全 文 ：番石榴叶中提取的槲皮素和 2Α-羟基熊果酸体外抗人轮状病毒作用
张文举1, 陈宝田1Ξ , 朱全红1, 陈国宝1, 魏练波1, 熊　波2
(11 南方医科大学南方医院 中医科, 广东 广州　510515; 21 中山大学 化学系, 广东 广州　510515)
摘　要: 目的　研究番石榴叶中提取的槲皮素和 2Α2羟基熊果酸体外抗人轮状病毒 (HRV ) 的作用。方法　溶剂法
分离化学成分, 波谱法鉴定其结构; 观察细胞病理变化, 采用半数组织培养感染 (TC ID 50) 微量法、电镜法观察槲皮
素和 2Α2羟基熊果酸体外对 HRV 的治疗及预防作用。结果　从番石榴叶中分离得到的槲皮素和 2Α2羟基熊果酸在
125 ΛgömL 剂量下具有较好的体外抗 HRV 作用。结论　番石榴叶较好的抗 HRV 作用源于槲皮素和 2Α2羟基熊果
酸等有效成分。
关键词: 番石榴叶; 槲皮素; 2Α2羟基熊果酸; 人轮状病毒 (HRV )
中图分类号: R 286187　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2005) 01 0076 04
In vitro an tirotav ira l effects of quercetin and 2 Α -hydroxyursol ic ac id
extracted from P s id ium guaj ava leaves
ZHAN G W en2ju1, CH EN Bao2t ian1, ZHU Q uan2hong1, CH EN Guo2bao 1, W E I L ian2bo 1, X ION G Bo 2
(11D epartm ent of T radit ional Ch inese M edicine, N anfang Ho sp ita l, F irst M ilitary M edical U niversity, Guangzhou 510515,
Ch ina; 2. D epartm ent of Chem istry, Sun Yat2sen U niversity, Guangzhou 510515, Ch ina)
Abstract: Objective　To study in v itro an t iro tavira l effects of quercet in and 2Α2hydroxyu rso lic acid
ex tracted from P sid ium g uajava leaves. M ethods 　Chem ical componen ts of P. g uajava leaves w ere
separa ted by chem ical so lven t and iden t if ied by spectrum. T he an t iro tavira l effects of quercet in and 2Α2
hydroxyu rso lic acid w ere studied in v itro by the m ethod of cytopath ic effect (CPE ) , t race m edian t issue
cu ltu re infect ive do se ( t race TC ID 50) , and tran sm ission electron m icro scope (T EM ). Results　Q uercet in
and 2Α2hydroxyu rso lic acid ob ta ined from P. g uajava leaves had stronger an t ivira l act ivity to hum an
ro taviru s (HRV ) in v itro. Conclusion　T he stronger an t ivira l act ivity of P. g uajava leaves to HRV are
due to quercet in and 2Α2hydroxyu rso lic acid.
Key words: P sid ium g uajava L. leaves; quercet in; 2Α2hydroxyu rso lic acid; hum an ro taviru s (HRV )
　　番石榴叶为桃金娘科植物番石榴 P sid ium
g uajava L. 的干燥叶, 具有涩肠止泻的作用。本院
于 1985 年开始用番石榴叶治疗感染性腹泻[1 ] , 并在
体外实验中发现番石榴叶对人轮状病毒 (HRV ) 有
较好的抑制效果, 具有抑杀 HRV、缩短腹泻病程、
促使 HRV 抗原阴转的作用[2 ]。但是, 番石榴叶化学
成分复杂, 具体的有效成分还不明确, 本研究从番石
榴叶中分离得到槲皮素和 2Α2羟基熊果酸, 研究其
体外抗 HRV 作用。
1　材料
111　药品与试剂: 番石榴叶采自第一军医大学药
圃, 经第一军医大学中药鉴定中心鉴定为番石榴 P.
