全 文 ：HPLC法同时测定红直獐牙菜中
3种有效成分的含量
吴　江 ,林鹏程 ,卢永昌 ,潘国庆 ,梁永欣
(青海民族学院 ,青海西宁　810007)
摘要:建立了反相高效液相色谱法(HPLC)同时测定红直獐牙菜中的獐牙菜苦苷 、龙胆苦苷 、芒
果苷含量的方法。在检测波长 254 nm 、柱温 30℃、流速 1 mL/min 时 , 用 ZORBAX SB-C18
(250mm×4.6mm i.d., 5μm)柱 ,以 MeOH 和 H2O(含 0.04%H3PO4)在 0 ～ 20 min 内由 20%至
35%线性梯度洗脱 。上述3种成分均达到基线分离 ,獐牙菜苦苷 、龙胆苦苷 、芒果苷的线性范
围分别为 0.0095 ～ 2.9μg(r=0.9999),0.0486 ～ 2.56μg(r=0.9999),0.0056 ～ 2.8μg(r=0.9999);
回收率为 97.7%(RSD=4.3%),99.5%(RSD=3.5%),103%(RSD=1.1%)。
关键词:反相高效液相色谱;红直獐牙菜;獐牙菜苦苷;龙胆苦苷;芒果苷
中图分类号:Q599　　文献标识码:A　　文章编号:1006-8996(2005)06-0066-04
Simultaneously determination of three effective components
in Swertia erythroticta Maxim by HPLC
WU Jiang ,LIN Peng-Cheng ,LU Yong-chang ,PAN Cuo-qing , LIANG Yong-xin
(Qinghai Nationalities University ,Xining 810007 ,China)
Abstract:To establish a quantitative method of simultaneously determination of swertiamarin , gentiopicro-
side and mangiferin in Swertia erythroticta Maxim by RP-HPLC.The samples were separated on the col-
umn of Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm i.d., 5μm)which were diluted with methanol and water
(0.04%phosphoric acid).The ratio of methanol and water increased from 20:80 to 35:65 in 20 min
with a detected wavelength of 254 nm;flow rate of 1 mL·min-1;column temperature of 30℃.Three com-
pounds were base -isolated.The linear ranges of swertiamarin , gentiopicroside and mangiferin were
0.0095～ 2.9 μg(r=0.9999),0.0486 ～ 2.56 μg(r=0.9999), 0.0056 ～ 2.8 μg(r=0.9999)respec-
tively;The average recoveries were 97.7%(RSD=4.3%), 99.5%(RSD=3.5%), 103%(RSD=
1.1%)respectively.
Key words:RP-HPLC;Swertia erythroticta Maxim;swertiamarin;gentiopicroside;mangiferin
青藏高原龙胆科(Gentianaceae)植物是藏医广泛使用的治疗肝 、胆疾病的药物[ 1] 。其主要化学成分
有獐牙菜苦苷 、龙胆苦苷 、芒果苷 、齐墩果酸 、当药黄素 、熊果酸等[ 2 , 3] 。现代药理学研究表明 ,獐牙菜苦
苷有提高皮肤机能 、促进毛发生长 、抑制中枢神经 、镇痛和抗炎等作用;龙胆苦苷有促进胃液分泌 、抗原
虫和抗炎作用;芒果苷有抑制中枢神经 、抗炎 、抗结核 、利胆等疗效[ 4] 。对龙胆科植物中獐牙菜苦苷 、芒
