全 文 :中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月·715·
药理与临床
芒果苷诱导白血病K562细胞凋亡机制的研究
彭志刚1,罗 军1,赖永榕1,宋善俊2
(1.广西医科大学第一附属医院血液科,广西南宁530021;2.华中科技大学同济医学院
附属协和医院血液科,湖北武汉430021)
摘 要:目的 研究芒果苷诱导慢粒白血病细胞系K562细胞凋亡的机制。方法采用RT—PCR检测芒果苷
(25~200pmol/L)处理(24、48、72、96h)后K5 2细胞中bel一2mRNA、baxmRNA、survivinmRNA基因表达变
化;采用Westernblotting方法检测K562细胞BCR/ABL融合蛋白质P2lo水平。结果芒果苷作用K562细胞后,
Pzzo蛋白质水平下调,并呈时间及剂量依赖性,bax基因表达显著上调,bcl一2基因表达轻度下调,survivinmRNA基
因表达下调。结论 芒果苷诱导K562细胞凋亡的机制可能是通过下调BCR/ABL融合蛋白质Pz,o、bcl一2和
surviVinmRNA基因表达及上调bax基因表达来实现的。
关键词:芒果苷;K562白血病细胞;细胞凋亡
中图分类号:R286.91 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(2007)05—0715一05
ApoptoticmechanismofleukemicK562cellsinducedbymangiferin
PENGZhi—gan91,LUOJunl,LAIYong—ron91,SONGShan—jun2
(1.DepartmentofH motology,TheFirstAffiliatedHospital,GuangxiMedicalUn versity,Nanning530021,China;
2.DepartmentofH motology,UnionHospital,TongjiMedicalCo lege,HuazhongUniversity
ofScienceandTechnology,Wuhan430021,China)
Abstract:ObjectiveTostudytheapoptosismechanismofK562cellinesinducedbymangiferin.
MethodsThemRNAexpressionlevelsofapoptosis—relatedg nesincludingbcl-2,bax,survivinofK562
cellstreatedbymangiferin(25—200肛mol/L)for24,48,72,and96hweredeterminedbyRT-PCR;the
BCR/ABLproteinP210levelwasdetectedbyWesternblotting.ResultsMangiferinup—regulatedb xgene
ofK562cellssignificantlyandown—regulatedbcl一2g neslightly,resultinginanenhancementofthera io
ofbax/bcl一2.Mangiferindown—regulatedthexpressionlevelsofP210inK562cellsina time—and
concentration—dependentmann randSOisthexpressionlevelfsurvivinmRNAinK562cellS.Conclusion
Themechanismofmangiferin—inducedapoptosisinK562leukemiccellsmightbeinvolvedinup—regulating
thegeneexpressionofbaxandown—regulatingthemRNAexpressionofBCR/ABLproteinP210,bcl一2,
andsurvivin.
Keywords:mangiferin;K5621eukemiccells;apoptosis
近年研究表明,肿瘤的发生发展不仅是细胞增
殖失控的结果,也是由于细胞凋亡受阻所致[1]。因
此,诱导和加速肿瘤细胞凋亡已经成为目前治疗恶
性肿瘤的重要手段。已有许多报道,多种天然黄酮类
化合物具有诱导白血病细胞凋亡的作用[2川],黄华
艺等邙3研究发现从广西本地芒果树中提取的黄酮类
化合物芒果苷能诱导人肝癌细胞株BEL一7404细胞
凋亡。笔者的初步研究发现,芒果苷能显著抑制慢性
粒细胞白血病细胞系K562细胞增殖[7]和诱导
K562细胞凋亡[8],但芒果苷诱导白血病K562细胞
凋亡的具体机制尚不明确。为此,本实验采用RT—
PCR、免疫印迹等技术,进一步研究芒果苷抗白血病
增殖作用的机制,以探讨芒果苷在白血病中是否具