g uajava L. 的叶。病毒唑 (广东江门制药厂生产, 规
格: 100 m gömL , 每支 1 mL , 批号 021032) , 乙酰基 胰酶、R PM I21640 培养基 (Sigm a 公司) ; 人轮状病毒 (HRV ) D S21 株、恒河猴胚肾细胞 (M A 2104 细胞)、轮状病毒 EL ISA 检测试剂盒 (A 群) 购自珠江医院生物高科技中心。石油醚 (Ê , 60～ 90 ℃)、95%乙醇、乙醚、丙酮, 均为A R (广州化学试剂厂) , 槲皮素标准品 (美国 Sigm a 公司)。112 　仪器: N ico let 5DX 红外光谱仪, 波段为4 000～ 400 cm - 1 (KB r 压片) ; 1H 2NM R、13C2NM R核磁仪, V arian 公司; XT 4 显微熔点仪, 德国PHN R 公司; R 2201 旋转蒸发仪, 上海申科机械研究所; 恒温培养箱; 超净工作台。2　方法211　槲皮素的分离与鉴定: 番石榴干叶 211 kg, 粉碎, 用石油醚渗漉脱脂 (3 次×10 L ) , 挥去石油醚,
·67· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 36 卷第 1 期 2005 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2004204216
基金项目: 国家自然科学基金资助课题 (N o. 39970912) ; 广东省中医药管理局资助课题 (N o. 970241)
作者简介: 张文举 (1972—) , 男, 湖北天门人, 主治医师, 博士, 研究方向为番石榴叶治疗轮状病毒性肠炎的机制研究。
E2m ail: zhangw j91@ho tm ail. com3 通讯作者　T el: (020) 61641676
然后用冷乙醇 (4 次×3 L ) 渗漉, 乙醇液减压浓缩
至 017 L , 加 015 L 热水, 有深绿色沉淀物析出, 滤
过。滤饼用热水洗涤数次, 合并滤液和洗液, 减压浓
缩, 干燥后得到棕色胶状物 50 g。胶状物用 200 mL
水溶解, 滤过除去不溶性杂质, 用乙醚反复提取, 醚
层减压浓缩后, 得到黄色胶状物, 用 70% 乙醇反复
重结晶, 得到黄色粉末化合物A 370 m g。经溶点测
定、盐酸2镁粉反应、IR、1H 2NM R、13C2NM R 鉴定及
斑点显色, 证实该化合物为槲皮素。
212　2Α2羟基熊果酸的分离与鉴定: 番石榴干叶经
石油醚脱脂后, 95% 乙醇回流提取 (3 次×10 L ) ,
每次 10 h, 合并乙醇提取液, 浓缩得黑色黏稠状物
500 mL。将其烘干, 碾碎, 置索式提取器中, 用乙醚
回流提取 9 h。蒸去乙醚, 得黑色膏状物 50 mL , 用
丙酮 100 mL 洗涤, 得灰白色固体。用乙醇反复重结
晶 (活性炭脱色) , 得少量白色晶体 0195 g。以正己
烷2醋酸乙酯2氯仿为展开剂, 10% H 2SO 4乙酸溶液
为显色剂, 薄层色谱, 发现有 2 个斑点, 经硅胶柱色
谱, 以石油2醋酸乙酯梯度洗脱, 得到白色晶体化合
物B 242 m g。经熔点测定、IR、1H 2NM R , 13C2NM R
等鉴定, 证实化合物B 为 2Α2羟基熊果酸。
213　M A 2104 细胞传代与病毒制备:M A 2104 细胞
以 R PM I21640 为培养基, 37 ℃、5% CO 2孵箱中培
养, 2 d 后换液, 2 d 后单层传代, 96 孔培养板每孔
50 ΛL 于 37 ℃、5% CO 2孵箱中培养成单层待用。人
轮状病毒 D S21 株解冻, 用乙酰基胰酶预处理病毒
悬液 30 m in, 将 1 mL 病毒悬液接种于 50 mL 细胞
培养瓶中已长成单层的M A 2104 细胞上, 再加入
R PM I21640 培养液 5 mL , 37 ℃、5% CO 2培养箱中
培养, 每天观察细胞病变, 3 d 后收获病毒。将收获
的 HRV 悬液用 40% 蔗糖溶液以 30 000 röm in 离