果苷 、龙胆苦苷的测定方法主要有薄层扫描和高效液相色谱法[ 5～ 7] ,但对上述3种成分同时测定的方法
未见报道。笔者利用 HPLC法同时测定了红直獐牙菜(Swertia erythroticta Maxim)中上述 3种成分的含
量 ,以达到快速 、准确测定的目的。
1　仪器 、试剂及样品采集
收稿日期:2005-03-17
作者简介:吴　江(1963—),男 ,浙江绍兴人 ,副教授。从事分析化学 、药物分析的教学科研工作。
第 23卷　第 6期
2005年 12月 　 　　　　　
青 海 大 学 学 报 (自 然 科 学 版)
Journal of Qinghai University(Nature Science)　 　　　　　
Vol.23 No.6
Dec.2005
DOI :10.13901/j.cnki.qhwxxbzk.2005.06.022
1.1　仪器　Agilent1100高效液相色谱仪 ,配置:手动进样器 、在线脱气机 、高压二元梯度泵 、恒温柱温
箱 、DAD检测器 、Agilent1100色谱工作站 、ZORBAXSB-C18(250mm×4.6mm i.d.,5μm)色谱柱 、KQ3200超声
波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);SZ-97自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。
1.2　试剂　甲醇:高效液相色谱专用试剂(山东禹王实业有限公司禹城化工厂);水:自制三重蒸馏水;
磷酸:AR级(北京红星化工厂)。
獐牙菜苦苷 、龙胆苦苷 、芒果苷对照品由青海普兰特藏药研究所孙洪发研究员提供(经归一化法测
定 ,纯度大于 98%)。
1.3　样品采集　红直獐牙菜 2003年 8月采于青海省互助北山林场 、祁连县 ,所有样品均由青海普兰特
藏药研究所孙洪发研究员鉴定 ,样品阴干后粉碎过 80目筛 ,冷藏保存 。
2　试验方法
2.1　溶液配制
2.1.1　对照品储备液　准确称取对照品獐牙菜苦苷 2.90 mg 、龙胆苦苷 2.45 mg 、芒果苷 2.40 mg ,分别
置1 mL容量瓶中 ,以甲醇溶解并定容 ,配制成相应浓度的对照品储备液 ,使用时稀释为所需浓度。
2.1.2　样品溶液　准确称取粉碎至 80目的红直獐牙菜样品 0.5 g ,加入甲醇 10 mL ,超声提取 0.5 h ,抽
滤 ,以甲醇洗涤滤渣 2次 ,每次 1 mL。滤渣重复上述操作 ,所得滤液与前一次滤液合并 ,浓缩后定容至
50 mL。过 0.45 μm滤膜 ,在选定色谱条件下测定有效成分的含量。
2.2　色谱条件
色普柱:ZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm ,5 μm)柱;流动相:甲醇和水(含 0.04%磷酸)的比例在
0 ～ 20 min内由 20∶80线性变化至 35∶65;流速 1 mL/min;检测波长为 254 nm;柱温 30℃。该色谱条件下
獐牙菜苦苷 、龙胆苦苷 、芒果苷等 3种成分均被洗脱且达到基线分离 ,保留时间分别为 14.0 、16.4 、19.4
min(见图 1)。
图 1　3种标准品(A)和红直獐牙菜甲醇提取物色谱图(B)
(1.獐牙菜苦苷　2.龙胆苦苷　3.芒果苷)
2.3　线性关系考察
精密量取 3 种对照品储备液 ,以甲醇配制 , 浓度分别为獐牙菜苦苷 0.580 mg/mL , 0.290 mg.mL ,
0.145 mg/mL , 0.058 mg/mL , 0.029 mg/mL;0.019 mg/mL;龙胆 苦苷 0.625 mg/mL , 0.245 mg/mL ,
0.122 mg/mL ,0.0245 mg/mL ,0.0122 mg/mL ,0.098 mg/mL;芒果苷 0.6 mg/mL ,0.24 mg/mL ,0.12 mg/mL ,
67第 6期　　　　　 吴　江等:HPLC法同时测定红直獐牙菜中 3种有效成分的含量 　　　　　　　　
0.024 mg/mL ,0.0048 mg/mL ,0.0012 mg/mL的对照品标液系列溶液 ,每次进样 5μL ,以峰面积的积分值