有潜在治疗价值。
1材料
RPMI一1640培养基及Trizol试剂购自美国
Gibco,小牛血清(Hyclone);逆转录酶MMLV、Taq
酶、dNTP、Oligo均购自Promega公司;蛋白预染分
子量标准(大连宝生物公司)、PVDF膜(美国Bio—
Rad公司)、BCR—N20(美国SantaCrous公司)、辣
牧稿日期:2006—08—19
作者简介:彭志刚(1966一),男,湖南祁东县人,医学博士,教授,硕士生导师,广西医科大学第一附属医院血液内科副主任,中华医学会
广西血液学会副主任委员兼秘书,主要从事血液肿瘤的临床和实验研究。
Tel:(0771)5350322E—mail:zgpeng@hotmail.com
万方数据
·716· 中草荡ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月
根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(北京中山生物技术
公司)、MonoclonalAmti—pActin(Sigma公司)、辣
根酶标记山羊抗大鼠IgG(H+L)(北京中山生物技
术公司)、显色液(EclA液+EclB液)(美国Pierce
公司)、FITC标记的抗IgGl(美国Pharmingen公
司);芒果苷由广西民族医院临床医学研究所中心实
验室黄华艺博士赠予,质量分数为99.5%,用2%
NaHC03配制10mmol/L,分装冻存。
2实验方法
2.1细胞培养:人慢性髓细胞白血病细胞株K562
细胞购自中国科学院上海细胞研究所细胞库,置于
含10%胎牛血清的RPMI一1640培养体系中,在
37℃、5%Co。的饱和湿度培养箱中培养。取对数生
长期细胞用于实验。细胞初始浓度为1×105/mL,
设空白对照组,实验组(25、50、100、150、200弘mol/
L芒果苷)分别作用K562细胞24、48、72、96h。
2。2 RT—PCR检测bcl一2、bax及survivinmRNA:
用TrizolRNA提取试剂盒提取总RNA,RNA定
量采用紫外分光光度计,取1btgRNA,加逆转录酶
MMLV200U,按随机六聚脱氧核苷酸引物合成法
合成cDNA。bcl一2、bax和survivin基因扩增的引物
及内参照p—actin引物均由大连宝生物公司合成,p—
actin和bcl一2引物序列设计参照文献方法[9],bax
和survivin引物设计分别参照文献方法[10’11],p
actin正义链:5-GTGGGGCGCCCCAGCACCA一
37,反义链:5r_CTCCTTAATGTCACGCACGA—
TTC一37,扩增产物长度为548bp;bcl一2正义链:5,_
CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC一37,反义
链:57一CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC一37,
扩增产物为318bp;bax正义链:57一TCCACCA—
AGAAGCTGAGCGAG一37,反义链:57一GTCCAGG—
CCCATGATGGTTCT一37,扩增产物为257bp;
survivin的引物[11|:正义链:5-TTGGCAGGT—
GCCTGTTGAAT一37,反义链:5一AGCCAGTCCC—
CCCACAGCAT一37,扩增产物为465bp。bcl一2扩增
为94℃预变性5min,94℃变性40S,72℃退火
40S,72℃延伸50S,扩增30个循环。bax扩增为
94℃预变性5min,94’℃变性40S,55℃退火50
S,70℃退火60S,扩增30个循环。survivin扩增为
94℃预变性5min,94℃变性40S,55℃退火50
S,72℃延伸60S,扩增30个循环。每份样本以p—
actin作为内参照。1.5%琼脂糖凝胶(含溴乙锭)
100V等压电泳观察结果,以目的基因与pactin吸
光度比值作为其相对表达量。
2.3 Westernblotting检测BCR/ABL融合蛋白
质P。。。水平:提取总蛋白,一80℃保存。用Lowry
法测定蛋白质的量,取30弘g待测蛋白质样品,加入
上样缓冲液,煮沸5min,立即置冰上;加样,及预染
Marker,行SDS—PAGE电染,恒流30mA×2~3
h。在转膜缓冲液中进行蛋白质的电转移至PVDF
膜,4℃恒流250mA×2h。靶蛋白与抗体反应:
PVDF膜用5%脱脂奶粉(TBST配制)封闭,4℃
过夜;TBST漂洗PVDF膜10min×3次,加入1:
1000稀释的第一抗体(BCR—N20),常温2h;PBS
漂洗PVDF膜10min×3次,加入1:2000稀释的
辣根过氧化物酶标记羊抗IgG(H+L),常温2h。以
p-actin作为内参照,操作方法同上。予ECL试剂盒