心 3 h, 得浓缩的 HRV 悬液, 分装后置 - 20 ℃ 冰
箱保存。
214　组织培养半数感染量 (TC ID 50) 测定: 取新鲜
HRV 悬液, 以 10 倍递次稀释成 10- 1、10- 2、10- 3、
10- 4、10- 5 5 个不同的稀释度, 分别接种经 H ank s
液洗 2 次的 96 孔微量板中已长成单层的M A 2104
细胞, 每孔接种 50 ΛL , 每个稀释度接种 4 孔, 37
℃、5% CO 2孵箱中吸附 1 h, 用 H ank s 液洗涤 2 次,
加入 011 mL 维持液, 37 ℃、5% CO 2孵箱中培养 3
d, 每天在倒置显微镜下观察细胞病变, 3 d 后判断
结果。
215　药物对M A 2104 细胞毒性试验: 将槲皮素 (10
m gömL )、2Α2羟基熊果酸 (10 m gömL )、病毒唑 (10
m gömL ) 用维持液稀释至 1∶10、1∶20、1∶40、
1∶80、1∶160、1∶320 等不同稀释度, 加入培养 24
h 的M A 2104 细胞单层管中, 每管各 011 mL , 维持
液 019 mL , 每个浓度各 4 管, 并设正常细胞对照 5
管, 置 33～ 37 ℃ 孵育, 每天观察细胞病理变化
(CPE) , 连续 5 d。以下出现 CPE 的最大浓度为最大
非毒性浓度。
216　槲皮素、2Α2羟基熊果酸和病毒唑抑制病毒浓
度测定: 将培养 24 h 的M A 2104 细胞管弃掉培养
液, 加 019 mL 维持液, 加 100 TC ID 50 HRV 悬液
011 mL , 33～ 37 ℃ 孵育 1 h 后, 弃去液体, 加维持
液 019 mL , 再分别加入 011 mL 1∶40、1∶80、
1∶160、1∶320 等 4 个浓度的槲皮素、2Α2羟基熊果
酸和病毒唑, 每个浓度 2 管, 33～ 37 ℃ 孵育。同时设
正常细胞、药物和 HRV 对照组。结果判断: 每天观
察M A 2104 细胞的病理变化, 连续 5 d。以正常细胞
对照组和药物对照组细胞无病变, HRV 对照组细
胞病理变化达+ + + 时, 实验组无CPE 为药的完全
抑制 HRV 剂量。
217　药物对 HRV 感染M A 2104 细胞的治疗作用:
取 96 孔M A 2104 细胞培养板, 吸去培养液, 加 100
TC ID 50 HRV 悬液 50 ΛL 于细胞孔, 37 ℃、5% CO 2
孵箱中吸附 1 h, 分别加入槲皮素 (01125 göL )、2Α2
羟基熊果酸 (01125 göL )、病毒唑 (01125 göL ) , 每
组 8 孔, 每孔 100 ΛL , 同时设 HRV 对照组和正常
细胞对照组 (每孔加入维持液 100 ΛL ) , 培养箱中
培养 3 d, 每天在倒置显微镜下观察细胞病变, 3 d
后 EL ISA 法检测培养上清液中 HRV 含量。结果:
肉眼观察, 根据显蓝色强弱判定阳性 (+ ～ + + + ) ,
不显色判为阴性 (- )。
218　药物对 HRV 感染M A 2104 细胞的预防作用:
取 96 孔 M A 2104 细胞培养板, 分别加入槲皮素
(01125 göL )、2Α2羟基熊果酸 (01125 göL )、病毒唑
( 01125 göL ) , 每孔 100 ΛL , 每组 10 孔, 37 ℃、5%
CO 2孵箱中吸附 1 h, 加 100 TC ID 50 HRV 悬液 50ΛL 于细胞孔, 加入培养液, 37 ℃、5% CO 2孵箱中培
养, 3 d 后 EL ISA 法检测培养上清液中HRV 含量。
219　直接电镜法观察: 将槲皮素、2Α2羟基熊果酸和
病 毒 唑 用 R PM I21640 配 置 成 01125、1125、
1215 göL , 各取 5 ΛL 与浓缩的 HRV 悬液 5 ΛL 混
合, 同时设病毒对照组, 37 ℃ 作用 5 m in 后, 每组各
取两份标本, 直接滴在具有 Fo rm var 支持膜的 100
目铜网上, 1～ 2 m in 后用滤纸吸走铜网上的液体,
用 pH 7. 4 的 20 göL 磷钨酸负染 1 m in, 用滤纸吸
