全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月·545·
药理与临床
半边旗二萜类化合物5F对人高转移卵巢癌细胞系Ho一8910PMNF—KB
(P65)、Smad3蛋白和NF—KB(P65)、ETS一1mRNA表达的影响
何太平1，陈 杰1，莫丽儿2，梁念慈p
(1．广东医学院生物化学与分子生物学研究所，广东湛江524023；
2．广东天然药物研究与开发重点实验室，广东湛江524023)
摘 要：目的 研究半边旗二萜类化合物5F(1la一羟基一15一氧一16一烯一对映贝克杉烷一19酸)对人高转移卵巢癌细胞
系HO一8910PM细胞内核转录因子KBP65亚基ENF—KB(P65)J、Smad3蛋白及NF—KB(P65)、ETS一1mRNA表达
的影响，探讨其抗肿瘤的作用机制。方法MTT法检测5F对H0—8910PM细胞增殖的影响；Westernblot分析
NF-KB(P65)及Smad3蛋白的表达；RT—PCR分析NF—KB(P65)及ETS一1mRNA的表达。结果5F能抑制H0—
8910PM细胞的增殖，抑制率随剂量的增加而增加，具有剂量依赖性；25～100ttmol／L5F作用HO一8910PM细胞
24h后，NF—KB(P65)、Smad3蛋白表达水平明显下降，并呈剂量效应关系；5F明显下调NF—xB(P65)mRNA的表
达，轻微下调ETS一1mRNA的表达。结论5F抗肿瘤活性与NF—KB(P65)、Smad3蛋白和NF—KB(P65)、ETS一1
mRNA的表达有关。
关键词：半边旗；二萜类化合物；基因表达；卵巢癌
中图分类号：R979．1；R286．91文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)04—0545一04
Effeetofaditerpenoid5FfromP细一Ssemipinnatao expressionofNF—KB(P65)，
Smad3proteinandNF—KB(P65)，ETS一1mRNAinhighlymetastatic
ovarianc rcinomaH0—8910PMcells
HETai—pin91，CHENJiel，MOLi—er2，LlANGNian—cil
(1．InstituteofBiochemistryandMolecularBiology，GuangdongMedicalC lege，Zhanjiang524023，China；
2．GuangdongKeyLaboratoryforResearchandDevelopmentofNaturalDrugs，Zhanjiang524023，China)
Abstract：ObjectiveTostudytheffectofaditerpenoid5F(ent—lla—hydroxy一15一OXO—kaur一16一an一19一
oicacid)isoiatedfromPteHssemipinnatao thexpressionsofNF—KB(P65)，Smad3proteinandNF—KB
(P65)，ETS一1mRNA，andtoinvestigatethentitumormechanismsof5F．MethodsMTTassaywas
usedtoexaminetheffectof5FonproliferationofHO一8910PMcells．TheexpressionslevelsofNF—IcB
(P65)andSmad3proteinswereassessedbyWesternblotanalysis．RT—PCRassaywasusedtoassessthe
expressionlevelsofNF—KB(P65)andETS一1mRNA．ResultsTheproliferationofHO一8910PMcellscan
beinhibitedby5Finadose—dependentmanner．Theexpr ssionlevelsofNF—xB(P65)andSmad3proteins
decreasedobviouslyinHO一8910PMcellsaftert eatmentwith25—100gmol／L5Ffor24h。andtheffects
appearedina ose—dependentmanner．5Fdown—regulatedsignificantlythexpressionofNF-KB(P65)
mRNA．down—regulatedgentlythexpressionofETS一1mRNA．ConclusionTheantitumoractivityof
5FisinvolvedinthexpressionofNF—KB(P65)，Smad3proteinndNF—KB(P65)，ETS一1mRNA．