显色,曝光,Photoshop6.0软件半定量分析结果。
2.4统计学分析:各实验均重复3次以上,数据以
至±S表示,实验组与对照组间用独立样本t检验进
行显著性差异比较,多组间比较采用单因素方差分;
析。应用统计学软件SPSSl0.0进行统计分析处理。
3结果
3.1 K562细胞bax与bcl一2mRNA表达的比值
增高:经100p.mol/L芒果昔作用24~96h后,随作
用时间延长,K562细胞baxmRNA的相对表达量
(与内参照p-actin的比值)逐渐增加,呈显著的时
间依赖性,与同浓度点对照组相比,96h组的bax
mRNA明显上调(1.91士0.02VS 86土0.01,P<
0.01);经不同浓度芒果苷作用24h后,bcl一2
mRNA的表达则随浓度增加而略有下调,与未加药
对照组相比,100p.mol/L芒果苷作用组使细胞
bcl一2mRNA相对表达量下调(1.28±0.03口s
1.52±0.05,P<0.05)。另外,对不同浓度芒果苷作
用不同时间后K562细胞bax与bcl一2mRNA表达
的比值的检测显示,随作用浓度和时间的增加,该比
值逐渐增大,与空白对照组相比,100/-mol/L作用
96h和200弘mol/L作用24h组的bax/bcl一2值均
显著上调,分别为(2.89士0.057351.23土0.05,P<
0.01)和(1.86土0.02US1.23土O.05,P<0.05)。
结果见表1和2、图1和2。
3.2 K562细胞survivnmRNA的表达减弱:经
25~200pmol/L芒果苷作用24h后,K562细胞
survivinmRNA的表达水平即有降低,与未加药对
照组相比,200p.mol/L芒果苷作用24.h,细胞
survivinmRNA相对表达量明显减少(O.85±0.02
vS1.51±0.02,P<0.01)。经100/umol/L芒果苷作
用K562细胞24~96h组,随作用时间延长,K562
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月·717·
表1芒果苷(100t.1mol/L)作用K562细胞不同时间后
baxmRNA表达量和bax/bcl一2值(i士s,万一3)
Table1 Expressionofbaxandratioofbax/bcl-2ofK562
cellstreatedwithmangiferin(100t_Imol/L)
forvarioustimes(;土s,疗一3)
与对照组比较:。P
M—Marker1—6—0,25,50,100,150。200tumol/Lmangiferin
图1不同浓度芒果苷作用K562细胞24h后
baxmRNA的表达
Fig.1ExpressionofbaxmRNAofK562cells
treatedwithmangiferinfor24h
atvariouscOncentrations
表2不同浓度芒果苷作用K562细胞24h后bcl一2
mRNA表达量和bax/bcl一2值(z士S,甩一3)
Table2 Expressionofbcl--2mRNAandratioofbax/bcl--2
ofK562cellstreatedwithmangiferinfor24h
atvariousconcentrations(;士S,摊一3)
与对照组比较:+P
著的时间依赖性,与同浓度点对照组相比,96h组
survivinmRNA表达明显减弱(0.79±0.02口s
1.43土0.02,P<0.01)。表明,芒果苷可抑制K562
细胞survivinmRNA表达,且与药物作用浓度和时
间有关,见表3和4及图3。
M—Marker1~6-0、25、50、100、150、200vmol/L芒果苷
M—Marker1—6—0,25,50,100,150,200pmol/Lmangiferin
图2不同浓度芒果苷作用K562细胞24h后
bcl一2mRNA的表达
Fig.2Expressionofbcl一2mRNAofK562
cellstreatedwithmangiferinfor
24h盘variousconcentrations
表3不同浓度芒果管作用K562细胞24h后survivin
mRNA的表达(茹士S,弹一3)
Table3 ExpressionofsurvlvinmRNAofK562cells
treatedwithmangiferinfor24hatvarious
concentrations(;±s,露一3)
与对照组比较:’P
survivinmRNA的表达■@士S,弹一3)
Table4 ExpressionofsurvivinmRNAofK562cells
treatedwithmangiferin(100tamol/L)for
varioustimes(_is,拜一3)
与对照组比较:。P
P。。。水平降低:经25~200弘m01/L芒果苷作用72