·77·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 36 卷第 1 期 2005 年 1 月
去多余染液, 干燥后用透射电镜观察, 每份标本观察
1～ 2 个铜网。
2110　统计方法: 用 SPSS1010 进行数据分析, 多样
本间两两比较用秩和检验。
3　结果
311　TC ID 50测定结果, 发现 10- 3稀释度病毒组 2
孔细胞出现病变 (50% ) , 10- 2稀释度病毒组 3 孔细
胞出现病变 (75% ) , 10- 1稀释度病毒组 1 孔细胞出
现病变 (25% )。求得 TC ID 50为 315。
312　药物对M A 2104 细胞毒性试验: 结果见表 1
(“- ”表示细胞没有发生病理变化,“+ ”表示细胞发
生病变的百分数不超过 25% , + + 表示细胞发生病
变的百分数不超过 50% )。槲皮素为 500 ΛgömL
(稀释度为 1∶20) 时, 2Α2羟基熊果酸、病毒唑为
1 000 ΛgömL (稀释度为 1∶10)时,M A 2104 细胞出
现轻微的细胞病变, 因此 2Α2羟基槲皮素对M A 2104
细胞最大非毒性浓度为 250 ΛgömL (稀释度为
1∶40) , 而 2Α2羟基熊果酸、病毒唑对M A 2104 细胞
最大非毒性浓度为 500 ΛgömL (稀释度为 1∶20)。
表 1　槲皮素、2Α-羟基熊果酸、病毒唑对
M A-104 细胞最大非毒性浓度
Table 1　M ax imum noncytotox ic ity concen tration
of quercetin, 2Α-hydroxyursol ic ac id,
and R ibav ir in to M A-104 cells
组　别
M A 2104 细胞病理变化
1∶10 1∶20 1∶40 1∶80 1∶160 1∶320
槲皮素 + + + - - - -
2Α2羟基熊果酸 + - - - - -
病毒唑 + - - - - -
313　槲皮素、2Α2羟基熊果酸和病毒唑抑制 HRV
浓度测定: 结果表明 125 ΛgömL (1∶80) 槲皮素和
2Α2羟基熊果酸可完全抑制 HRV 在M A 2104 细胞
上的 CPE, 6215 ΛgömL (1∶160) 病毒唑即可完全
抑制 HRV 在M A 2104 细胞上的 CPE, 说明在体外
小剂量的槲皮素、2Α2羟基熊果酸和病毒唑有很强的
抗 HRV 作用。
314　药物对 HRV 感染M A 2104 细胞的治疗作用:
见表 2。槲皮素组、2Α2羟基熊果酸组、病毒唑组细胞
生长较好, 上清液 EL ISA 检测结果明显优于 HRV
对照组 (P < 0101)。槲皮素组、2Α2羟基熊果酸组与
病毒唑组相比, 差异无显著性 (P > 0105)。
315　药物对 HRV 感染M A 2104 细胞的预防作用:
结果见表 3。槲皮素组、2Α2羟基熊果酸组、病毒唑组
细胞生长较好, 上清液 EL ISA 检测结果明显优于
HRV 对照组 (P < 0101)。槲皮素组、2Α2羟基熊果酸
表 2　EL ISA 法检测治疗试验中培养
上清液中的病毒 (n= 10)
Table 2　V ira l con ten t in cultured supernatan t detected
by EL ISA in treatmen t test (n= 10)
组　别
剂　量ö(g·L - 1) EL ISA 检测结果- + + + + + + + + + +
槲皮素 01125 3 3 3 1 03 3
2Α2羟基熊果酸 01125 3 2 5 0 03 3
病毒唑 01125 3 2 5 0 03 3
HRV 对照 - 0 0 1 6 3
正常细胞 - 10 0 0 0 03 3
　　与 HRV 对照组比较: 3 3 P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs HRV contro l group
表 3　EL ISA 法检测预防试验中培养
上清液中的病毒 (n= 10)
