全 文 ：中草芮ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第12期2006年12月·18 3·
药理与临床
人参皂苷Rg，诱导人肝HL一7702细胞糖皮质激素受体
报告基因表达的作用
李勇1，李毅平1
(1．上海中医药大学附属上海市中医医院，上海
，虞胜1，凌昌全2
’
200071；2．第二军医大学中医系，上海200433)
摘 要：目的 探讨人参皂苷Rgl(ginsenosideRg。，G—Rg，)对人肝HL一7702细胞糖皮质激素受体(GR)的调节
作用。方法 将含有糖皮质激素受体反应元件(GRE)的荧光素酶报告基因的表达质粒载体pGRE—tk—LUC与内
参照基因载体质粒pRL—SV40，通过脂质体介导瞬时转染至人肝HL一7702细胞中，利用双荧光素酶报告基因检测
系统，观察报告基因的表达变化；利用Westernblotting方法检测药物对细胞GR蛋白表达的影响。结果G—Rg-与
地塞米松均可诱导pGRF—tk—LUC报告基因表达，且呈剂量依赖性，而且这种诱导作用可以被糖皮质激素受体阻
断剂RU486(MKepristone)所阻断，G—Rg，对细胞GR蛋白表达有显著的抑制作用。结论G—Rg·在体外能够表现
出一些类似糖皮质激素样的生物活性，可能是GR的配体。
关键词：人参皂营Rg。；糖皮质激素受体(GR)；报告基因
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)12—1823—04
InducementofginsenosideRglonexpressionof鲥ucocorticoid
receptorreportgeneinHL一7702cells
LIYon91，LIYi—pin91，YUSheng，LINGChang—quan2
(1．ShanghaiHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliateedinShanghaiUniversityofTraditionalChinese
Medicine，Shanghai200071，China；2．DepartmentofTradi io alChineseMedicine，
TheSecondMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200433，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectofginsenosideR91(G—R91)onregulationof
glucocorticoidre eptor(GR)inHL一7702cells．MethodsHL一7702Cellsweretransientlyco ransfectedby
LipofectAMINETM2000withpGRE—tk—LUCreporterplasmidanpRL—SV40plasmid．Theeffectsof
G—RglandDexamethasoneonluciferaseactivityexpressionweredetectedbyDual—LuciferaseR porter
Assays，theproteinexpressionofGRinHL一7702cellswasanalyzedbyWesternblottingassay，
respectively．ResultsAdo e—dependenti uc ionofthereportergenewasobservedinresponsetoD xor
G—R91，andtheinductiveeffectwasblockedbytreatmentwiththeantiglucocorticoidRU486
(Mifepristone)．G—R91alsodown—regulatedtheGRproteinxpressioninHL一7702cells．Conclusion
Theser sultss ronglyindicatethatG—Rgl，whichmaybealigandofGR，hassomeglucocorticoid—like
effectinvitro．
Keywords：ginsenosideR91(G—R91)；glucocorticoidre eptor(GR)；reportgene
人参具有抗衰老、抗应激、抗肿瘤和调节免疫等
功能口]。人参皂苷是人参的主要药效成分，人参皂苷
可分人参二醇、三醇、齐墩果酸型皂苷。人参有许多
与糖皮质激素(GC)相似的药理作用，而GC的这
些作用都是通过糖皮质激素受体(GR)介导的。为
了解人参皂苷中是否存在能有效激活GR的成分，
本课题组利用双荧光素酶报告基因检测方法，观察
了人参皂苷单体Rb，、Re、Rg。、Rg。对GR报告基因
表达的影响，发现人参皂苷Rg，(G—Rg。)可特异性
诱导GR报告基因表达，具有剂量依赖性，并且
G—Rg，能够显著抑制细胞GR的表达。