定量 。獐牙菜苦苷 、龙胆苦苷 、芒果苷的回归方程分别如下:
A=670.02X+23.04　r=0.9997;A=1028.17X+30.25　r=0.9998;A=3226.43X-6.98　r=0.9999
线性范围分别为 0.0095 ～ 2.9μg ,0.0486 ～ 2.56 μg ,0.0056 ～ 2.8μg 。
2.4　检测限
在选定的色谱条件下 ,当信噪比S/N=3时 ,对各组分最低检测限进行测定 ,结果獐牙菜苦苷 、龙胆
苦苷 、芒果苷的最低检测限分别为 0.50 ng , 0.62 ng ,0.48 ng 。
2.5　精密度试验
取浓度为 0.058 mg/mL 獐牙菜苦苷 、0.0245 mg/mL 龙胆苦苷 、0.024 mg/mL 芒果苷对照品溶液 ,在
选定的色谱条件下测定色谱峰的峰面积 ,经计算 RSD分别为 1.20%、0.92%、1.13%(n=5),表明仪器精
密度良好 。
2.6　重复性试验
准确称取红直獐牙菜样品 0.5 g ,共 6份 ,按“2.1.2”方法操作 ,在选定的色谱条件下测定獐牙菜苦
苷 、龙胆苦苷 、芒果苷的含量 ,经计算 RSD分别为 1.8%、1.7%、3.1%(n=5),表明该方法重复性良好 。
2.7　回收试验
准确称取 3 份已测知含量的红直獐牙菜样品各 0.05 g ,添加各对照品溶液适量(獐牙菜苦苷
0.19 mg/mL溶液 0.70 mL ,龙胆苦苷 0.245 mg/mL溶液 0.60 mL ,芒果苷 0.14 mg/mL 溶液 0.20 mL),按
“2.1.2”方法操作 ,测得獐牙菜苦苷 、龙胆苦苷 、芒果苷平均回收率(n=3)分别为 97.7%、99.5%、103%;
RSD分别为 4.3%、3.5%、1.1%。
3　结果与讨论
3.1　结果
取2.1.2制备的样品溶液按上述色谱条件进行分析 ,经 DAD检测器检测上述 3种待测组分的峰纯
度且其紫外光谱与对照品一致后 ,按外标法以峰面积积分值计算 ,得 3种有效成分的含量(每个样品重
复进样3次 ,取平均值置信区间 95%)。结果见表 1。
表 1　红直獐牙菜中 3种有效成分的含量 (%)
样品 獐牙菜苦苷 龙胆苦苷 芒果苷
红直獐牙菜
(互助北山草滩) 0.521±0.017 0.644±0.012 0.0668±0.0360
红直獐牙菜
(互助北山河边 0.462±0.023 0.536±0.018 0.102±0.031
红直獐牙菜
(祁连山坡) 0.648±0.024 0.544±0.032 0.0673±0.0221
红直獐牙菜
(祁连草滩) 0.484±0.034 0.389±0.041 0.0542±0.0241
3.2　讨论
3.2.1　检测波长的确定　上述对照品溶液分别进样后 ,利用DAD检测器在 200 ～ 400 nm扫描其吸收光
谱 ,各对照品均在 254 nm 波长处有较高的吸收 ,结合文献[ 7] ,选择该波长为检测波长。
3.2.2　提取方法的确定　准确称取红直獐牙菜样品 0.5 g ,共 8份 ,每 4份为一组 ,分别用甲醇超声(每
次30 min)和加热回流(每次 30 min)处理 ,测定不同提取次数下上述各有效成分的含量。结果表明 ,热
提取 3次以及超声提取 2次以后 ,继续增加提取次数对提取率无明显影响 ,但超声次数少 ,提取率比热
回流提取法略高 ,故本试验采用超声提取法。
3.2.3　流动相的选择　上述 3种有效成分色谱峰易拖尾 ,经试验 ,当在水中加入 0.04%(v/v)磷酸时可
68　　　　　　　　　　　　　　　　　　青海大学学报　　　　　　　　　　　　　　　　第 23卷
改善獐牙菜苦苷 、龙胆苦苷 、芒果苷的峰形 、故选择甲醇和含 0.04%磷酸的水做流动相。
3.2.4　红直獐牙菜中 3种有效成分含量的比较　由表 1可知 ,不同产地红直獐牙菜中有效成份含量不
同 ,獐牙菜苦苷和芒果苷以采集于祁连山坡者含量最高 ,龙胆苦苷以采集于互助北山草滩者含量最高。
总之 ,用HPLC法测定红直獐牙菜中 3种成份的含量 ,具有提取 、分析简便快速 ,结果准确可靠等特
点 ,对全面评价药物质量有积极的作用 。
参考文献:
[ 1] 杨永昌 ,何廷农 ,卢生莲 ,等.藏药志[ M] .西宁:青海人民出版社 , 1991.111.
