTPS一1随着质量浓度的
增加而对脾细胞的促增殖作用逐渐增强,表明
PTPS—l促进脾细胞的增殖具有剂量效应。
巨噬细胞是一种具有多种功能的免疫细胞。其
不仅参与机体的特异性和非特异性免疫反应,而且
还参与机体的抗肿瘤免疫监视作用。有研究表
明[16‘,只有激活的巨噬细胞能抑制肿瘤细胞的生
长、转移,并且具有强大的胞内杀菌作用和胞外溶瘤
作用。本实验中,PTPS一1在一定质量浓度下刺激培
养巨噬细胞的上清能够抑制Sp2/O细胞的增殖
(P
细胞的生长,这可能与冬虫夏草多糖诱导单个核细
胞产生分化诱导因子IFN一7和TNF—a对U937细
胞的生长抑制作用类似[1川,但还有待进一步深入研
究证实。
陆榕等[1胡从细脚拟青霉中分离出一种为a一
(1—6)结合的葡聚糖组分,与天然存在的Dextran
多糖的主链结构相类似。与之比较,结构更为复杂。
PTPS一1组成和结构特征与冬虫夏草的活性多糖成
分接近[19],推测PTPS一1可能就是其发挥免疫调节
和抗肿瘤活性的基础。
鉴于PTPS一1能促进脾细胞的增殖和对肿瘤细
胞Sp2/O的生长抑制作用以及具有与冬虫夏草活
性多糖成分相似的组成和结构特征,表明本实验已
成功地从细脚拟青霉中分离纯化出活性多糖组分
——PTPS一1,这为进一步深入研究PTPS一1的结构
与活性之间的关系打下了良好的基础。
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变绿红菇化学成分研究
汤建国1’2,邵红军1,刘吉开¨
(1.中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部资源持续利用国家重点实验室,云南昆明 650204,
2.红塔烟草(集团)有限责任公司技术中心,云南玉溪653100)
摘 要:目的 研究变绿红菇Russulavirescens子实体化学成分。方法变绿红菇子实体用95%乙醇浸泡提取浓
缩,经硅胶、RP一8、SephadexLH一20等多种材料进行分离,波谱学方法鉴定化合物的结构。结果分离鉴定了8个
化合物,分别为铁屎米酮(canthin一6一one,I)、3p羟基一5a,8a一过氧化麦角甾一6,22一二烯(I)、3p_羟基一麦角甾一5,7—
22一三烯(I)、313,5a,6p三羟基一麦角甾一7,22一二烯(N)、硫代乙酸酐(V)、顺丁烯二酸(VI)、D一阿洛醇(Ⅶ)、腺嘌呤
核苷(Ⅷ)。结论所有化合物均为首次从该菌中分到,其中化合物I为首次从该属中分到。
关键词:变绿红菇;铁屎米酮;3p羟基一5a,8a一过氧化麦角甾一6,22一二烯
中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2008)12—1776—03
ChemicalcOnstituentsofRus ulavirescens
TANGJian—gu01”,SHA0Hong—junl,LIUJi—kail
(1.StateKeyLaboratoryofPh tochemistryandPlantResourcesinW stChina,KunmingI stituteofBotany,
ChineseAcademyofSciences,Kunming650204,China;2.CenterofTechnology,
HongtaTobaccoGr upCo.,Ltd.,Yuxi653100,China)
Abstract:ObjectiveTostudythactiveconstituentsofRus ulavirescens.MethodsThecompounds
wereisolatedbysilicagel,RP一8,SephadexLH一20andtheirstructureswereelucidatedbyspectralmeth-
ods.ResultsEightcompoundswerei olatedanidentifiedascanthin一6一one(I),5a,8a—epidioxy一(22E,
24R)一ergosta-6,22一dien一3pol(Ⅱ),(22E,24R)-ergosta一5,7,22一trien-3pol(Ⅲ),(22E,24R)一ergosta一
7,22~dien一313,5a,6ptriol(N),thioaceticanhydride(V),maleicacid(V1),D—allitol(Ⅶ),ribosidoad一
收稿日期:2008—03—09
基金项目:国家内然科学基金资助项目(30470027)
作者简介;汤建国(1975一).湖南沅江市人.中国科学院昆明植物研究所在读博士生,从事高等真菌次生代谢产物活性成分研究。
Tel;(0871)5223411E—mail:tj9111@163.tom
*通讯作者刘吉开E—mail:jkliu@mail.kib.ac.cn
万方数据
细脚拟青霉多糖PTPS-1的结构特征和抗肿瘤活性的初步研究
作者: 金丽琴, 左江成, 吕建新, 李宝剑, 李东, JIN Li-qin, ZUO Jiang-cheng, L(U)
Jian-xin, LI Bao-jian, LI Dong
作者单位: 金丽琴,JIN Li-qin(温州医学院临床医学部,生物化学教研室,浙江,温州,325035), 左江成
,吕建新,李宝剑,李东,ZUO Jiang-cheng,L(U) Jian-xin,LI Bao-jian,LI Dong(温州医学院
细胞与分子医学研究所,浙江,温州,325035)
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2008,39(12)
被引用次数: 1次
参考文献(19条)
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引证文献(1条)
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