全 文 ：·224· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月
药理与临床
苦参碱诱导K562细胞分化的差异表达基因的研究
何於娟1，蒋纪恺1，张 彦1，刘小珊2，马凌娣1，欧一衡3，涂植光1
(1．重庆医科大学l临床生化教研室，重庆400016；2．重庆医科大学附属第一医院血液科，
重庆400016；3．重庆市永川市人民医院，重庆402160)
摘要：目的研究苦参碱诱导人红白血病K562细胞分化的分子机制。方法应用改良的mRNA差异显示逆转
技术(DDRT—PCR)筛选苦参碱诱导K562细胞分化相关的差异表达基因；对差异cDNA片段纯化、克隆、测序及
Blast分析，采用逆转录一聚合酶链式反应(RT—PCR)方法验证。进一步对其中的未知差异cDNA片段采用North—
ern杂交确定其转录本的大小及组织分布特性，进而充分利用多种生物信息学资源对差异片段进行结构和功能的
预测。结果苦参碱诱导K562细胞前后存在明显的基因表达差异，筛选获得了17条差异条带。其中4个差异显
著片段经RT—PCR验证后，在Genbank中分析，有3个为已知基因，1个可能为未知基因，暂命名为KH基因。
Northern杂交证实KH基因转录本的大小为1．35kb，分布于正常人体脑组织中。结论苦参碱具有诱导K562细
胞基因表达谱发生变化的作用，由苦参碱诱导的K562细胞分化是一个多基因参与的过程；KH基因可能是苦参碱
作用K562细胞后表达量发生改变的未知基因，可能与细胞癌变有关。
关键词：苦参碱；K562细胞；诱导分化；差异表达基因
中图分类号：R979．1；R286．91文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)02—0224—05
DifferentiallyexpressedgenesinK562celldifferentiationinducedbymatrine
HEYu—juanl，JIANGJi—kail，ZHANGYanl，LIUXiao—shan2，
MALing—dil，OUYi—hen93，TUZhi—guan91
(1．DepartmentofClinicalBiochemistry，ChongqingUniversityofMedicalScience，Chongqing400016，China；
2．DepartmentofH matology，TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingUniversityofMedicalScience
Chongqing400016，China；3．ThePeople’SHospitalofYongchuanCity，Chongqing402160，China)
Abstract：ObjectiveToexplorethmolecularmechanismofdifferentiationofhumanerythro—
leukemiaK562cellsinducedbymatrine．MethodsTheimprovedmRNAdifferentialdisp ayreversetech—
nique——polymerasechaineaction(DDRT——PCR)wasusedtoscreenthedifferentiallyexpressedgenesrelat——
edtOK562cellsbetweenb foreandafterbeingtreatedwithmatrine．Thediff rentiallyexpressedcDNA
fragmentswerepurified，cloned，sequenced，andBlastanalyzed．RT—PCRwasusedtoexaminethex—
pressionlevelsofthedifferentiallyexpressedcDNA．NorthernblotwasadoptedOconfirmthetranscript
lengthandistributionof hecDNAfragmentswi hunknowndifferentiation，thenheirstructuresand
functionswereanalyzedbycomparingtheirbasesequenceswithmultiplepublicbioinformaticesources．
ResultsSignificantdifferenceingeneexpressionwasobservedinK562cellsbeforeandafterbeingtreated
withmatrine．Seventeenbandsofdifferentialgeneswereisolated，cloned，andsequenced．Fourofthem
wereanalyzedinGenbankndconfirmedbvRT—PCR．TheBlastresultshowedthathreeofthemwerethe
