全 文 ：·1730· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第11期2006年11月
短葶飞蓬毛状根的诱导及黄酮类成分测定
刘成洪1，段艳冰1，张 磊1，张汉明1，张卫东2，陈万生2门。
(1．第二军医大学药学院，上海200433；2．现代中药研究中心，上海200433；
3．第二军医大学附属长征医院药学部，上海200003)
摘 要：目的 通过诱导培养短葶飞蓬毛状根产生有用次生代谢产物。方法 利用发根农杆菌C58C1感染短葶飞
蓬无菌苗叶盘诱导毛状根，小量提取脱农杆菌完全的毛状根DNA用于rol基因的PCR检测。经PCR检测阳性的
毛状根采用4种不同液体培养基振荡扩大培养，对于获得的毛状根系测定其中总黄酮和灯盏花索的量。结果发
根农杆菌感染10min共培养2d可取得较好的转化效果，继代培养约两个月后可脱菌完全，获得的毛状根PCR检
测阳性率为52．9％，4种液体培养基中B。培养基更适合于毛状根的生长，毛状根中总黄酮量要明显高于正常根中
的量，但灯盏乙素的量明显低于正常根中的量。结论通过短葶飞蓬毛状根大量培养可获取灯盏黄酮类药用成分。
关键词：短葶飞蓬；毛状根；黄酮；灯盏乙素
中图分类号：R282．6 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)11—1730—04
InductionofhairyootsandeterminationofflavonoidsinErigeronbreviscapus
LIUCheng—hon91，DUANYan—bin91，ZHANGLeil，ZHANGan—min91，
ZHANGWei—don92，CHENWan—shen92’3
(1．CollegeofPharmacy，SecondMilitaryMe icalUniversity，Shanghai200433，China；2．MordenResearchCenterfor
TraditionalChineseMedicine，Shanghai200433，China；3．DepartmentofPh macy，ChangzhengHospital，
SecondMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200003，China)
Keywords：Erigeronbr viscapus(Vant．)Hand．一Mazz．；hairyroot；flavone；scutellarin
短葶飞蓬Erigeronbreviscapus(Vant．)
Hand．一Mazz．系菊科药用植物，其干燥全草为中药
灯盏花。灯盏花原为我国传统民间药，现已收入《中
国药典》2005年版一部。近年来，灯盏花提取物已被
开发用于多种疾病的临床治疗[1~3]，尤其在治疗心
脑血管疾病方面疗效显著。但在其开发过程中由于
过度采集造成了其野生资源的匮乏n]。目前我国云
南地区已开展了短葶飞蓬人工种植方面的研究，但
在人工引种栽培过程中存在繁殖慢、成活率低以及
品质不稳定等问题[5]。本研究利用已建立的短葶飞
蓬快速繁殖体系[6]，对短葶飞蓬进行毛状根诱导培
养并测定其黄酮及灯盏乙素的量，旨在为开发利用
灯盏花黄酮类药用成分提供新的资源与途径。
1材料与方法
1．1 植物材料：利用短葶飞蓬无菌苗[6]，取生长健
壮的小植株的叶片(去主脉)分割成叶盘(大小约5
mm×5mm)，放在不含任何激素的MS培养基
(MS。)上，防止外植体脱水。
1．2 菌株：发根农杆菌Agrobacteriumrhizogenes
C58C1菌种由复旦大学遗传工程国家重点实验室
提供，从平板上挑取该农杆菌单菌落，接种到含30
mg／L利福平的LB液体培养基中28℃振荡(180
r／min)培养过夜，供感染用。
1．3 毛状根的诱导与继代培养：在超净台上(以下
均在无菌条件下操作)将上述叶盘放入50mL活化
好的上述菌液中，封口后置于28℃摇床上70r／min
振荡10min；将外植体用灭菌吸水纸稍稍吸干后接
种到MS。培养基上，于暗处(25±2)℃共培养约
1～2d后，用无菌水冲洗几次后接种到选择培养基
MS+300mg／L头孢噻肟钠(Cefotaxime，Cef)上。
诱导出的毛状根约2cm长时切下转移到新鲜培养
基上，每两周继代一次，继代过程中逐步降低Cef筛
选压。剪取脱菌完全的毛状根尖约2cm接种到B5、
1／2B。、MS、1／2MS液体培养基上，置于摇床上70
r／rain振荡，(25士2)℃暗培养，第7、14、21、28、35、
42天记录每瓶毛状根的鲜质量以第一次记录的毛
收稿日期：2006—01—10
作者简介：刘成洪(1975一)，男，湖北人，生药学专业博士研究生，主要从事药用植物基因工程研究。
*通讯作者陈万生Tel：(021)63610109—73712E—mail：chenws@vnet．citiz．net
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第11期2006年11月·1731·