h,K562细胞BCR/ABL融合蛋白质P。。。的表达水
平随药物浓度的增高呈进行下降趋势,P210的相对表
达水平(与内参照口-actin的比值)由对照组的
1.31土0.01降至200/监mol/L组的0.53±0.01
万方数据
·718· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月
(P
P。。。水平。见表5和6及图4和5。
M-Marker1~6-0、25.50、100、150、200肛mol/L芒果苷
M—Marker1—6—0、25、50、100、150、200,umol/Lmangiferin
图3不同浓度芒果苷作用K562细胞24h后
survivinmRNA的表达
Fig.3ExpressionofsurvivinmRNAofK562
cellstreatedwithmangiferinfor24h
atvariouscOncentrations
表5不同浓度芒果苷作用K562细胞72h后P:。。的
表达@士S,n一3)
Table5 ExpressionofP2loofK562cellstreated
withmangiferinfor72hatvarious
concentrations(;士s,心一3)
与对照组比较:’P
P2lo的表达o±s,n一3)
Table6 ExpressionofP210ofK562cellstreated
withmangiferin(100¨mol/L)for
varioustimes(i±s,n一3)
与对照组比较:’.P
4讨论
细胞凋亡的调控机制十分复杂,受到多个环节,
多个因素的影响,而bcl一2家族是目前最重视的调
控细胞凋亡的基因家族,分为两类:凋亡抑制基因和
I一对照组2~4—50、100、200弘mol/L芒果苷
1-controlg up2—4—50,100,200,umol/Lmangiferin
图4不同浓度芒果苷作用K562细胞72h后P 。。的表达
Fig.4ExpressionofP210ofK562cellstreatedwith
mangiferinfor72hatvariousconcentrations
1一对照组 2~4—24、48、72h组
1-controlg up2--4—24,48,72hgroup
图5芒果苷(100;amol/L)作用K562细胞不同时间后
P。的表达
Fig.5ExpressionofPnofK562cellstreatedwith
mangiferin(100tamol/L)forvarioustimes
凋亡诱导基因。bcl一2的过度表达可抑制射线、抗癌
药等诱导的细胞凋亡,是肿瘤细胞耐药的主要机制,
而bax过度表达可促进细胞凋亡。bax与bcl一2有
很高的同源性,两者可自行或相互形成同/异源二聚
体,在线粒体上形成膜通道,调节细胞凋亡。因此,通
过药物、单抗、反义寡核苷酸等手段上凋bax/bcl一2
值可诱导肿瘤细胞凋亡。本研究使用RT—PCR方法
检测发现,100,umol/L芒果苷作用K562细胞24~
96h后,baxmRNA表达随着作用时间的延长逐渐
升高,不同浓度芒果苷作用24h后,bcl一2mRNA
的表达则随浓度增加而略有下调,同时还发现芒果
苷能上调bax/bcl一2的值,并呈浓度及时间依赖性,
经相关性分析,bax/bcl一2值与细胞凋亡率呈明显正
相关。故推测,芒果苷诱导K562细胞凋亡可能与其
调节bax及bcl一2基因的表达,尤其上调bax基因
表达有关。
90%~95%的慢粒患者具有Ph染色体,其分
子基础是bcr/abl基因重组,其基因产物BCR/
ABL融合蛋白质P。,。对CML细胞增殖和凋亡的调
万方数据
中草芮ChineseTraditionalandHerbalDrugs第38卷第5期2007年5月·719·
控起重要作用。Deora等Dz3研究发现,黄酮类化合物
槲皮素、金雀异黄素能通过下调BCR/ABLP。。。表
达而诱导K562细胞凋亡和分化,IC5。分别9.2、
11.8mg/mL的槲皮素和金雀异黄素作用K562细
胞72h后,细胞凋亡率分别为68%和16%,其P。,。
水平也分别下降74%和77.8%。本课题组发现,芒
果苷能使bcr/abl基因的转录下调[8],同时还发现,
在体外芒果苷能以明显的剂量及时间依赖方式下调
K562细胞BCR/ABL蛋白质P。,。水平。且K562细
胞凋亡率与bcr/ablmRNA和P。。。相对表达量间呈
显著负相关。故推测,芒果苷可能通过抑制bcr/abl
mRNA和/或Pm的表达,最终促进了K562细胞凋
亡。笔者认为,从广西本地芒果树叶中提取的芒果苷
有可能拓宽应用范围,有望用于临床治疗bcr/abl
表达阳性的白血病。
Survivin是凋亡抑制蛋白(IAPs)家族中的新
成员,是迄今发现的最强的凋亡抑制因子。Survivin