knowngenes．whileoneofthemmaybeanunknowngeneamedasKHgenetemporally．TheNort rn
blotresultshowedthatKHgenedistributedinnormalhumanbraintissue，whosetranscriptsizewas1．35
kb．ConclusionMatrineplaysanimportantroleinregulatingthedifferentiation—relatedgeneexpression．
AndK562celldifferentiationinducedbymatrinesacomplexprocessinwhichmanygenesareinvolved．
TheKHgenemaybeadifferentiation—relatedu knownc ndidategenwithchangesof xpressionam unt
inK562 cellsbeingtreatedwithmatrinethatprobablyre atesocellcanceration．
Keywords：matrine；K562cells；induceddiff rentiation；differentiallyexpressedgenes
收稿日期：2004—05—27
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670881；30171150)
作者简介：何於娟(1972一)，女，I匹1)q南充人，副教授，医学科学博士，主要研究方向为中药抗肿瘤的分子机制研究。
Tel：(023)6848500668485216Fax：(023)68485005E—mail：hyj2753@hotmail．corn
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月·225·
苦参是我国传统的常用中药，具有抗炎、抗肿瘤
等作用，苦参碱是其主要的生物碱。K562细胞是一
株分化极差、具有多向分化潜能的人红白血病细胞，
是体外诱导分化实验的常用模型。前期研究表明，
0．2mg／mL苦参碱可诱导K562细胞向成熟方向
分化，并且显著影响K562细胞的细胞周期、端粒酶
活性、细胞骨架以及c—myc和N—ras等原癌基因的
表达等[1~5]。细胞分化受阻的根本原因是基因表达
的异常，细胞表型的改变是基因表达改变的结果。因
此，克隆分化相关的差异表达基因是研究苦参碱诱
导分化机制的关键。mRNA差异显示技术是梁鹏
等[61 992年建立的一种以PCR为基础的，从总
RNA人手，能有效鉴别并克隆一对组织或细胞差
别表达基因的方法。本研究运用改良的DDRT—PCR
技术筛选苦参碱诱导K562细胞分化的差异表达基
因，探讨苦参碱诱导K562细胞分化的分子机制，为
进一步开发苦参碱的药效，实现对白血病的非杀伤
性治疗的目标奠定理论基础。
1材料与方法
1．1主要试剂及细胞：对照组K562细胞由本校病
理生理教研室惠赠，0．2mg／mL苦参碱处理组
K562细胞由本室自建。苦参碱(相对分子质量
248．36，纯度99．9％)，由日本大正制药公司惠赠。
Trizol试剂购自GibcoBRL公司；DDRT—PCR全
套引物均购自中国科学院上海细胞生物学研究所；
pGEM—Teasyvectorsystem试剂盒购自Promega
公司；小量PCR产物纯化试剂盒购自上海华舜生
物工程有限公司；AtkPhos标记试剂盆购自Amer—
shanLifeScience公司；MultipleTissueNorthern
(MTN⑩)Blot试剂盒购自Clontech公司。
1．2细胞培养：取对数生长期的K562细胞，用含
10％小牛血清的RPMI一1640(Gibco，美国)培养
液调节细胞浓度为1x105／mL，实验组加入苦参碱
至终质量浓度为0．2mg／mL，对照组加入等量细胞
培养液，37℃、饱和湿度、5％CO：条件下培养3h。
1．3总RNA的提取：按说明书采用Trizol试剂提
取对照组与苦参碱处理组K562细胞的总RNA。然
后用RNase—freeDNaseI去除样品中DNA的污
染，再经酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，回收总RNA。测
定总RNA吸光度(A)值并经电泳检测其纯度。
1．4 引物设计：上游引物为随机引物(D，、D。、D。、
D。、D。5种)，各含10个碱基。下游引物为锚定引
物，共4组，序列为dT。：MA(T。2AA、T，2CA、T-z
GA)，dTl2MG(T12AG、T12CG、T12GG)，dTl2MC
(T12AC、T12CC、T12GC)，dTl2MT(T，2AT、T。2CT、
T12GT)。
1．5 差异显示逆转录PCR(DDRT—PCR)：分别以
4组锚定引物为引物，合成以苦参碱诱导前后K562
细胞总RNA为模板的eDNA第1链。将2弘g纯化
总RNA70℃水浴变性5min后立即转入冰浴，在
20pL逆转录反应体系中，含2／lg纯化总RNA，20