1材料与方法
1．1 主要试剂和药物：质粒pGRE—tk—LUC(Dr．
Simons惠赠，美国NIH)；pRL—SV40、大肠杆菌
收稿日期：2006—03—13
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30472271)
作者简介：李勇(1968一)，男，河南省唐河县人，医学博士，副主任医师，硕士生导师，主要从事中西医结合消化疾病的临床与基础研究
工作。Tel：(021)56624066E—mail：liyon98256@sohu．com
万方数据
·1824· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第12期2006年12月
DH5a(第二军医大学病生教研室李忆东硕士惠
赠)。质粒抽提试剂盒(Qiagen公司)；Lipofect
AMINElM2000转染试剂盒(Invitrogen公司产
品)；Dual—RuciferaseReporterAssayS stem试剂
盒(Promega公司)；鼠抗GR单克隆抗体(GRH一
300，SantaCruz，美国)；活性炭(Serva公司)；地
塞米松(Sigma公司)，3g地塞米松用无水乙醇
0．76mL溶解后制成10mmol／L母液，4℃贮存；
4．3mg糖皮质激素受体阻断剂RU486(Sigma公
司)，无水乙醇1mL，溶解后4℃贮存。G—Rg。(质量
分数≥98．8％)购自中国药品生物制品检定所；
G—Rg，20mg经75％乙醇处理，用细胞培养液配至
终质量浓度为10mg／mL母液备用；其他材料及试
剂均为进口或国产分析纯。
1．2 细胞系及细胞培养：HL一7702为人正常肝组
织来源细胞(中国科学院上海细胞研究所建株)，置
含5％小牛血清及抗生素的RPMI一1640(Gibco
BRI。公司)培养液中，于37。C、5％CO。饱和湿润
空气中培养。
1．3荧光素酶报告基因检测
1．3．1 质粒的扩增及纯化：按文献方法[2]，制作感
受态细胞、质粒转化、阳性克隆细胞筛选、质粒扩增，
按Qiagen—tip100(Midi)plasmidurificationkit
质粒抽提试剂盒说明书进行质粒抽提、纯化并定量。
1．3．2脂质体介导的细胞瞬时转染：严格按转染试
剂盒说明书操作。HI。一7702细胞以每孑L8×104个接
种于24孔培养板中，用含10％FBS的RPMI一1640
完全培养液培养细胞2d(细胞长至80％满)，去培
养液，用PBS洗细胞两次。取500ng荧光素酶报告
基因质粒pGRE—tk—LUC、5ng内参照基因质粒
pRI。一SV40(二者比例为100：1)与1．2肛g脂质体
共同加入0．6mL无血清、无抗生素的RPMI—1640
培养液中，混匀室温孵育30min后转入培养孔中。
于5％CO：、37‘C培养8h。弃去转染混合液，更换
含10％FBS(DCC处理)的RPMI一1640培养液
0．5mL，用试验药物或地塞米松进行相应处理，而
对照组用70％乙醇代替。根据需要培养所需时间
后，弃去培养液，用1×PLB(passively isbuffer)
裂解细胞后，立即上机检测。
1．3．3报告基因荧光素酶(LUC)的测定：LUC
活性测定按双荧光素酶报告基因检测系统(Dual—
LuciferaseReporterAssay)试剂盒说明书进行，用
MinilumatLB9506单光子检测仪(Berthold公司，
德国)检测，记录报告基因pGRE—tk—LUC荧光素
酶与内参照基因pRL—SV40荧光素酶活性的比值。
1．4 W sternblotting检测
1．4．1 样品的制备：取对数生长期细胞按每孔
1．2×106的密度接种于6孔板。按试验设计加入含
药物培养液培养细胞到预定时间，离心收集细胞，用
PBS洗涤细胞后，加入上样缓冲液100肛L，剧烈振
荡后冰浴下超声处理1rain。100℃加热10min使
蛋白变性，12000r／rain离心10min，取上清液存于
一20℃待测。蛋白浓度用Bradford法[3]测定。
1．4．2Westernblotting分析：取50pg蛋白在
SDS—PAGE电泳下分离，分离胶为12％，积层胶为
5％。根据预染的蛋白Marker指示，小心割取GR
(相对分子质量94000)所在区带，电转移至硝酸纤
维素膜，用15％脱脂奶粉于室温下摇动封闭膜
2h。膜在抗GR多克隆抗体(1：500)稀释液中
4℃孵育过夜，聚山梨酯20一PBS洗膜15rain，共3
次后，在二抗(HRP标记)稀释液(1：500)中孵育
4h。再次洗膜后加入ECL试剂，反应1rain，用X
片曝光1～5min(根据荧光强度而定)，对底片上的
显影条带进行计算机吸光度扫描定量。
1．5 统计学方法：所有实验均重复3次，数据以
z±S表示，采用F检验进行统计学处理。
2结果
2．1对HL一7702细胞内pGRE—tk—LUC的诱导表
达：使用地塞米松(10nmol／L)、G—Rg，(5弘g／mL)
分别处理HL一7702细胞12、24、36、48、72h后，观