[ 2] 纪兰菊 ,孙洪发 ,丁经业 ,等.青藏高原四种龙胆植物化学成分初步研究[ J] .高原生物学集刊 , 1992 ,(11):113.
[ 3] 李玉林 ,丁晨旭 ,刘健全 ,等.红直獐牙菜的苷类成分[ J] .中草药 , 2002 , 33(2):104.
[ 4] 孙文基 ,绳金房.天然活性成分简明手册[ M] .北京:中国医药科技出版社 ,1998.256-539.
[ 5] 宫川辰治 ,大岛俊幸 ,平山 良,等.龙胆科 2种苦苷的含量测定[ J] .药物分析杂志 , 1997, 17(4):241.
[ 6] 胡凤祖 ,宋娅莉 ,刘　梅 ,等.青藏高原龙胆科植物药用有效成分的高效液相色谱分析[ J] .色谱 , 2003 ,23(1):63.
[ 7] 高光跃 ,李　鸣 ,冯毓秀 ,等.11种獐牙菜及近缘植物中有效成分的高效液相色谱测定[ J] .药学学报 , 1994 ,29(12):910.
(责任编辑　陈　军)
(上接第 49页)
[ 7] 　a laboratory strain K-12[ J] .DNA Res , 2001, 8:11-22.
[ 7] Wick L M ,Qi W , Lacher D W.Evolution of genomic content in the stepwise emergence of Escherichia coli O157:H7[ J] .J Bacteriol , 2005 , 187(5):
1783-1791.
[ 8] Vernozy Rozand C , Montet M P , Bertin Y , et al.Serotyping , stx2 subtyping , and characterization of the locus of enterocyte effacement island of shiga
toxin-producing Escherichia coli and E.coli O157:H7 strains isolated from the environment in France[ J].Appl EnvironMicrobiol ,2004 , 70(4):
2556-2559.
[ 9] Schmidt H , Beutin L , Karch H.Molecular analysis of plasmid encoded hemolysis of Escherichia coli st rain EDL933[ J] .Infect Immun , 1995 , 63(3):
1055-1061.
[ 10] McKee M L , 0 Brien A D.Truhcated enterohemorrhagic Escherichia coli(EHEC)O157:H7 intimin(EaeA)fusion proteins promote adherence of E-
HEC strains to HEp-2 cells[ J] .Infect Immun , 1996 , 64(6):2225-2233.
[ 11] Schmidt H ,Kernbach C , Karch H.Analysi s of the EHEC hly operon and its location in the physical map of the large plasmid of enterohaemorrhagic
Escherichia coli O157:H7[ J] .Micro biology , 1996 , 142:907-914.
[ 12] Makino K , Ishii K , Yasunaga T , et al.Complete nucleotide sequences of 93-kb and 3.3-kb plasmids of an enterohemorrhagic Escherichia coli
O157:H7 derived from sakai outbreak[ J].DNA Research , 1998 ,5:1-9.
[ 13] Burland V ,Shao Y , Perna N T , et al.The complete DNA sequence and analysis of the large virulence plasmid of Escherichia coli O157:H7[ J] .Nucleic
Acids Research , 1999 , 26(18):4196-4204.
[ 14] Schmidt H , Geitz C , Tarr P I , et al.Non-O157:H7 pathogenic shiga toxin-producing Escherichia coli:phenotypic and genetic prof iling of virulence
traits and evidence for clonality[ J].JID , 1999 , 179(1):115-123.
[ 15] Chizhikov V , Rasooly A , Chumakov K , et al.Microarray analysis of microbial virulence factors[ J] .Appl Environ Microbiol , 2001 , 61(7):3258-
3263.
(责任编辑　唐宏伟)
69第 6期　　　　　 吴　江等:HPLC法同时测定红直獐牙菜中 3种有效成分的含量