ttmol／L锚定引物1．5,uL，40U／t．￡LRNase抑制剂
1ttL，5×逆转录酶缓冲液4pL，40mmol／LdNTP
4 ttL，200U／ttLM—MLV逆转录酶1ttL，0．1％
DEPC水补足20肛L，混匀后37℃水浴1h，反应
完毕后95℃，5min灭活逆转录酶终止反应，
一20℃保存备用。
以一组锚定引物对一种随机引物作不同组合，
分别用对照组与处理组的以该锚定引物逆转录的逆
转录产物cDNA做模板，进行PCR扩增。在20弘L
PCR反应体系中，含cDNA3 ttI。，40mmol／L
dNTP1．6ttL，20／Mmol／L锚定引物0．5ttL，20
gmol／L随机引物0．5ttL，2U／td。TaqDNA聚合
酶1gL，10xPCR缓冲液2tLL，消毒双蒸水补足
20肛L。反应条件为：94℃、5min，94℃、1min，
40℃、4min，72‘『C、1min；94℃、30S，50‘C、2
min，72℃、1min，共40个循环；72℃、7min。PCR
产物与上样缓冲液混匀后，在6％非变性聚丙烯酰
胺mini凝胶上150V稳压，电泳2～3h，电泳完
毕，将聚丙烯酰胺凝胶取出，置于含EB的电泳缓冲
液中染色30min，紫外灯下观察电泳结果，找出有
差异的cDNA条带。
1．6差异eDNA的回收、扩增、克隆及筛选：切割
含差异显示cDNA片段的胶条于EP管内，加100
肛LTE溶液室温孵育10min后沸水浴10min，
12000r／min离心5min，取上清液10pL进行2
次PCR扩增，反应条件不变，电泳检查后，选择只
有一条电泳条带的扩增产物经小量PCR产物纯化
试剂盒纯化，然后克隆至pGEM—Teasyvector，转
化至感受态JMl09菌中，并利用pGEM—Teasy
vector带有氨苄西林(Ampicillin)耐受基因及
LacZ基因的诱导表达等特点，进行阳性克隆的筛
选，再提取质粒，用EcoRI酶切鉴定重组子。
1．7 克隆片段的序列分析及同源性比较口’8]：将含
有插入片段的阳性克隆菌寄至上海申友生物技术有
限公司，用T7引物或SP6引物测序。根据测序结
果，去掉载体上的核酸序列，利用GenBank等网上
公共生物资源对插入片段的碱基序列进行无限制方
万方数据
·226· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月
式(norestrictionmode，NR)的同源性比较，进一
步对未知cDNA片段进行表达序列标签(ex—
pressedquencetags，EST)、蛋白质、mRNA等的
同源性比较、基因区域预测以及开放阅读框架
(openreadingframe，ORF)与模体(motif)的分
析、染色体的定位等多种生物信息资源数据库的比
较与分析。
1．8差异显示cDNA片段的半定量RT—PCR验
证：分别以调整至同一浓度的对照组与苦参碱处理
组K562细胞的总RNA为模板，用Oligo(dT)。。逆
转录合成全部cDNA第1链，用根据各差异显示
cDNA片段的测序结果设计各片段内部的一对特异
性引物，以B—actin(F5，_ACACTGTGCCCATCT—
ACGAGG一37，R57一AGGGGCCGGACTCGTCAT—
ACT一37，扩增产物621bp)为内参照进行RT—PCR
检测。PCR产物用含0．5mg／L溴化乙锭的1．5％
琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪分析结果，检i贝4其
吸光度(A)值，与内参照比较计算相对含量。
1．9未知cDNA片段的Northern杂交分析：采用
AlkPhos试剂盒对未知cDNA片段进行碱性磷酸
酶标记后作为探针，用MultipleTissueNorthern
(MTN@)Blot试剂盒进行Northern印迹杂交分析。
2结果与分析
2．1苦参碱处理前后K562细胞mRNA的差异显
示结果：采用改良的DDRT—PCR技术，以苦参碱处
理前后K562细胞为差异显示样品进行差异显示分
析，获得17条差异条带，部分结果见图1。
1 ， {45 6 7 R q 1n
l、3、5、7、9一对照组K562细胞
2、4、6、8、10苦参碱处理组K562细胞
箭头所指为差异基因显示条带
1，3，5，7，9-K562cellsofcontrolgroup
2，4，6，8，10K562cellsofmatrinegroup
arrowheadsdirectbandsofdifferentialgenes
图1 DDRT—PCR产物的PAGE鉴定
Fig．1IdentificationofDDRT—PCRproductsbyPAGE
2．2 差异cDNA重组子的酶切鉴定结果：有差异
的片段回收后2次PCR再扩增，扩增产物纯化后
克隆至pGEM—Teasyvector，根据蓝白筛选结果，
挑取白色菌落，经小量质粒提取后，用限制性内切酶
EcoRI消化，琼脂糖凝胶电泳可见插入片段者为重
组质粒，部分结果见图2。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