察药物对细胞报告基因表达的影响，结果显示，地塞
米松可明显诱导报告基因的表达，作用细胞36h可
以得到最大的51倍的诱导效应；5pg／mLG—Rg。也
可以诱导细胞内pGRE—tk—LUC的表达，48h时最
大诱导效应为23倍(图1)。为了更进一步探讨药
物对HL一7702细胞中的GR报告基因的转录激活
效应，利用不同浓度的地塞米松(1×10_10～1×
10_6mol／L)以及G—Rg。(O．625～10p．g／mL)诱导
细胞48h后检测报告基因的表达。见图2。当地塞
米松浓度为100nmol／L时，可以获得最高达97倍
的诱导效应；而当G—Rg，质量浓度为5>g／mL时，
可以获得最大的诱导效应(图3)。
2．2 糖皮质激素受体阻断剂RU486对地塞米松
及G—Rg。诱导效应的抑制作用：为确定地塞米松及
G—Rg。对GR报告基因的诱导表达是通过GR途径
来实现的，进一步利用RU486(1×10_6mol／L)分
别与地塞米松(1x10_7mol／L)和G—Rg。(5P-g／
mL)共同作用细胞，48h后检测报告基因的表达变
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第12期2006年12月·18 5·
O 12 24 36 48 72
7／h
圈1 G—Rgl对HL一7702细胞内pGRE—tk—LUC的
诱导表达G土s，n=3)
Fig．1InducementofG—Rg,onexpressionofpGRE—tk-
LUCgeneinHL一7702cellsG+s，玮一3)
摄
毽
曲
憋
一
趟
蛭
避
黼
裂
划
0 o．1 1 1() 100 1 000
C／(nmo]·L’1)
图2不同浓度的地塞米松对HL一7702细胞内
pGRE—tk—LUC的诱导表达(z土s，n一3)
Fig．2InducementofDexamethasoneatvariousconcen-
trationsexpressionofpGRE_。tk·—LUCgene
inHL．7702cells(；±s，捍一3)
S30
我
主15
藿10
蓑 i
o o625 1 25 25 5 10
P／(ug，mL。1)
圈3不同质量浓度G—Rg。对HL一7702细胞内
pGRE—tk—LUC的诱导表达Gis，露一3)
Fig．3InducementofG—Rglatvariousconcentrations
onpGRE—-tk-LUCgeneinHL_‘7702cells
(；±s，乃一3)
化。结果显示，地塞米松、G—Rg。对HL一7702细胞内
GR特异性荧光素酶报告基因的诱导表达作用可被
GR阻断剂RU486阻断(图4)。
2．3药物对HL～7702细胞GR蛋白的下调作用：
为了进一步探讨G—Rg。对HL一7702细胞内GR蛋
自的影响，利用地塞米松(1x10～tool／L)、G—Rg。
(5／*g／mL)共同作用细胞48h后，通过Western
blotting方法检测细胞内GR蛋白的表达变化。结
果地塞米松、G—Rg。作用细胞后，细胞内GR蛋白表
达明显减少，与对照组相比差异显著(P<0．01)
(图5)。
辅
也
曲
憋
一
掣
蜒
嚣
船
鬟
球
一
+t I I三生
地塞米松地塞米松+G-Rg，G·Rgl+RU486
RU486
与地塞米松组比较：一P与G—R91组比较；△△P<0．01
’’P<0．01usDexamethasonegroup
△△尸图4 RU486对G—Rg。诱导效应的抑制作用(xis，聆一3)
Fig．4InhibitionofRU486onG-Rgl-inducement
Q士S，席一3)
对照 G．Rg． 地塞米松
与对照组比较：一P’’P图5 G—Rg，对HL一7702细胞GR蛋白表达的影响
(xis．n一3)
Fig．5EffectofG—R91onproteinxpression
ofGRinIlL一7702cells(；±s，尼一3)
3讨论
GC对机体的发育、分化和代谢起着重要作用，
GC的作用主要是由细胞内GR所介导的，在人体
肝和胸腺组织中GR表达最多，这种配基依赖的转
录因子的作用机制已被阐明。目前认为，GC调节基
因表达的基本模式：GC与GR结合导致GR的活
化，活化的GR以同二聚体的形式与靶基因中的糖
皮质激素反应元件(glucocorticoidresponse
element，GRE)结合，通过与共调节因子和基础转
录成分相互作用，促进或抑制靶基因的表达，引起生
物学效应[43；而GC在诱导GR激活的同时也会抑
制GR的表达[5]。
人参系五加科多年生草本植物，为传统补虚中
∞
踟
∞
钳
加
o
∞
冤
∞
∞
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一摄逛砷烙一蛆螟避隔米取
阱
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小