Keywords：Pteriss m pinnataL．；diterpenoid；geneexpression；ovariancarcinoma
半边旗PteHssemipinnataL．又名半边莲、半
边菊，属凤尾蕨科植物，广泛分布于我国南方各省，
民间常用于清热解毒、利水消肿、治疗疳积、风湿痛
等。半边旗有效成分5F(1la一羟基一15一氧一16一烯一对
映贝克杉烷一19酸，简称5F)是从半边旗中提取的
一种二萜类化合物，分子式为C。。H。。O。，相对分子质
量为332．4。具有明显的抗肿瘤活性，能抑制RB磷
酸化，增强K562细胞丝裂原活化蛋白激酶(mito一
收稿日期：2004—07—19
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870900)；湛江市988兴湛计划项目(ZKol04)
作者简介：何太平(1970一)，男，湖南省祁东县人，主管检验技师，硕士，研究方向为生化药理学。
E—mail：taipinghe@fcl8．com；taipinghe@163．corn
*通讯作者Tel：(0759)2388501E—mail：ncliang@gdmc．edu．ca
万方数据
·546· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月
genactivatedproteink nase，MAPK)的活性及表
达[1]，并影响K562细胞中bcl一2、bax、c—jun、c—los
癌基因的表达[z]。本实验分别采用蛋白印迹、RT—
PCR方法研究5F对核转录因子一KBP65亚基(nu—
clearfactor—kappaBP65subunit)、Smad3,蛋白表达
以及NF—KB(P65)、ETS一1mRNA表达的影响，探
讨5F抗高转移卵巢癌细胞HO一8910PM侵袭转移
的作用机制。
1材料与方法
1．1 细胞及其培养：人高转移卵巢癌细胞系Ho一
8910PM，购自中国科学院上海细胞生物学研究所，
由浙江省肿瘤研究所许沈华等[3]建立。细胞在含
10％小牛血清、100U／mL青霉素和100肛g／mL链
霉素的RPMI一1640完全培养基中，37℃、5％C0。
饱和湿度孵箱培养。细胞经过消化传代，取对数生长
期的细胞进行培养。
1．2药品与试剂：半边旗二萜类化合物5F由广东
医学院天然药物开发中心提供，纯度为98％，实验
前5F用DMSO溶解，培养液稀释，DMSo终体积
分数为0．1％(实验证明该体积分数对细胞无影
响)。超级小牛血清购自杭州四季青公司；RPMI一
1640培养基购自Gibco公司；4×上样缓冲液(125
mmol／LTris—HCl，pH6．8，4％SDS，10％p巯基
乙醇，20％甘油，0．04A溴酚蓝)；NF—KB(P65)小
鼠IgG单抗、Smad3小鼠IgG单抗、13-Actin山羊
IgG多抗购自SantaCruz公司，使用时用TBS(10
mmol／LTris—HCi，150mmol／LNaCl，0．05％聚
山梨酯一20，pH8．0)按1：200～1：2000稀释；
辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、辣根过氧化
物酶标记马抗山羊IgG购自北京中山公司，使用时
用TBS按1：40001：1000稀释；RT—PCR试
剂盒购自Qiagene公司；100bpDNAMarker购自
华美生物工程公司。
1．3方法
1．3．1MTT法测定5F作用24h对HO一8910PM
细胞增殖的影响：选取对数生长期HO一8910PM细
胞，经胰酶消化、台盼蓝染色后在血球计数板上计
数，确保活细胞在97％以上。调整细胞为每孔
8000个(100弘L／孔)，加到96孔培养板中。将培养
板放入37℃、5％CO。孵箱中培养。待细胞贴壁后
取出培养板，加入不同浓度5F1弘L，使其终浓度分
别为6．25、12．5、25、50、100、200tlmol／L，每个浓度
设3个平行孔；同时设置空白对照组、溶剂对照组
和调零孔。培养板放回孵箱继续培养24h，取出培
养板，每孔加入MTT50／．tg(10肛L)，孵育4h。吸
出上清液，加入200弘LDMSO。在平板摇床振摇10
min使甲躜完全溶解。用酶标仪测570nm波长处
每孔的吸光度(A)值。计算细胞增殖抑制率。
细胞增殖抑制率一(A空白一A培药)／A空自×100％
1．3．2Westernblot分析NF—KB(P65)及Smad3
蛋白表达：取对数生长期HO一8910PM细胞，稀释成
1×106／mL，接种于直径50mm的培养皿中培养，
每皿5mL。待细胞贴壁后，分别用PBS、0．1％DM—
SO和25、50、100umol／L5F处理HO一8910PM细
胞24h，收集细胞，PBS洗涤2次，加入预冷的细胞
裂解液100弘L，用细胞刮将细胞刮下，并转移至预
冷的1．5mL离心管中，置于碎冰上冰育20min
后，于4℃、12000×g离心15min。上清液转移至