Table 3　V ira l con ten t in cultured supernatan t detected
by EL ISA in preven tive test (n= 10)
组　别
剂　量ö(g·L - 1) EL ISA 检测结果- + + + + + + + + + +
槲皮素 01125 2 3 3 2 03 3
2Α2羟基熊果酸 01125 2 2 5 1 03 3
病毒唑 01125 0 2 5 3 03 3
HRV 对照 - 0 0 0 8 2
正常细胞 - 10 0 0 0 03 3
　　与 HRV 对照组比较: 3 3 P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs HRV contro l group
组与病毒唑组相比, 差异无差异性 (P > 0105)。
316　直接电镜法观察结果: 病毒在电镜下呈圆球
形, 为双凹面对称体, 病毒颗粒有两层壳体, 内层壳
体呈放射状排列, 状似车轮辐条, 外绕的外层壳体,
状似轮缘, 其颗粒完整, 结构清晰。当药物为高浓度
时, 可见病毒颗粒形态被破坏, 外壳完全溶解、碎裂,
绝大部分内核溶解、碎裂。当药物为中浓度时, 仅见
小部分实心颗粒, 形态完整, 结构清晰, 大部分病毒
出现空心颗粒, 极少部分病毒外壳溶解、碎裂。当药
物为低浓度时, 绝大部分病毒呈实心颗粒, 形态完
整, 结构清晰, 极少部分病毒出现空心颗粒, 结构欠
清晰。
4　讨论
　　HRV 是引起急性感染性腹泻的主要病原体,
由于疫苗的预防作用和口服补盐液治疗的推广, 全
球每年死于 HRV 感染的患者从 1986 年的 100 万
降到现在的 45 万, 但其仍然严重威胁着人类的健
康[3 ]。在长期的临床实践中, 发现番石榴叶对 HRV
性腹泻疗效好, 优于其他中草药。
在本实验中, 从番石榴叶中分离并鉴定了槲皮
素和 2Α2羟基熊果酸。槲皮素能够拮抗钙离子通
道[4 ] , 减少钙离子进入细胞内, 从而使细胞内钙离子
·87· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 36 卷第 1 期 2005 年 1 月
浓度降低, 使肠道蠕动减慢, 延长水、电解质、营养物
质在肠道内停留时间, 促进其吸收, 减少腹泻次数和
粪便量。而且, 病毒与受体复合物进入细胞必须有钙
离子的辅助作用, 由于槲皮素拮抗钙离子通道, 使病
毒受体复合物不能进入细胞, 中断了其生活周期, 从
而引起病毒死亡, 这也是槲皮素在体外能够较好地
抑制 HRV 的机制。熊果酸能够刺激 IFN 2Χ的分
泌[5 ] , 增强机体的免疫功能, 提高机体抵抗病毒的能
力, 但其在体外以何种机制发挥抗病毒作用, 还有待
于进一步研究。槲皮素和 2Α2羟基熊果酸在体外显
示了较强的抗 HRV 作用, 但其在体内是否有较强
的抗病毒作用, 由于其代谢过程不明, 有待于进一步
研究。
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species [J ]1 P lan ta M ed , 2003, 69 (7) : 60026041
龙葵碱对 H22荷瘤小鼠肿瘤细胞膜唾液酸和封闭度的影响
季宇彬, 王胜惠, 高世勇, 邹　翔, 汲晨峰Ξ
(哈尔滨商业大学药物研究所 博士后科研工作站, 黑龙江 哈尔滨　150076)
摘　要: 目的　研究龙葵碱对 H 22荷瘤小鼠肿瘤细胞膜唾液酸 (SA ) 水平和封闭度的影响。方法　建立 H 22荷瘤小
鼠模型, 荷瘤小鼠分别 sc 生理盐水、环磷酰胺、龙葵碱 (91375、18175、3715 m gökg)。采用比色法测定 H 22小鼠肿瘤
细胞膜 SA 水平和封闭度。结果　龙葵碱可剂量依赖性地降低荷瘤小鼠肿瘤细胞膜 SA 水平和肿瘤细胞膜封闭度。
结论　龙葵碱通过降低 H 22荷瘤小鼠肿瘤细胞膜 SA 水平和肿瘤细胞膜封闭度起抗肿瘤作用。
关键词: 龙葵碱; H 22荷瘤小鼠; 膜封闭度; 唾液酸
中图分类号: R 286191　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2005) 01 0079 03