状根鲜质量为基数计算各毛状根系增长倍数，绘制
不同培养基中毛状根系的生长速率曲线。
1．4毛状根的PCR检测：超净台上剪取约50mg
的新鲜毛状根，编号后采用SDS小量法抽提总
DNA。根据文献报道[7]设计rolb、rolc基因PCR检
测引物。rolb基因引物：Frolb：5，_GCTCTT—
GCAGTGCTAGATTT一37，Rrolb：57一GAAGGT—
GCAAGCTACCTCTC一37；rolc基因引物：Frolc：
57一CTCCTGACATCAAACTCGTC一37，Rrole：57一
TGCTTCGAGTTATGGGTACA一37。在0．2mL
薄壁管中加入模板DNA约40ng，TaqDNA聚合
酶2个单位，PCR反应总体积为50肛I。。PCR扩增
参数如下：起始94C热变性3min后，接着进行30
个循环，每个循环包括94C变性45S，56‘C退火45
S和72℃延伸反应90S，循环结束后72‘C延伸7
min。扩增产物采用0．8％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙
锭染色进行分析。
1．5 毛状根中灯盏总黄酮和灯盏乙素测定
1．5．1对照品溶液制备：精密称取在120‘C减压干
燥至恒重的芦丁对照品48．0mg，置25mL量瓶中，
加甲醇20mI。，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇
至刻度，摇匀，精密量取10．0mI，置100mL量瓶
中，加水至刻度，摇匀，即得黄酮对照品溶液。
精密称取60‘C减压干燥4h的6．5mg灯盏乙
素对照品，用甲醇(HPLC级)溶于50mL量瓶中，
超声使溶解完全后，冷却，定容，即得灯盏乙素对照
品溶液。
1．5．2供试品溶液制备：随机取短葶飞蓬种子发芽植
株5株，切取根部用自来水洗净根上附着培养基，吸水
纸吸干，分别编号，50℃干燥过夜至恒重，研磨成粉，
过40目筛，精密称取100mg干粉加入20mL甲醇，
超声提取30min，5000r／rain离心5min，收集上清，
沉淀加入20mL甲醇继续同上超声提取30min，同前
离心后合并上清液，全部转移至50mL量瓶中，用甲
醇适量洗涤容器，定容至50mL，该样品溶液用于总黄
酮测定；样品溶液经0．45扯m有机相膜滤过后，用于
HPI。C检测灯盏乙素。重复测定1次。
取通过液体振荡扩大培养获得的生长迅速的3
个毛状根系(编号分别为C58C1—7、C58C1—10和
C58C1—11)，同上述正常根处理，每个根系重复测定
1次。
1．5．3实验条件选择：利用UV法测定短葶飞蓬
总黄酮，参照文献方法[8]。检测波长为510nm，使用
UV一2100双光束紫外分光光度计(北京瑞利分析仪
器公司)。
利用HPLC测定灯盏乙素，参照文献方法[9’1⋯。
HPLC色谱条件：色谱柱为DiamonsilC18柱(5肛m，
200mm×4．5mm，美国迪马公司)，流动相为甲醇一
0．I％磷酸(40：60)，检测波长为335nm，体积流量
为1mL／min，灵敏度为AUFS一1．0，柱温为室温。
使用高效液相色谱仪(Waters515泵，Waters2487
Dual入AbsorbanceDetector)，SR2000色谱工作站
(上海三锐科技有限公司)。
对照品芦丁与灯盏乙素(野黄芩苷，96．4％)均
购自中国药品生物制品检定所，甲醇为HPI。C级，
水为双蒸水。
1．5．4标准曲线的制备：精密量取芦丁对照品溶液
0、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5mL，分别置10mL量瓶
中，各加水至3mL÷加5％亚硝酸钠溶液0．5mL，使
混匀，放置6min，加10％硝酸铝溶液0．5mL，摇匀，
放置6min，加1mol／L氢氧化钠溶液5mL，再加水
至刻度，摇匀，放置15min，照紫外一可见分光光度法
(《中国药典》附录VA)，在510rim的波长处测定吸光
度，以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准
曲线。在0．0096～o．0480mg／mL与吸光度线性关
系良好，Y一15．75X一0．0226，r一0．9994。
用移液管分别精密量取灯盏乙素对照品溶液
0．1、0．4、0．8、1．6、3．2mL至10mI。量瓶中，定容，
摇匀，制成质量浓度为1．3、5．2、10．4、20．8、41．6
t-g／mL对照品溶液，分别进样测定。以峰面积为纵
坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。进样量在
1．3～41．6mg／mL与峰面积线性关系良好，Y一
189665．39X一173471．88，r一0．9998。
2结果与分析
2．1 感染时间与共培养时间对转化外植体生长的
影响：在利用叶盘法诱导短葶飞蓬毛状根的过程中，
观察到农杆菌侵染时间对转化效率影响较大，侵染