3000
2000
1500
1000
750
500
250
M—DNA标准品(250、500、750、100、1 0、2000、3000bp)
1、3、5一阴性质粒2、4、6、7、8、9、10一重组质粒
M—DNAmarker(250，500，750，10，l50 2000，3000
bp)1，3，5-negativevector2，4，6，7，8，9，10一recombinant
vector
图2重组质粒的酶切鉴定
Fig．2Enzymerestrictionidentification
ofrecombinantvector
2．3 序列分析及同源性比较结果：选择4个差异
显著cDNA片段的重组质粒测序分析，标记为
1。～44克隆，4个克隆均来自苦参碱处理K562细
胞后表达受抑的区带。将所获得的4个序列以无限
制方式通过资料最为丰富的核酸一核酸序列数据库，
在GenBank中进行核酸序列的同源性比较，同源性
比较结果见表1。结果表明1。～3“克隆与已知蛋白
质或蛋白酶的碱基序列高度同源，1。克隆与
NADH一泛醌还原酶100％同源，24克隆与单链
DNA结合蛋白(SSBP)100％同源，3“克隆与人类
核糖体蛋白S11(RPSll)100％同源。4“克隆定位
于16号染色体上，与已知序列元高度同源性，为一
未知的cDNA片段。对未找到同源性的4”克隆，进
一步从蛋白质数据库、mRNA库及EST库(含
dbEST，人EST)进行同源性比较，结果均未发现有
显著同源性的基因登录，提示该44克隆可能为一种
未知基因的EST，称之为EST00111，经GenBank
登录注册后，获得注册号为BM077298，dbESTID
10245338，暂命名为KH基因。该差异显示cDNA
片段再与高通量基因组序列(hight roughputge—
nomicsequences，HTG)库和人基因组库比较，发
现该片段与人类16号染色体contig的NT
010498．8的序列有高达97％的同源性。进一步通
过GenBank的人类GenomeView，发现该差异显
示片段定位于16号染色体的长臂12区2带
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月·227·
(16q12．2)；ORF分析找到了一个204bp(68个氨
基酸)的完整ORF；44克隆的motif分析则发现其
富含bra与reti可能为一功能片段。以上分析表明
4。克隆可能是一个已被人类基因组计划测序且定
位在16号染色体的长臂12区，但尚未被分离克隆
的未知基因。
2．4差异cDNA片段的RT—PCR验证结果：4个
差异cDNA片段的RT—PCR扫描结果见表2。可见
14～4#克隆的相对比值均为苦参碱处理组表达受
抑，与DDRT—PCR检测结果一致，尤其是44克
隆——未知基因KH，发现其分布于对照组K562
细胞中，在苦参碱处理组K562细胞中无表达，电泳
结果见图3。
2．5未知差异cDNA片段的Northern杂交结果：
表1 4个差异cDNA片段在不限制数据库的同源性比较结果
Table1 HomogenouscomparisonoffourdifferentialcDNAfragmentsinunrestricteddatabase
750
500
250
__B—actin
一差异片段
M—DNA标准品1、3、5、7—14、24、34、44克隆对照组2、4、6、
8-14、24、34、44克隆苦参碱组
M—DNAstandard1，3，5，7—1“，24，3。，44cloneofcontrol
group2，4．6，8-14，24，34，4。cloneofmatrinegroup
图3差异cDNA片段的RT—PCR结果
Fig．3RT—PCRresultsofdifferentialcDNAfragments
常规的Northern杂交是以标记的差异cDNA片段
为探针，对苦参碱诱导前后的K562细胞的RNA
进行杂交分析。本实验在序列分析、同源性比较及
RT—PCR检测的基础上，直接借助克隆技术多种组
织的Northernblot试剂盒杂交分析，可见探针与正
常人体脑组织的mRNA获得了明显的杂交信号，
杂交带位于1．35kb处，结果见图4。
3讨论
机体正常发育过程或病理变化过程中，无论是
多基因的综合作用还是单基因的突变，本质上都是
基因表达改变所致。各型白血病的发生均受到基因
9．5kb
75kb
4．4kb
2．4kb
1．35kb
1一脑2心3一骨骼肌4一结肠(无黏膜)5-胸腺6一脾
7一肾8一肝9小肠10一胎盘1l肺12-外周血白细胞
1-brain2-heart3-skeletalmuscle4-colon(norfl cosa)
5-thymus6 spleen7-kidney8-liver9-smallintestine
10-placenta11-lung12peripheralbloodeukocyte
图4差异cDNA的Northernblot结果
Fig．4Northernblotresultofdifferentialdisp aycDNA