Effect of Solanum n ig rum tota l a lka lo id on sia l ic ac id and block ing degree
of tum or cell m em brane in H22 tum or-bear ing m ice
J I Yu2b in, W AN G Sheng2hu i, GAO Sh i2yong, ZOU X iang, J I Chen2feng
(Po stdocto ral P rogramm e, Inst itu te of M ateria M edica, H arb in U niversity of Comm erce, H arb in 150076, Ch ina)
Abstract: Objective　To study the effects of to ta l a lkalo id from S olanum n ig rum (TA SN ) on sia lic
acid (SA ) and b lock ing degree of tumo r cell m em b rane in H 22 tumo r2bearing m ice. M ethods　 H 22 tumo r2
bearing m ice model w as estab lished and H 22 tumo r2bearing m ice w ere given N S, Cytoxan (CTX ) , and
TA SN (9. 375, 18. 75, and 37. 5 m gökg) by sc, respect ively. SA con ten t and b lock ing degree of tumo r cell
m em b rane in H 22 m ice w ere determ ined by ch rom atom etry. Results　TA SN cou ld decrease the SA con ten t
and the b lock ing degree of tumo r cell m em b rane in H 22 tumo r2bearing m ice in a do se2dependen t m anner.
Conclusion　TA SN show s the an t itumo r act ivity th rough decreasing the SA con ten t and b lock ing degree of
tumo r cell m em b rane in H 22 tumo r2bearing m ice.
Key words: to ta l a lkalo id of S olanum n ig rum L. (TA SN ) ; H 22 tumo r2bearing m ice; b lock ing degree
of m em b rane; sia lic acid (SA )
　　龙葵 S olanum n ig rum L. 为茄科一年生草本植
物, 分布于全国各地, 其主要成分为生物碱。民间使用
龙葵治疗肿瘤效果良好。前期抗肿瘤实验结果表明龙
葵碱能够明显延长 H 22荷瘤小鼠的生存时间。本实验
·97·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 36 卷第 1 期 2005 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2004205202
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30400591) ; 黑龙江省自然科学基金资助项目 (D 2004213) ; 哈尔滨市青年科学基金资助项目
(2004A FQ XJ035)。
作者简介: 季宇彬 (1956—) , 男, 博士, 教授, 博士生导师, 多年来一直致力于中药药理、肿瘤药理及分子药理学研究。