另一1．5mL离心管中，参照考马斯亮蓝微盘比色
法[43测定蛋白质。蛋白样品和4×上样缓冲液按
3：1混合，100℃水中煮沸5min使蛋白质变性。
SDS—PAGE电泳后电转移至PVPF膜上，5％脱脂
牛奶封闭后加入第1抗体于室温孵育12h，用TBS
缓冲液洗涤3次，每次‘10min，加入第2抗体于室
温孵育2h，再用TBS缓冲液洗涤3次，每次10
min，加入发光试剂(ECL)显色。实验中曝光3张
X片，以pActin作内参，用图像分析软件Scion
Image进行吸光度值分析。
1．3．3 半定量RT—PCR检测NF一．cB(P65)及
ETS一1mRNA的表达：总RNA的提取：分别收集
以PBS、0．1％DMSO和25、50、100pmol／L5F处
理24h的HO一8910PM细胞，按Trizol试剂盒说
明提取总RNA。引物设计与合成：NF—KB(P65)引
物设计参照文献[5]，引物序列为：同义引物5，_
TCAATGGCTACACAGGACCA一37，反义引物：5’一
CACTGTCACCTGGAAGCAGA一3’，扩增产物长度
为307bp。ETS～l引物设计参照文献[6]，引物序列
为：同义引物：5’一GTTAATGGAGTCAACCCAGC-
37，反义引物：5，-GGGTAGCGACTTCTTGTTTG一
3’，扩增产物长度为274bp。以GADPH为内参照，
引物序列为：同义引物：5r_ACCACAGTCCAT—
GCCATCAC一37，反义引物：57一TCCACCACCCT—
GTTGCTGTA一3’，扩增产物长度为452bp。引物均
委托上海生工生物工程公司合成。NF—KB(P65)扩
增条件：50℃逆转录30min，95℃预变性15min，
循环35次(94℃、30S，53℃、1min，72℃、1
min)，再于72℃充分延伸10min；ETS一1扩增条
件：50℃逆转录30min，95℃预变性15min，循环
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月·547·
35次(94℃、30S，5 ℃、1min，72℃、1min)，再于
72℃充分延伸10min。取5弘LPCR产物加1弘L
6×上样缓冲液混匀，1．8％琼脂糖凝胶(含0．5肛g／
mL溴化乙锭)在100V恒压电泳约40min，紫外透
射仪观察结果并拍照。相片经扫描仪扫描后，用图像
分析软件ScionImage进行吸光度值分析，算出NF—
KB(P65)、ETS一1分别与内参照GADPH的吸光度
值之比作为NF—KB(P65)、ETS一1的相对水平。
1．3．4 统计处理：采用SPSSll．0统计软件包
One—WayANOVA与Bon—ferroni(方差齐)或
Tamhane7sT2(方差不齐)检验进行统计学处理。
2结果
2．1 5F对HO一8910PM细胞增殖的影响：结果表
明，5F能抑制Ho一8910PM细胞的增殖，抑制率随
浓度的增加而增加，具有剂量效应关系，见表1。
表1 5F对HO一8910PM细胞增殖的影响(；土s，辟一3)
Table1 Effectof5Fonproliferationof
HO一8910PMcells(；±s，矗一3)
与溶剂对照组比较：一P
(P65)及Smad3蛋白表达的影响：结果发现，50、
100t-tmol／L5F能够抑制细胞NF—KB(P65)的表
达，与溶剂对照组相比差异具有非常显著意义(P<
0．01)；25、50、100txmol／L5F也明显抑制Smad3
蛋白的表达，与溶剂对照组相比差异也具有非常显
著意义(P
(P65)及ETS一1mRNA表达的影响：结果显示，5F
处理HO一8910PM细胞24h后，与内参照GADPH
比较，5F使NF—KB(P65)mRNA表达明显减少，见
表2；5F使ETS一1mRNA的表达轻微减少，见表3。
3讨论
NF—KB是一类几乎存在于所有细胞内，能与多
种基因的启动子或增强子NF—KB结合位点发生特
异性结合并启动基因转录的一组转录调节因子。
NF—KB是由亚单位P50和P65组成的异源二聚体，
1．O
O．8
囊o．6
靛
罂0．4
O．2
O．0
对照溶剂对照5F25F505F100
与溶剂对照组比较：一P
Smad3蛋白表达水平变化的图像分析(；士s，开一3)
Fig．1ImageanalysisofNF-gB(P65)andSmad3protein
changesafterxpressionofH 一8910PMcells
intreatment稍th5Ffor24 (-is，拜一3)
表2 NF一鼻B(P65)PCR产物的吸光度分析Q士s，露一3)
Table2 AbsorbanceanalysisofNF-gB(P65)
PCRproduct(工士s，一一3)
组别 浓度／(pm0卜L-t)NF-出(P65)GADPHNF-KB(P65)／GADPH
与溶剂对照组比较：。。P<0．01