时间过长很容易造成叶盘褐化死亡，感染时间不宜
超过10min，说明本实验所用供试材料对转化使用
的农杆菌比较敏感。
共培养时间过长也会对转化产生不利影响。随
着共培养时间的延长，由于农杆菌过度繁殖，褐化死
亡的外植体数量迅速上升。通常观察到共培养2d
外植体周围就有水渍状菌液长出，为生长起来的农
杆菌，此时宜用无菌水将外植体冲洗两次吸干水分
后转移到选择培养基上培养。共培养到第3天，农杆
菌已大量繁殖，外植体周围可见白色液体状菌液，此
时即使用较高质量浓度Cef(500mg／L)冲洗外植
万方数据
·1732· 中草蔼 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第11期2006年11月
体后，在选择培养中也不易控制农杆菌生长。
2．2短葶飞蓬毛状根的诱导与继代培养：在发根农
杆菌介导的初步转化中，叶盘经农杆菌侵染约20d
后，观察到叶盘边缘处长出毛状根(图1A)，利用发
根农杆菌侵染叶盘获得了大量的毛状根，在浸染的
214个叶盘中，有89个叶盘诱导出了毛状根。
毛状根经剪取根尖继代培养7～8次(约2个
月)后均已脱菌完全，转到液体培养基上进行了扩大
培养。在4种不同的培养基上，毛状根在B。液体培
养基中生长速度最快(图1B)，总体上是B。>
1／2MS>MS>1／2B。(图2)。毛状根整个生长周期
约为45d，其中在第6周生长速度达到最快，在第7
周生长进入停滞期，毛状根开始变硬，部分根尖开始
褐化，培养基变得浑浊黏稠。
A一叶盘边缘诱导出毛状根
B—Bs液体培养基上培养的毛状根系
A—hairyrootinducedfromcutendofleafdisc
B—hairyrootlineculturedinB5liquidmedium
图1 毛状根诱导与液体培养
Fig．1Inductionandliquidcultureofhairyoots
—卜l／285
—-I／2MS
+B5
--0--MS
图2毛状根系C58C1—7不同液体培养基培养生长曲线
Fig．2GrowthcurveofhairyootlinesC58C1·7
indifferentliquidmedia
2．3 毛状根rol基因的PCR扩增：Rolb与rolc基
因是发根农杆菌Ri质粒上TL—DNA(T—DNA左
臂)上对转化细胞产生毛状根过程起重要作用的两
个基因。利用这两个基因各自对应的一对引物，通过
PCR一次扩增出了这两个基因的对应片断，大小分
别为383bp与586bp的两条条带(见图3)，与文献
报道的大小一致[7]，而从短葶飞蓬非转化正常根中
未扩增出相应片断。这表明含rol基因的RiT—DNA
部分已经整合到短葶飞蓬基因组中。PCR检测了51
个来自不同转化事件的毛状根，阳性转化毛状根数
为27个，阳性转化率为52．9％。
1～4一不同的毛状根系M—DL2000分子量标准
CK一正常根
1—4一differentlinesofhairyootM—DL2 000Marker
CK—normalroot
图3毛状根rol基因PCR检测电泳圈
Fig．3EiectrophoretogramofrolgenesPCR
identificationofhairyroots
2．4发根系中灯盏总黄酮和灯盏乙素测定：对于转
化获得的毛状根经液体振荡扩大培养获得了生长迅
速的发根系，经PCR检测后测定了发根系中灯盏总
黄酮和灯盏乙素的量(表1)。
表I 短葶飞蓬不同发根系总黄酮和灯盏乙素
Table1 Totalf avonesandscutellarinindifferent
hairyootlinesofE．breviscapus
3讨论
在发根农杆菌介导的遗传转化研究中，叶盘法
已成为经典转化方法，本实验选用叶盘作为外植体
诱导毛状根。在毛状根诱导中，观察到未转化叶盘在
MS。培养基上仍可以从叶盘边缘生出幼根，这可能
与植物本身的内源激素水平较高有关，可以直接诱
发其生根。由于转化培养中不存在筛选压，而叶盘即
使未经农杆菌侵染，仍可以在叶盘边缘长出根，在转
化初期并不能鉴别排除，被剪下来继代培养，它们的
存在可能使得阳性率偏低。因此对于转化获得的毛
状根需要经过多次剪取根尖继代培养，从生长形态
上筛除非转化毛状根。
黄酮类化合物为灯盏花中的主要药用成分，在
原植物根中量相对地上部分较低[1¨，本研究测得灯
盏花种子发芽植株正常根总黄酮量约为3％，与上
述报道的野生短葶飞蓬根部总黄酮量相近。有报道
在金丝桃属植物中通过植物组织培养可能是生产黄
酮类物质的另一个有效途径[1引，本实验通过转基因
从短葶飞蓬叶盘诱导毛状根后，通过器官培养也检
万方数据
中草喃 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第1I期2006年11,El·1733·
测到黄酮合成并且量略有提高。已知灯盏乙素是灯
盏花中的有效成分之一[13|，它是一个由黄酮苷元和
糖基配体组成的黄酮类化合物，在次生代谢中以终
产物的形式存在。在毛状根培养物中检测到大量黄
酮存在而灯盏乙素的量很低，这可能与毛状根中合