已被视为肿瘤相关蛋白,参与肿瘤的发生、发展,并
与肿瘤的预后密切相关,因此,Survivin有可能作为
肿瘤治疗的新靶点。现已发现Survivin在正常分化
成熟组织中无表达,在常见的肿瘤如肺癌、胃癌、黑
色素瘤、结直肠癌等,以及人类造血系统恶性肿瘤白
血病细胞及其白血病细胞系如HL一60、K562等均
有Survivin表达[1引。Nakayama等口43研究发现,黄
酮类化合物槲皮素能抑制结肠癌细胞株survivin的
表达。本研究也表明,芒果苷能抑制白血病K562细
胞survivin基因的表达,不同浓度芒果苷作用不同
时间后,K562细胞survivin表达量呈时间及浓度
依赖性下调,并与芒果苷诱导的K562细胞凋亡程
度呈显著相关。故认为,芒果苷抑制survivin表达可
能是其诱导白血病细胞凋亡的另一种方式。
上述研究结果表明,芒果苷在体外诱导慢粒白
血病细胞系K562细胞凋亡的机制可能涉及多种凋
亡相关基因及蛋白,芒果苷不仅可上调bax/bcl一2
的值及Fas蛋白表达,下调survivin基因表达,还
能特异地下调bcr/ablmRNA表达和BCR/ABL
蛋白质P。。。水平。提示,芒果苷有望成为一种新型的
抗自血病药物,尤其在bcr/abl表达阳性白血病的
治疗中发挥作用。
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万方数据
芒果苷诱导白血病K562细胞凋亡机制的研究
作者: 彭志刚, 罗军, 赖永榕, 宋善俊, PENG Zhi-gang, LUO Jun, LAI Yong-rong,
SONG Shan-jun
作者单位: 彭志刚,罗军,赖永榕,PENG Zhi-gang,LUO Jun,LAI Yong-rong(广西医科大学第一附属医院
,血液科,广西,南宁,530021), 宋善俊,SONG Shan-jun(华中科技大学同济医学院附属协和
医院,血液科,湖北,武汉,430021)
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2007,38(5)
被引用次数: 4次
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2. 蒙根.王海龙.刘炳玉.王鸿丽.李卫华.王红霞.魏开华.张学敏.杨松成.岑坚.Meng Gen.Wang Hailong.Liu
Bingyu.Wang Hongli.Li Weihua.Wang Hongxia.Wei Kaihua.Zhang Xuemin.Yang Songcheng.Cen Jian 纳升电喷雾
毛细管液相色谱-串联质谱鉴定K562细胞株中混合蛋白质[期刊论文]-分析化学2005,33(11)
3. 邓家刚.冯旭.王勤.覃洁萍.叶勇 不同产地及不同品种芒果叶中芒果苷的含量对比研究[期刊论文]-中成药
2006,28(12)
4. 靳秋月 Survivin反义寡核苷酸诱导K562细胞凋亡的研究[学位论文]2006
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6. 王志萍.邓家刚.谭珍媛.WANG Zhi-ping.DENG Jia-gang.TAN Zhen-yuan 芒果苷片体外抑菌杀虫作用的实验研究
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7. 刘小玲 川楝素提取物的制备和抗肿瘤机理研究[学位论文]2009
8. 东方月花 苦参碱与红霉素联合在体外诱导k562细胞凋亡的初步研究[学位论文]2006
9. 李妍.王四旺.张海.谢艳华.王剑波.孙纪元.LI Yan.WANG Si-Wang.ZHANG Hai.XIE Yan-Hua.WANGJian-Bo.SUN
Ji-Yuan 中药安迪注射剂对白血病K562细胞株增殖和凋亡的影响[期刊论文]-第四军医大学学报2007,28(12)
10. 邓家刚.杨柯.阎莉.郭力城.唐慧勤 芒果苷对免疫抑制小鼠T淋巴细胞增殖的影响[期刊论文]-中药药理与临床
2007,23(5)
引证文献(4条)
1.杜正彩.邓家刚.李好文 芒果苷与顺铂联用对肝癌细胞HepG2增殖及PTK活性的影响[期刊论文]-广西中医药
2013(3)
2.王晓雪.彭志刚 黄酮类化合物诱导肿瘤细胞凋亡作用机制研究进展[期刊论文]-内科 2009(4)
3.任晓光.李东伟.何彩梅.李海燕 芒果苷药理活性研究进展[期刊论文]-中成药 2011(5)
4.WEI Zhi-quan.DENG Jia-gang.YAN Li Pharmacological Effects of Mangiferin[期刊论文]-中草药(英文版)
2011(4)
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