。。P<0．01175solventcontrolgroup
表3 ETS一1PCR产物的吸光度分析(；士s，n一3)
Table3 AbsorbanceanalysisofETS-1
PCRproduct@士s，聘一3)
组别 浓度／(pm0卜L-1)ETS-1 GADPHETS-1／GADPH
与撂剂对照组比较：’’P
P50与DNA直接结合，P65具有转录活性。静息状
态下，NF—KB和抑制性蛋白IKB—Q结合滞留于细胞
浆中，在一定刺激作用下IKB—a解离，NF—tcB释放进
入细胞核激活靶基因。近年研究发现多种致癌因素
通过激活NF—xB，促进细胞生长，使细胞发生恶性
转化并促进肿瘤细胞的转移E7～10]。NF—KB还可以通
过上调与细胞生存、增殖相关的基因表达或诱导凋
亡抑制因子的过表达以及阻断凋亡途径中的某个信
号分子的表达而发挥抗凋亡作用。因此抑制NF—KB
的表达或活性，能促进肿瘤细胞的凋亡，抑制其生长
和转移，干预了肿瘤演变的整个过程。研究发现，5F
万方数据
·548· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第4期2005年4月
作用HO一8910PM细胞24h后，明显抑制NF—KB
P65亚基的表达，从而调控靶基因如VEGF、尿激酶
型纤溶酶原激活剂(urokinase—typeplasminogen
activator，uPA)和FAK的表达，降低Ho一
8910PM细胞的侵袭转移能力。Smad3是转化生长
因子一p(TGF一口)信号转导通路中的一个关键的信
号分子。研究表明，磷酸化激活Smad后，Smad3一
Smad4复合物与Smad结合元件(Smadbindingel—
ement，SBE)结合，启动相关靶基因的表达，从而影
响肿瘤的发生与发展。TGF一口通常会抑制细胞生
长，但是，有研究表明TGF—B在很多晚期实质性肿
瘤会过度表达，有利于肿瘤细胞逃离免疫监控，并促
进肿瘤新生血管生成。Lindemann[11]的研究表明，在
侵袭性乳腺癌MDA—MB一231细胞中，两种TGF一口
的抑制物SB一202190和SB一203580可明显延迟由
TGF—B诱导的Smad3在核中的堆积，并下调纤维
酶原激活物的抑制因子(plasminogenactivatorin—
hibitor，PAI)和uPA的表达，抑制MDA—MB一231
的侵袭能力。研究中首次发现，5F也能明显抑制
Smad3蛋白的表达，推测5F能降低TGF—p蛋白表
达水平，从而影响侵袭转移相关蛋白VEGF、uPA
的表达，抑制HO一8910PM细胞的侵袭转移能力。癌
基因ETS家族也在肿瘤发生发展中起着重要作用，
特别是其作为转录因子在肿瘤转移中的调控作用。
研究表明癌基因ETS影响蛋白水解酶的表达以及
肿瘤的血管生成。ETS一1是研究较多的ETS家族
成员，作为转录因子在细胞侵袭运动、血管生成、细
胞凋亡等中发挥重要作用[12’13]。5F作用Ho一
8910PM细胞使ETS一1mRNA的表达下降，从而
影响肿瘤细胞的侵袭转移能力。5F抗高转移卵巢癌
H0—8910PM细胞侵袭转移的作用机制与NF—xB、
Smad3和ETS一1这3个靶点密切相关。
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药根碱、小檗碱、黄连煎剂及模拟方对小鼠血糖的影响
付 燕1’2，胡本容1，汤强1，付琴1，张庆业1，向继洲1
(1．华中科技大学同济医学院药理学系，湖北武汉430030；2．广州市脑科医院，广东广州510000)
摘要：目的研究药根碱(Jat)的降血糖作用，并比较Jat、小檗碱(Ber)、黄连煎剂(HLD)及模拟方(Ber+Jat)
对小鼠血糖水平的影响。方法采用薄层扫描法测定HLD中Ber和Jat的质量分数，并根据其比值配制模拟方。
收稿日期：2004—07—19
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30171151)
作者简介：付燕(1979一)，女，湖北省黄石市人，药理学专业硕士，研究方向为心血管药理和神经药理学。
E—mail：Fuyan一1111@hotmail．com
万方数据
半边旗二萜类化合物5F对人高转移卵巢癌细胞系HO-8910PM
NF-κB(P65)、Smad3蛋白和NF-κB(P65)、ETS-1 mRNA表达的
影响
作者： 何太平， 陈杰， MO Li-Er， 梁念慈， HE Tai-Ping， CHEN Jie， MO Li-Er， LIANG
Nian-ci
作者单位： 广东医学院生物化学与分子生物学研究所,广东,湛江,524023
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(4)
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