表达调控异常的影响，均是基因表达异常导致造血
干／祖细胞分化受阻于不同阶段所致。因此，寻找差
异表达基因将有助于揭示造血细胞分化受阻的机
制，也将为苦参碱用于白血病的治疗提供新的基因
治疗靶点。
万方数据
·228· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第2期2005年2月
结合本实验室的特点，笔者在经典DDRT—PCR
方法的基础上做了一些改变：①采用胞浆RNA代
替稳定性较差的mRNA；②采用非变性的凝胶电
泳[9]，降低差异显示条带的复杂性及后期工作的复
杂性；③采用miniPAGE代替测序胶PAGE，EB
染色代替放射自显影，使操作更为简便、安全。
K562细胞是分化极差的白血病细胞，具有多
向分化潜能。本实验选取0．2mg／mL苦参碱作用
K562细胞3h为分离差异表达基因的时间点，试图
得到诱导早期K562细胞行为改变时的相关基因，
为在分子水平揭示苦参碱诱导细胞分化调控的启动
机制奠定基础。结果发现：苦参碱处理K562细胞
3h后，即有明显的cDNA差异显示，其中既有诱导
表达的区带，也有下调的区带。提示苦参碱作用的靶
点可能是在基因水平上，涉及多个基因的激活与失
活。本实验获得的4个克隆均来自苦参碱处理
K562细胞后表达受抑的区带。首先以无限制方式
通过资料最为丰富的核酸一核酸序列数据库，在
GenBank中进行核酸序列的同源性比较。结果表明
除4”克隆外，其余3个克隆均与已知的蛋白或蛋白
酶完全相符或高度同源，提示获得的3个克隆为已
知蛋白(酶)或其家族成员，1。克隆的同源蛋白主要
是与细胞的ATP生成直接相关的NADH一泛醌还
原酶，这提示苦参碱可能通过作用于细胞氧化呼吸
链来引起细胞的增殖抑制，尚需进一步证实。2”克
隆的同源蛋白是SSBP，SSBP是DNA复制所必需
的蛋白质，它的功能在于稳定DNA解开的单链，阻
止复性和保护单链部分不被核酸酶降解，保证
DNA复制的正常进行。由于它来自于苦参碱处理
后表达受抑的区带，所以推测苦参碱作用K562细
胞使其增殖受抑与DNA的复制受抑有关。34克隆
与人类核糖体蛋白有高度同源性，核糖体是翻译合
成蛋白质的场所，这提示苦参碱的诱导分化作用还
涉及到了蛋白质翻译过程。这些推测都有待进一步
证实。而4。克隆在GenBank中未发现有同源性的
基因登录，但是已被人类基因组计划测序和染色体
定位，目前尚未被克隆和功能研究的未知基因的
EST，Northern杂交确定了其转录本的大小和在正
常人体组织中的分布特性，为下一步的全长克隆与
功能研究提供了线索。本课题组正在对这个与细胞
癌变相关的未知基因进行全长克隆和功能研究，这
将为在分子水平阐明苦参碱对K562细胞的诱导分
化机制提供有价值的信息。
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万方数据
苦参碱诱导K562细胞分化的差异表达基因的研究
作者： 何於娟， 蒋纪恺， 张彦， 刘小珊， 马凌娣， 欧一衡， 涂植光， HE Yu-juan， JIANG
Ji-kai， ZHANG Yan， LIU Xiao-shan， MA Ling-di， OU Yi-heng， TU Zhi-Guang
作者单位： 何於娟,蒋纪恺,张彦,马凌娣,涂植光,HE Yu-juan,JIANG Ji-kai,ZHANG Yan,MA Ling-di,TU
Zhi-Guang(重庆医科大学,临床生化教研室,重庆,400016)， 刘小珊,LIU Xiao-shan(重庆医
科大学附属第一医院血液科,重庆,400016)， 欧一衡,OU Yi-heng(重庆市永川市人民医院
,重庆,402160)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(2)
被引用次数： 4次

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8. 王晓燕.李伟忠.梁磊.常建兰.杨敏慧.李祖国 苦参碱抑制人大肠癌SW480细胞环氧化酶-2的表达[期刊论文]-广
东医学2009,30(11)
9. 胡淑平.徐惠波.赵守瑞.李盈蕾.牛晓晖.关延坤 苦参类生物碱抗肿瘤作用[期刊论文]-特产研究2004,26(3)
10. 张白嘉.戴瑛.刘榴 苦参总碱、苦参碱药理作用及药代动力学研究近况[期刊论文]-四川生理科学杂志
1999,21(4)

引证文献(4条)
1.皇甫超申.刘彬.马永超.邓锦波 苦参碱诱导人肝癌细胞BEL-7402自吞噬性死亡[期刊论文]-中草药 2008(9)
2.邹东娜.张典瑞 苦参碱白蛋白亚微粒的制备和体外性质研究[期刊论文]-中国药学杂志 2008(3)
3.王爽.张春磊.秦学功 分子生物学技术在苦参碱抗癌机制研究中的应用[期刊论文]-现代中西医结合杂志 2007(6)
4.戴碧涛.徐酉华 苦参碱对白血病细胞作用的研究进展[期刊论文]-儿科药学杂志 2006(4)


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