成灯盏乙素下游相关的代谢调控酶有关，笔者将在
已建立的短葶飞蓬毛状根转化体系的基础上进一步
开展灯盏乙素生物合成关键酶的研究。
References：
[1]ChengSF，ZhangYN，ZhangXP，eta1．RecentResearch
ofBreviscapininclinicalapplications[J]．LishizhenMed
MaterMedRes(时珍国医国药)，2000，11(2)：177—178．
[2]WeiN．Advancesofbreviscapininclinicalapplicationsand
itsside—effects[J]．ChinPharm(中国药师)，2001，4(2)：
144—146．
[3]MaQ，LiYI，，HangY P．Clinicalapplicationsof
breviscapinEJ]．HerMed(医药导报)，2003(22)
(Supplement)：79．
[4]YuHY，ChenzL．StudyonartificialultureofErigeron
breviscapus[J]．ActaBotYunnan(云南植物研究)，2002，24
(3)：1】5一120．
[5]YangSC，YangZX，ZhangQQ，ela1．Preliminarystudies
ongrowingofErigeronbreviscapus[J]．ChinTraditHerb
Drugs(中草药)，2004，35(3)：318-321．
r6]LiuCH，ZhangMK，DengH，eta1．Establishmentofrapid
propagationsystemofErigeronbreviscapus[J]·ChinTradit
HerbDrugs(中草药)，2005，36(4)：597—599．
r7]AleksandraK，lz belaS，KrzysztofB，eta1．Establishment
ofhairyootcuhuresofAmmimaju5[J]．PlantSci，2001，
160：259—264．
[8]WuZ C，LiangWY，DingYS．Studyonultrasonic
extractionoftotalflavonesofErigeronbreviscapusLJJ．
Yunnan。ITraditChinMedMater(云南中医中药杂志)，
2004，25(3)：35—36．
[9]ChP(中国药典)[s]．VolI．2005．
[10]ZhangH，ZhangzF．Ecologicalandbiologicalan ysisof
scutellarininErigeronmultiradiatus[J]．ChinTraditPat
Med(中成药)，2004，26(1)：60—62．
r11]FengDX，ChenB，DangCL，ela1．Studyonvariationof
totalf avonoidsinErigeronbreviscapu口]．ChinTraditHerb
Drugs(中草药)，2003，34(4)：362—365．
[12]ZengHY，ZhouPH，PeiG．Totalflavonoidc ntentsin
culturalm terialsofHypericumsampsonii[J]．JPlant
ResourEnviron(植物资源与环境学报)，2002，11(1)：59—
60．
[13]CuijM，WuS．Theadvanceontheresearch0fbreviscapine
[J-I．NatProdResDev(天然产物研究与开发)，2003，15
(3)：255—258．
茯苓灭活原生质体融合育种研究
梁清乐，王秋颖。，曾念开，王怀凯
(中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京 100094)
原生质体融合是一项重要的生物工程技术，近
30年来发展迅速，该技术比基因工程法和原生质体
转化法简便易行，可以克服传统育种法中细胞壁和交
配系统对育种的障碍，实现种间、属间以至远缘的杂
交。由于原生质体融合是整套基因组连同细胞在内的
其他组分一起融人另一细胞，就为遗传物质的充足和
有效表达提供了更多的机会，且并不需要预先了解有
关基因组或单个基因太多的具体细节，就能改变物种
的生物学特性，获得新品种，甚至可以通过将几个优
良品种的融合而将多种优良性状组合到单个菌株中，
所以，这是一个有可能在较短时期内取得明显成效的
育种方法[1]，并被广泛应用于微生物遗传育种工作
中[2]。灭活原生质体融合是对原生质体融合技术的重
大发展。自1977年以来，人们开始了用灭活原生质体
进行微生物融合育种的尝试[3]。
茯苓Poriacocos(Fr．)wolf是传统名贵中药，
近年来，茯苓菌种退化严重，给生产带来巨大的损
失。笔者在对茯苓原生体制备与再生条件进行探索
的基础上H]，通过原生质体融合技术，得到了茯苓融
合重组子，并对融合子进行了初步的鉴定。
1材料和方法