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孓oo_I最蠹噬靛§v述麒骥艘≮嘭o
万方数据
·1826· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第12期2006年12月
药，人参中成分复杂。人参皂苷是人参的主要活性成
分，属于三萜类物质，在结构上具有类似GC样的甾
环结构。人参在抗应激、调节免疫等方面作用有类似
GC样作用。先前的研究发现，人参茎叶总皂苷在体
外能够增强地塞米松诱导的GR受体特异性荧光素
酶报告基因的表达[6]，进一步的研究发现，这种作用
可能是通过其抑制地塞米松对GRmRNA以及蛋
白的下调作用而实现的[7]。人参茎叶总皂苷是多苷
元的复合物，不同的人参单体皂苷的作用及其机制
也不完全一致。本课题组利用双荧光素酶报告基因
检测方法，以地塞米松作为参照，观察了人参二醇以
及三醇皂苷单体Rb，、Re、Rg。、Rg。对GR报告基因
的诱导表达，结果显示，G—Rg。可特异性诱导GR报
告基因表达，具有剂量依赖性；并且G～Rg。作用
HL一7702细胞后，细胞GR蛋白表达明显下降，本
实验结果初步显示G—Rg。具有GC样的活性，此结
果可能对发现人参以及人参皂苷新的药理学作用以
及作用靶点奠定一定的实验基础。
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洋金花有效部位及其组分对二甲基亚砜损伤的中国仓鼠
卵巢细胞的保护作用
唐玲1，王秋红1，杨炳友1，肖洪彬1，孙艳萍2，匡海学p
(1．黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040；2．北京大学中国药物依赖性研究所，北京100083)
摘 要：目的 观察洋金花不同提取物(有效部位、醉茄甾内酯组分和黄酮组分)对二甲基亚砜(DMSO)损伤的
中国仓鼠卵巢(CH0)细胞的保护作用。方法常规传代培养CHO细胞，采用噻唑蓝(MTT)法和乳酸脱氢酶
(LDH)法测定细胞活性。结果3％DMSO与CHO细胞共同孵育24h后，经MTT法检测细胞存活率明显下降。
洋金花有效部位(10～80,ug／mL)剂量依赖性增加细胞活性；洋金花醉茄甾内酯组分(30～120Fg／mL)对DMSO
的细胞损伤作用无明显影响，而洋金花黄酮组分(2．5～20vg／rnL)呈剂量依赖性减轻DMSO对细胞的损伤作用。
4．5％DMSO与CHO细胞共同孵育24h后，细胞LDH的漏出率明显增加。洋金花有效部位(10～80}tg／mL)、洋
金花醉茄甾内酯组分(30～120,ug／mL)和洋金花黄酮组分(2．5～20,ug／mL)均不能降低细胞LDH的漏出率。
结论洋金花中的黄酮组分可以减轻DMSO的细胞毒性，此种药理作用可能与改善细胞线粒体的功能有关，而对
细胞膜的损伤无明显保护作用。
关键词：洋金花；中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；二甲基亚砜(DMSO)；醉茄甾内酯；黄酮组分(FC)
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)12—1826—06
ProtectiveeffectsofactivefractionandconstituentsfromFlosDaturae
onChinesehamsterovarycellsinjuriedbydimethylsulfoxide
．TANGLin91，WANGQiu—hon91，YANGBing—youl，XIAOHong-binl，
SUNYan—pin92．KUANGHai—xuel
收稿日期：2006—03—14
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30371736)
作者简介：唐玲(1977一)，女，黑龙江省哈尔滨市人，黑龙江中医药大学博士研究生，主要从事中药复方药效物质基础及其作用机制研
究。 E—mail：tangyulin96688@163．com
*通讯作者匡海学Tel：(0451)82110803Fax：(0451)82110803E—mail：hxkuang@hotmail．com
万方数据
人参皂苷Rg1诱导人肝HL-7702细胞糖皮质激素受体报告基因
表达的作用
作者： 李勇， 李毅平， 虞胜， 凌昌全， LI Yong， LI Yi-ping， YU Sheng， LING Chang-
quan
作者单位： 李勇,李毅平,虞胜,LI Yong,LI Yi-ping,YU Sheng(上海中医药大学附属上海市中医医院,上
海,200071)， 凌昌全,LING Chang-quan(第二军医大学,中医系,上海,200433)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(12)
被引用次数： 2次

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