1．1 出发菌株：Z，。一：为中国医学科学院中国协和医
科大学药用植物研究所真菌室保藏；Z。∽来自福建
三明真菌研究所。
1．2培养基
1．2．1斜面培养基：麦麸5％(水煮0．5h，滤过，取
滤汁)，葡萄糖2％，磷酸二氢钾0．3％，硫酸镁
0．15％，VB0．001％，琼脂1．5％，pH值6．5。
1．2．2发酵培养基：麦麸5％(水煮0．5h，滤过，取
滤汁)，葡萄糖2％，磷酸二氢钾0．3％，硫酸镁
0．15％，VB0．001％，琼脂1．5％，pH值6．5。
1．2．3再生培养基：马铃薯10％(水煮0．5h，滤
过，取滤汁)，酵母粉0．3％，蛋白胨0．5％，葡萄糖
2％，磷酸二氢钾0．2％，硫酸镁0．1％，硫酸铵
0．1％，VB0．001％，琼脂条1．5％(煮溶)。
1．2．4高渗再生培养基：再生培养基中加入0．5
收稿日期：2006—03—06
*通讯作者王秋颖Tel：(010)62818260E～mail：qywang@implad．ac．en
万方数据
短葶飞蓬毛状根的诱导及黄酮类成分测定
作者： 刘成洪， 段艳冰， 张磊， 张汉明， 张卫东， 陈万生， LIU Cheng-hong， DUAN Yan-
bing， ZHANG Lei， ZHANG Han-ming， ZHANG Wei-dong， CHEN Wan-sheng
作者单位： 刘成洪,段艳冰,张磊,张汉明,LIU Cheng-hong,DUAN Yan-bing,ZHANG Lei,ZHANG Han-
ming(第二军医大学药学院,上海,200433)， 张卫东,ZHANG Wei-dong(现代中药研究中心,上
海,200433)， 陈万生,CHEN Wan-sheng(现代中药研究中心,上海,200433;第二军医大学附属
长征医院药学部,上海,200003)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(11)

参考文献(13条)
1.Cheng S F;Zhang Y N;Zhang X P Recent Research of Breviscapin in clinical applications[期刊论文]-时
珍国医国药 2000(02)
2.Wei N Advances of breviscapin in clinical applications and its side-effects[期刊论文]-中国药师
2001(02)
3.Ma Q;Li Y L;Hang Y P Clinical applications of breviscapin 2003(zk)
4.Yu H Y;Chen Z L Study on artificial culture of Erigeron breviscapus[期刊论文]-云南植物研究
2002(03)
5.Yang S C;Yang Z X;Zhang Q Q Preliminary studies on growing of Erigeron breviscapus[期刊论文]-中草
药 2004(03)
6.Liu C H;Zhang M K;Deng H Establishment of rapid propagation system of Erigeron breviscapus[期刊论
文]-中草药 2005(04)
7.Aleksandra K;lzabela S;Krzysztof B Establishment of hairy root cultures of Ammi majus[外文期刊]
2001
8.Wu Z C;Liang W Y;Ding Y S Study on ultrasonic extraction of total flavones of Erigeron breviscapus
[期刊论文]-云南中医中药杂志 2004(03)
9.中华人民共和国药典(一部) 2005
10.Zhang H;Zhang Z F Ecological and biological analysis of scutellarin in Erigeron multiradiatus[期
刊论文]-中成药 2004(01)
11.Feng D X;Chen B;Dang C L Study on variation of total flavonoids in Erigeron breviscapu[期刊论文]-
中草药 2003(04)
12.Zeng H Y;Zhou P H;Pei G Total flavonoid contents in cultural materials of Hypericum sampsonii[期
刊论文]-植物资源与环境学报 2002(01)
13.Cui J M;Wu S The advance on the research of breviscapine[期刊论文]-天然产物研究与开发 2003(03)


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